抗菌肽及其制备方法和应用与流程

文档序号:11223256
抗菌肽及其制备方法和应用与流程
本发明涉及一种多肽,具体涉及一种抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术:
抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽物质。目前,在不同动物组织中已经发现多种具有抗菌作用的蛋白质和多肽,其是存在于生物体内的一类广谱抗菌活性多肽,也是先天免疫系统中重要的组成部分。这些抗菌肽具有抗菌能力强、抗菌谱广、种类多、可供选择范围广、靶菌株不易产生抗性突变等特点,同时鉴于许多微生物已对抗生素产生抗药性,因此抗菌肽有望成为新一代的临床抗菌药物,并且在化妆品、生物农药、动物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程等方面具有广阔的应用前景。蜜蜂肽(apidaecin,简称AP)是一类来源于膜翅目昆虫的富脯氨酸的多肽,最早从蜜蜂的淋巴液中分离得到,一般含有16~19个氨基酸残基,其对多种革兰氏阴性菌,特别是肠杆菌科,具有很强的伤杀作用,而对包括乳酸乳球菌在内的革兰氏阳性菌不起作用,并且对真核细胞没有毒性作用。由于蜜蜂肽在昆虫中的含量较少,人们日渐尝试在不同的表达系统中对蜜蜂肽进行表达。然而,抗菌肽在外源基因表达中存在基因表达量低、表达产物易降解、表达产物活性低、抗菌肽易对宿主菌产生毒害等问题。因此,期待一种稳定性好且抗菌活性高的抗菌肽。

技术实现要素:
本发明提供一种抗菌肽及其制备方法和应用,该抗菌肽的稳定性好,抗菌活性高。本发明提供一种抗菌肽,其氨基酸序列为:Tyr‐Ile‐Pro‐Gln‐Pro‐Arg‐Pro‐Pro‐His‐Pro‐Arg‐Leu(SEQIDNO:1)。本发明对具有上述氨基酸序列的抗菌肽的制备方法不作严格限制,可以通过化学合成得到,也可以通过对含有上述抗菌肽表达载体的菌株进行发酵得到;本领域技术人员可以根据上述抗菌肽的氨基酸序列容易地构建得到上述抗菌肽表达载体,进而得到含有上述抗菌肽表达载体的菌株并对其进行发酵。本发明还提供一种抗菌肽的制备方法,包括:对含有上述抗菌肽的发酵液进行阳离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析,得到所述抗菌肽。本发明对上述发酵液的制备方法不作严格限制,只要能够通过发酵得到上述抗菌肽即可。在一实施方式中,所述发酵液的制备方法可以包括:对含有所述抗菌肽表达载体的枯草芽孢杆菌进行发酵,得到所述发酵液。具体地,可以通过对公开号CN105671069A的中国发明专利中所公开的重组枯草芽孢杆菌进行改造,从而得到含有上述抗菌肽表达载体的菌株;对改造方式不作严格限制,可以采用紫外诱变等物理诱变方式、诱变剂诱变等化学诱变方式、定点突变等基因工程方式等。在本发明中,对阳离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析的顺序不作严格限制,优选为依次进行阳离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析。本发明通过由阳离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析三种层析组成的层析系统,分别去除发酵液中与目的抗菌肽具有电荷差异、疏水差异、大小差异的杂蛋白等其他物质,从而达到纯化的效果;经纯化后的抗菌肽通过结合HPLC-MS,从而能够获得进一步纯化的抗菌肽纯品及其结构信息。上述方法通过利用抗菌肽的特点和不同层板方法之间的特性差异,不仅科学合理地对抗菌肽进行了分离纯化,还为抗菌肽的检测提供了依据。其中,阳离子交换层析是利用离子交换剂(即交换介质)上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同,即利用离子交换剂的荷电基团,吸附发酵液中相反电荷的离子或离子化合物,被吸附的物质随后被带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱,由于各种不同的离子或离子化合物对离子交换剂的结合力不同,因而洗脱的速率不同从而形成了层析层。由于离子交换是可逆的,其能以极快的速率达到平衡,因此离子交换层析具有灵敏度高、重复性、选择性好,分析速度快等优点。在本发明的具体方案中,所述阳离子交换层析的交换介质为CaptoS;该交换介质是建立在新颖的高流速琼脂基质平台上的层析介质,其结合了高机械性、高动态载量和快速传质的性质,能够快速纯化,满足灵活工艺设计和最大限度的成本效益要求。相比不具葡聚糖修饰骨架的介质,该交换介质的结合载量大幅度提高。本发明对阳离子交换层析的具体分离条件不作严格限制,可以为本领域的常规分离条件。具体地,平衡液可以为pH值为5‐6的磷酸盐缓冲溶液;此外,可以采用0.03‐0.12mol/L、pH值为5‐6的磷酸盐缓冲溶液作为洗脱液进行洗脱。在本发明中,疏水层析是利用多肽/蛋白质的疏水基团与亲水基团进行分离,多肽/蛋白质的表面通常具有疏水性基团,其与带有疏水性的...
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