抗菌肽及其制备方法和应用与流程

文档序号:11223256
本发明涉及一种多肽,具体涉及一种抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
::抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽物质。目前,在不同动物组织中已经发现多种具有抗菌作用的蛋白质和多肽,其是存在于生物体内的一类广谱抗菌活性多肽,也是先天免疫系统中重要的组成部分。这些抗菌肽具有抗菌能力强、抗菌谱广、种类多、可供选择范围广、靶菌株不易产生抗性突变等特点,同时鉴于许多微生物已对抗生素产生抗药性,因此抗菌肽有望成为新一代的临床抗菌药物,并且在化妆品、生物农药、动物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程等方面具有广阔的应用前景。蜜蜂肽(apidaecin,简称AP)是一类来源于膜翅目昆虫的富脯氨酸的多肽,最早从蜜蜂的淋巴液中分离得到,一般含有16~19个氨基酸残基,其对多种革兰氏阴性菌,特别是肠杆菌科,具有很强的伤杀作用,而对包括乳酸乳球菌在内的革兰氏阳性菌不起作用,并且对真核细胞没有毒性作用。由于蜜蜂肽在昆虫中的含量较少,人们日渐尝试在不同的表达系统中对蜜蜂肽进行表达。然而,抗菌肽在外源基因表达中存在基因表达量低、表达产物易降解、表达产物活性低、抗菌肽易对宿主菌产生毒害等问题。因此,期待一种稳定性好且抗菌活性高的抗菌肽。技术实现要素:本发明提供一种抗菌肽及其制备方法和应用,该抗菌肽的稳定性好,抗菌活性高。本发明提供一种抗菌肽,其氨基酸序列为:Tyr‐Ile‐Pro‐Gln‐Pro‐Arg‐Pro‐Pro‐His‐Pro‐Arg‐Leu(SEQIDNO:1)。本发明对具有上述氨基酸序列的抗菌肽的制备方法不作严格限制,可以通过化学合成得到,也可以通过对含有上述抗菌肽表达载体的菌株进行发酵得到;本领域技术人员可以根据上述抗菌肽的氨基酸序列容易地构建得到上述抗菌肽表达载体,进而得到含有上述抗菌肽表达载体的菌株并对其进行发酵。本发明还提供一种抗菌肽的制备方法,包括:对含有上述抗菌肽的发酵液进行阳离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析,得到所述抗菌肽。本发明对上述发酵液的制备方法不作严格限制,只要能够通过发酵得到上述抗菌肽即可。在一实施方式中,所述发酵液的制备方法可以包括:对含有所述抗菌肽表达载体的枯草芽孢杆菌进行发酵,得到所述发酵液。具体地,可以通过对公开号CN105671069A的中国发明专利中所公开的重组枯草芽孢杆菌进行改造,从而得到含有上述抗菌肽表达载体的菌株;对改造方式不作严格限制,可以采用紫外诱变等物理诱变方式、诱变剂诱变等化学诱变方式、定点突变等基因工程方式等。在本发明中,对阳离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析的顺序不作严格限制,优选为依次进行阳离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析。本发明通过由阳离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析三种层析组成的层析系统,分别去除发酵液中与目的抗菌肽具有电荷差异、疏水差异、大小差异的杂蛋白等其他物质,从而达到纯化的效果;经纯化后的抗菌肽通过结合HPLC-MS,从而能够获得进一步纯化的抗菌肽纯品及其结构信息。上述方法通过利用抗菌肽的特点和不同层板方法之间的特性差异,不仅科学合理地对抗菌肽进行了分离纯化,还为抗菌肽的检测提供了依据。其中,阳离子交换层析是利用离子交换剂(即交换介质)上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同,即利用离子交换剂的荷电基团,吸附发酵液中相反电荷的离子或离子化合物,被吸附的物质随后被带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱,由于各种不同的离子或离子化合物对离子交换剂的结合力不同,因而洗脱的速率不同从而形成了层析层。由于离子交换是可逆的,其能以极快的速率达到平衡,因此离子交换层析具有灵敏度高、重复性、选择性好,分析速度快等优点。在本发明的具体方案中,所述阳离子交换层析的交换介质为CaptoS;该交换介质是建立在新颖的高流速琼脂基质平台上的层析介质,其结合了高机械性、高动态载量和快速传质的性质,能够快速纯化,满足灵活工艺设计和最大限度的成本效益要求。相比不具葡聚糖修饰骨架的介质,该交换介质的结合载量大幅度提高。本发明对阳离子交换层析的具体分离条件不作严格限制,可以为本领域的常规分离条件。具体地,平衡液可以为pH值为5‐6的磷酸盐缓冲溶液;此外,可以采用0.03‐0.12mol/L、pH值为5‐6的磷酸盐缓冲溶液作为洗脱液进行洗脱。在本发明中,疏水层析是利用多肽/蛋白质的疏水基团与亲水基团进行分离,多肽/蛋白质的表面通常具有疏水性基团,其与带有疏水性的载体在高盐浓度时会结合;一般而言,离子强度(盐浓度)越高,结合所形成的疏水键越强。在本发明的具体方案中,所述疏水层析的疏水介质为苯基‐琼脂糖凝胶,其能够较好地分离目标抗菌肽。本发明对疏水层析的具体分离条件不作严格限制,可以为本领域的常规分离条件。具体地,平衡液可以为pH值5‐6、浓度0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液;此外,可以采用0.02‐0.05mol/L、pH值为5‐6的磷酸盐缓冲溶液作为洗脱液进行梯度洗脱。优选地,采用减少盐浓度的方式进行洗脱,例如依次采用0.05mol/L、0.04mol/L、0.03mol/L、0.02mol/L、0.01mol/L的pH值为5‐6的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱。在洗脱时,将洗脱液的盐浓度逐渐降低,能够使疏水性不同的物质逐个地先后被洗脱出来,从而使目的抗菌肽与其它亲水性蛋白等物质分离。特别是,在阳离子交换层析后进行疏水层析,能够使两种层析互补,因此,有利于分离阳离子交换层析中很难或不能分离的物质。在本发明中,尺寸排阻层析是基于分子的大小不同进行分离,其是一种非吸附形式的层析方法,因此缓冲液的成分不会直接影响分离结果,目的抗菌肽可以在广泛的pH值及离子强度下进行物质的分离。尺寸排阻层析提供了灵活合适的层析条件的选择,满足进一步纯化的需求。在本发明的具体方案中,所述尺寸排阻层析的填料为葡聚糖凝胶G‐100。本发明对尺寸排阻层析的具体分离条件不作严格限制,可以为本领域的常规分离条件。具体地,可以采用0.02‐0.08mol/L、pH值为5‐6的磷酸盐缓冲溶液作为平衡液和洗脱液。本发明还提供一种抗菌方法,采用上述抗菌肽进行。上述抗菌肽对多种革兰氏阴性菌,特别是肠杆菌科,具有很强的伤杀作用,不仅抗菌活性强,此外稳定性好,有利于实际推广应用。附图说明图1为本发明实施例1制备的抗菌肽的HPLC色谱图;图2为本发明实施例1制备的抗菌肽的质谱图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明的附图和实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。各实施例采用的原料:重组枯草芽孢杆菌菌株:按照公开号CN105671069A的中国发明专利所公开的方法制备得到;交换介质:CaptoS,购自通用电气医疗集团(GEHealthcare);疏水介质:苯基‐琼脂糖凝胶,购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio);尺寸排阻层析填料:葡聚糖凝胶G‐100,购自上海玉博生物科技有限公司(Pharmacia);抗菌肽(SEQIDNO:1):采用ABI433A全自动多肽合成仪合成得到。实施例1一、菌株改造采用常规方法对重组枯草芽孢杆菌菌株进行紫外诱变,筛选抑菌圈较大的菌株(以下称为突变菌株),备用。将大量沙门氏菌与少量上述突变菌株进行混合培养,在突变菌株活菌数增多并稳定后,将少量菌悬液接种到沙门氏菌的纯培养物中,反复混合培养,突变菌株在沙门氏菌的攻毒培养的选择下,产生抗菌活性更强的枯草芽孢杆菌新菌株。对上述枯草芽孢杆菌新菌株进行遗传稳定性试验,得到遗传性稳定的枯草芽孢杆菌新菌株(以下称为改造菌株)。二、发酵将上述改造菌株接种到LB培养基中,于37℃、250r/min振荡培养22小时,10000r/min离心10min收集发酵液上清,备用。三、分离纯化对上述发酵液上清依次进行阳离子交换层析、疏水层析和尺寸排阻层析,具体步骤为:1、阳离子交换层析以CaptoS作为交换介质对上述发酵液上清进行阳离子交换层析,其中采用pH5.8的磷酸盐缓冲溶液平衡后,以2BV/h的速度上样,随后采用0.06mol/L、pH5.8的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱,每5min收集一次洗脱液并采用双层琼脂穿孔扩散法进行抑菌试验,收集具有抑菌圈的洗脱液。2、疏水层析以苯基‐琼脂糖凝胶作为疏水介质对上述收集的洗脱液进行疏水层析,其中采用0.2mol/L、pH5.8的磷酸盐缓冲溶液平衡后,以2BV/h的速度上样,随后依次采用0.05mol/L、0.04mol/L、0.03mol/L、0.02mol/L、0.01mol/L的pH5.8的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱,每5min收集一次洗脱液并进行抑菌试验,收集具有抑菌圈的洗脱液。3、尺寸排阻层析以葡聚糖凝胶G‐100作为填料对上述收集的洗脱液进行尺寸排阻层析,其中采用pH5.8的磷酸盐缓冲溶液平衡后,以2BV/h的速度上样,随后采用pH5.8的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱,每5min收集一次洗脱液并进行抑菌试验,收集具有抑菌圈的洗脱液,按常规方式超滤浓缩、干燥、冻干后,得到纯化的抗菌肽,密封保存。四、HPLC‐MS分析检测采用Agilent1260Infinity二元液相色谱系统(购自Agilent公司)对上述制备得到的抗菌肽进行分析检测,其中:色谱柱为AgilentZORBAX300StableBond(300SB)C8HPLC色谱柱(购自Agilent公司);流动相A:0.1%的三氟乙酸水溶液;流动相B:80%的乙腈水溶液;柱温:25℃,检测波长:280nm;最大压力:200bar;时间:65min;流速:0.700mL/min;上样量:20ug,分析梯度见表1,检测结果见图1。表1HPLC分析梯度时间/min03.0010.0040.0055.0057.0065.00A(%)95.095.091.083.070.095.095.0B(%)5.05.09.017.030.05.05.0质谱检测条件:鞘气体流量(arb):15;辅助气体流量(arb):5;热喷涂电压(kV):4.7;毛细管温度(℃):275;毛细管电压(V):49;套管透镜补偿电压(V):120;检测结果见图2。结果表明:上述制备的抗菌肽的氨基酸序列为:Tyr‐Ile‐Pro‐Gln‐Pro‐Arg‐Pro‐Pro‐His‐Pro‐Arg‐Leu(SEQIDNO:1)。实施例2本实施例以化学合成方法合成抗菌肽,其中采用ABI433A全自动多肽合成仪进行合成,抗菌肽的氨基酸序列为:Tyr‐Ile‐Pro‐Gln‐Pro‐Arg‐Pro‐Pro‐His‐Pro‐Arg‐Leu(SEQIDNO:1)。对照例1以按照公开号CN105671069A的中国发明专利所公开的方法制备得到的重组枯草芽孢杆菌菌株作为对照,参照实施例1方法对该重组枯草芽孢杆菌菌株进行发酵、分离纯化和HPLC‐MS分析检测。结果表明:上述重组枯草芽孢杆菌菌株发酵产生的抗菌肽为蜜蜂肽。试验例1抗菌试验采用标准琼脂孔穴扩散法分别对实施例1、实施例2和对照例1的抗菌肽进行抗菌试验。分别将实施例1、实施例2和对照例1的抗菌肽配制成相同浓度的抗菌肽溶液,以大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、粪肠球菌和粪链球菌为实验菌株,将各实验菌株培养液分别与55℃的LB固体培养基25mL混匀后平铺板待其凝固后,用灭过菌的打孔器(直径5mm)打孔,孔中分别滴加各抗菌肽溶液,在37℃培养12h,测定各抑菌圈直径(mm),同时以抑菌圈直径计算杀菌活力(X)和杀菌效价(U/mL),计算公式如下:杀菌活力(X)=(抑菌圈直径-2.3mm)/2杀菌效价(U/mL)=2X×1000观察抑菌圈大小,结果见表2。表2各抗菌肽的抗菌活性由表1结果可知:本发明的抗菌肽的抗菌活性显著高于蜜蜂肽。试验2稳定性试验分别将实施例1、实施例2和对照例1的抗菌肽在室温(28‐32℃)下连续保存6个月,定期(每月)按照试验例1方法进行抗菌试验,保存6个月后的抗菌结果见表3。表3各抗菌肽的稳定性表3中,“/”代表未检出。稳定性试验结果表明:常规的蜜蜂肽在室温下保存1个月后基本不具有抗菌活性,而本发明的抗菌肽在室温下连续保存6个月后,抗菌活性仅下降10%左右,说明本发明的抗菌肽具有良好的稳定性。最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。<110>甘肃奥林贝尔生物科技集团有限公司<120>抗菌肽及其制备方法和应用<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>12<212>PRT<213>人工序列<400>1TyrIleProGlnProArgProProHisProArgLeu1510当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3 
再多了解一些
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