一种类Bac5抗菌肽及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类bac5抗菌肽及其应用。

背景技术：

抗生素的发现曾给人类带来巨大的福利。然而，随着抗生素的大量使用和滥用，细菌耐药性不断产生，兽药残留危害事件不断发生，严重危害了人类健康和畜牧业发展。寻找新的抗菌药物变得更为迫切。在寻找过程中，人们逐渐将目光聚焦于抗菌肽。抗菌肽(antimicrobialpeptides，amps)是生物机体先天免疫系统的重要组成部分，由10-60个氨基酸残基构成，具有抗细菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、免疫调节等生物活性，因其分子量小、热稳定性好，水溶性好、抗菌谱广、不易形成耐药性等特性而备受人们关注，被认为是抗生素的最佳替代品。

目前，抗菌肽的研究与应用已经成为生物技术领域中的热点，许多抗菌肽已经被开发成临床药物。抗菌肽bac5于1989年从牛中性粒细胞中分离得到，是由43个氨基酸组成的富含精氨酸和脯氨酸的抗菌肽，具有广谱抗菌活性。然而，大部分的天然抗菌肽抑菌活性并不高，且在发挥抑菌效果的同时往往对正常的真核细胞也产生毒性，以及溶血作用，而且天然抗菌肽的产量低，这都限制了抗菌肽的发展应用。根据抗菌肽的构效关系及作用机制，以优良抗菌肽为模板，进行已有抗菌肽的人工改造与设计是抗菌肽开发的一个重要方向。与天然抗菌肽相比，人工设计抗菌肽具有更好的靶细胞特异性和抗菌活性，甚至还具有低溶血性和对蛋白酶降解的低敏感性等特性。因此，本发明根据bac5设计了结构简单、化学合成容易、具有高抗菌活性的类bac5抗菌肽。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种类bac5抗菌肽及其应用。本发明的类bac5抗菌肽对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌、沙门菌)都有高效的抗菌活性，抗菌作用快，具有低溶血性，不产生耐药性。因此，本发明的类bac5抗菌肽在制备抗感染药物、畜牧业发展、人类疾病治疗方面具有广阔的应用前景。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种类bac5抗菌肽，其氨基酸序列如下：

苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸(seqidno.1)。

根据上述的类bac5抗菌肽，所述类bac5抗菌肽有37个氨基酸残基，其分子量为4480.51da，等电点为12.6。

本发明所述的类bac5抗菌肽可用于制备治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染的药物。所述药物包含上述类bac5抗菌肽，并混合有一种或一种以上医药上可接受的载体和/或添加剂。

本发明所述的类bac5抗菌肽还可用于制备饲料添加剂、消毒剂、防腐剂或化妆品添加剂。

本发明所述的类bac5抗菌肽采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相法合成，合成方向为从c端到n端，其合成的详细步骤为：

a、溶涨树脂：将fmoc-pro-wangresin树脂加入自动多肽合成仪反应器内，并加入二甲基甲酰胺dmf进行溶涨，1gfmoc-leu-wangresinin树脂加入dmf的量约为12ml(dmf应完全浸没树脂)，溶涨时间为10～30min，溶涨可重复1～2次；

b、脱保护：树脂溶涨后，将储罐内20％哌啶(20％哌啶是将哌啶溶于二甲基甲酰胺dmf中配制而成的)加入到反应器内，浸没树脂(1gfmoc-pro-wangresinin树脂需要加入20％哌啶约为10ml)，使溶涨后的树脂脱保护，时间约为30min，然后加入二甲基甲酰胺dmf进行洗涤；

c、缩合反应：接着按照类bac5抗菌肽氨基酸序列的排序加入第二种氨基酸脯氨酸fmoc-pro，并加入缩合剂hctu(6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)和催化剂nmm(n-甲基吗啡啉)或diea(n,n二异丙基乙胺)进行缩合反应；反应结束后加入二甲基甲酰胺dmf进行反复洗涤，除去未反应的氨基酸；所述脯氨酸与fmoc-pro-wangresinin树脂的摩尔比为5:1；所述缩合剂hctu与脯氨酸fmoc-pro之间的摩尔比为1:1；所述催化剂nmm或diea与脯氨酸二者之间的摩尔比为4:1；

洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依照上述步骤c同样方法依次加入氨基酸fmoc-arg、fmoc-phe、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-phe、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-phe、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-tyr、fmoc-phe、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg、fmoc-arg、fmoc-ile、fmoc-pro、fmoc-pro、fmoc-arg和fmoc-phe进行缩合反应、洗涤，最后一个缩合反应、洗涤后，得到多肽产物；每次缩合反应、洗涤后所得产物均按照步骤b的方法进行脱保护、洗涤，然后加入下一个氨基酸进行缩合反应、洗涤(每次缩合反应中，所加入氨基酸与fmoc-pro-wangresinin树脂的摩尔比均为5:1；所述缩合剂hctu与每种所加氨基酸二者之间的摩尔比均为1:1；所述催化剂nmm或diea与每种所加氨基酸二者之间的摩尔比均为4:1)；

d、多肽产物的脱保护和裂解：在步骤c所得多肽产物中加入20％哌啶到反应器内，并浸没多肽产物(对1g树脂进行脱保护所用20％哌啶的量约为10ml)，使其对多肽产物进行脱保护；脱保护后，依次加入二甲基甲酰胺dmf、二氯甲烷dcm进行反复洗涤；洗涤后，加入三氟乙酸tfa进行裂解(对1g树脂进行裂解所用tfa的体积约为20ml)，使多肽从树脂上裂解下来；对裂解后的产物进行过滤(用砂心漏斗进行过滤)，得到滤液；

e、沉淀合成多肽：用冷乙醚对所得滤液进行洗涤、离心，以沉淀合成多肽，其过程为：在步骤d得到的滤液中加入其3倍体积的冷乙醚(预先保存于4℃)，密封后颠倒混匀，冰浴10min，在4000r/m下离心10min，弃上清液体，回收沉淀；用冷乙醚重悬沉淀，重复上述步骤三次，之后将所得沉淀干燥12～16h，得到合成肽粗品；

f、合成肽粗品的纯化：采用半制备型高效液相色谱仪p2000对合成肽粗品进行过柱纯化，收集纯度≥95％的馏分，即得到纯化后的类bac5抗菌肽，其纯度≥95％。

半制备型高效液相色谱仪为p2000是由北京沃华创新科技有限公司提供，色谱柱为c18反相柱(4.6*250mm)，流动相a为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml乙腈溶液中)，流动相b为0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml去离子水中)，使用上述处理柱，上样后25min内，流动相a的比例由27％逐步调至52％，流动相b的比例由73％逐步调至48％，25.1min时，流动相a的比例变为100％，流动相b的比例变为0％，以1ml/min的流速进行30min的分离，检测波长为220nm，收集纯度≥95％的馏分(如附图1所示)；

本发明所得类bac5抗菌肽的确认鉴定：采用液相色谱质谱联用仪(watersmicromasszq-2000)测定所得产品抗菌肽的分子量，经测定：其分子量为4480.51da(如附图2所示)。高效液相色谱条件：色谱柱为c18反相柱(4.6*250mm)，流动相a为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml乙腈溶液中)，流动相b为0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml去离子水中)，上样后25min内，流动相a的比例由25％逐步调至50％，流动相b的比例由75％逐步调至50％，25.1min时，流动相a的比例变为100％，流动相b的比例变为0％，以1ml/min的流速进行30min的分离，检测波长为220nm。质谱测定条件：采用正离子化模式，其毛细管电压为3.00kv，毛细管出口电压50v，碎裂电压为5v，干燥气流量为1.5l/min，干燥气温度为350℃，扫描范围为400～1900m/z。

本发明具有的积极有益效果：

本发明的类bac5抗菌肽由37个氨基酸组成，富含精氨酸，对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌、沙门菌)和真菌都有高效的抗菌活性，抗菌作用快，抗菌活性强，具有低溶血性，不产生耐药性。因此，本发明的类bac5抗菌肽在制备抗感染药物、畜牧业发展、人类疾病治疗方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明类bac5抗菌肽的高效液相色谱图。

图2为本发明类bac5抗菌肽的质谱图。

图3为类bac5抗菌肽的等电点分析结果。

图4为类bac5抗菌肽对大肠杆菌最小抑菌浓度测定结果。

图5为类bac5抗菌肽对沙门菌最小抑菌浓度测定结果。

图6为类bac5抗菌肽对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度测定结果。

图7为类bac5抗菌肽的溶血率测定结果。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明作进一步详细的说明，但并不限制本发明的范围。

实施例1：

一种类bac5抗菌肽，其氨基酸序列如下：

苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸。

该类bac5抗菌肽含有37个氨基酸残基，其分子量为4480.51da，等电点为12.6。所述类bac5抗菌肽富含精氨酸残基(带正电荷)，可吸引细菌表面的负电荷。

本实施例类bac5抗菌肽是采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相法合成，最终合成类bac5抗菌肽经半制备型高效液相色谱仪进行纯化分析处理，其纯度≥95％。

本发明所得类bac5抗菌肽产品的鉴定：

(1)分子量的测定：采用分析型液相色谱质谱联用仪(watersmicromasszq-2000)测定所得类bac5抗菌肽的分子量，经测定，其分子量为4480.51da，结果如附图2所示。

具体的检测条件为：①色谱条件为：色谱柱为c18反相柱(4.6*250mm)，流动相a为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml乙腈溶液中)，流动相b为0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1ml三氟乙酸溶于100ml去离子水中)，上样后25min内，流动相a的比例由25％逐步调至50％，流动相b的比例由75％逐步调至50％，25.1min时，流动相a的比例变为100％，流动相b的比例变为0％，以1ml/min的流速进行30min的分离，检测波长为220nm。②质谱测定条件：采用正离子化模式，其毛细管电压为3.00kv，毛细管出口电压50v，碎裂电压为5v，干燥气流量为1.5l/min，干燥气温度为350℃，扫描范围为400～1900m/z。

(2)氨基酸序列结构测定：采用自动氨基酸测序仪测定类bac5抗菌肽的氨基酸序列结构。经测定，类bac5抗菌肽含有37个氨基酸残基，其氨基酸序列为：苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸。

(3)等电点分析：

打开dnastar软件中的editseq，打开file，点击“new”中的“newprotein”，输入类bac5抗菌肽的氨基酸序列，另存为pro格式的文档。然后再打开dnastar软件中的protean，打开file，点击“open”，选择刚保存为pro格式的文档，点击“打开”，选择“analysis”中的“titrationcurve”，即可以获得等电点数据，结果见图3。经测定，本发明类bac5抗菌肽的等电点分别为12.6。

实施例2：本发明类bac5抗菌肽的应用实施

1、类bac5抗菌肽的抑菌活性分析

采用琼脂平板扩散法测定类bac5抗菌肽的抑菌活性，其受试微生物菌株为：大肠杆菌atcc8099、沙门菌cvcc541、金黄色葡萄球菌atcc6538，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌购自南京便诊生物科技有限公司，沙门菌购置中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

将上述3种受试微生物分别稀释于50℃的底层培养基(tsb0.3g，超纯的琼脂糖0.1g，加超纯水至10ml，ph7.4)中，倒灭菌平板，凝固，用打孔器打孔(孔径约3mm)，酒精灯稍加热进行封底，用移液器向每孔中加入5μl抗菌肽样品，每个平板包括阳性对照和阴性对照。阳性对照：氨苄青霉素针对革兰阴性菌和革兰阳性菌；阴性对照：pbs缓冲液。将平板静置1h，使测试液扩散入琼脂糖中。然后，再添加上层覆盖培养基(tsb0.3g，超纯的琼脂糖0.1g，加超纯水至10ml，ph7.4，50℃左右)。将培养平板在37℃倒置培养过夜，然后记录孔周边的透明圈的直径，每个菌种重复测定三次，计算平均值。

表1类bac5抗菌肽的抑菌活性分析结果

由表1抗菌活性检测结果显示，本发明的类bac5抗菌肽对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抗菌活性。因此，本发明的类bac5抗菌肽可望在制备治疗动物和人细菌性疾病的药物方面有着很好的应用前景，同时，根据已知抗菌肽的一般特性，类bac5抗菌肽在饲料添加剂、消毒剂、防腐剂或化妆品添加剂等方面有良好的应用潜能。

2、类bac5抗菌肽的最小抑菌浓度(mic)测定

受试微生物菌株为：大肠杆菌atcc8099、沙门菌cvcc541、金黄色葡萄球菌atcc6538，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌购自南京便诊生物科技有限公司，沙门菌购置中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

将受试菌株在tsb液体培养基中扩大培养，测菌液的od600值。当od值在0.6-0.8时，将菌液在6000r/min条件下离心10min，弃去上清，收集菌体沉淀，将菌体沉淀用等体积的pbs缓冲液(0.01m)重悬，再用mh培养基将细菌悬液稀释到2×10⁶cfu/ml。用去离子水稀释类bac5抗菌肽样品，使其浓度为0.78-100μg/ml。在96孔细胞培养板中，每孔分别添加50μl不同浓度的类bac5抗菌肽和50μl稀释的细菌溶液，每个浓度重复三孔，置于37℃培养16-18h，然后混匀每孔中的溶液，测定其od600值，以od值突然变化对应的类bac5抗菌肽浓度为其mic，结果见图4、图5和图6。

由图4、图5和图6可知，类bac5抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度(mic)为6.25μg/ml，对沙门菌的最小抑菌浓度(mic)为6.25μg/ml，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(mic)为12.5μg/ml。结果表明，该类bac5抗菌肽对常见的细菌的最小抑菌浓度均达到微克级，具有极强的抑菌活力。

3、类bac5抗菌肽的溶血性分析

取新鲜兔血液，用3.8％柠檬酸钠抗凝，将抗凝血经3000r/min离心10min，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤沉淀3次，至上清为无色、透明，再用pbs配制1％红细胞。用pbs将类bac5抗菌肽的浓度调整为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0.39μg/ml，加入等体积的红细胞悬液。以pbs为阴性对照，以1％tritonx-100为阳性对照，37℃作用1h，1500r/min离心10min，将上清液依次加入96孔板，用酶标仪测540nm处的od值。然后根据计算公式溶血率(％)＝(检测孔od值-阴性孔od值)/(阳性孔od值-阴性孔od值)×100％计算溶血率，其结果见图7。

由图7可知，在400μg/ml的高浓度条件下，类bac5抗菌肽的溶血率为4.29％，仍低于5％，说明类bac5抗菌肽有较好的安全性，临床应用前景巨大。

综上所述，本发明类bac5抗菌肽产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌都具有高效的抗菌作用。所以，本发明产品类bac5抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的药物中能够得到较佳的应用，而且，还可用于制备饲料添加剂、消毒剂、防腐剂或化妆品添加剂。

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<120>一种类bac5抗菌肽及其应用

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