本发明涉及植物组培快繁领域，具体地涉及一种牛樟的组培快繁方法。
背景技术：
牛樟(Cinnamomum kanehirae Hayata)为台湾地区本土特有阔叶树种，因为树形粗状坚实，所以被称为牛樟。牛樟原本在台湾地区分布甚为广泛，自海拔200m到2000m都有其自然分布，但是由于过去大量的采伐，现存只有在高山地区还有零星的分布。牛樟树干通直，树体高耸木材富含松油醇，不易腐朽或虫蛀，材质细致，理纹交错，且刨削加工容易，为高价值的家俱及木刻艺品用材，非常具有发展潜力；牛樟椴木可用于栽培牛樟芝，牛樟椴木栽培的樟芝，无论外观、香气、苦味与成分组成等能完全取代野生樟芝。有祛风行气、化淤活血、温中消结、解毒消肿、镇静止痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、提升机体免疫力之效；对于治疗胃肠疼痛、腹泻呕吐、食物中毒、毒蕈中毒、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、肝硬化、肝癌等更是有独特功能。由于樟芝在台湾地区被视为独特而珍贵的药用真菌，因此具有极高的研究和商业价值，也是目前台湾地区最昂贵的野生真菌，在港澳被称为“神芝”，台湾地区民间称之为“森林中的红宝石”。因此牛樟被大量用来作为栽培牛樟芝的椴木，使得天然牛樟遭到过量的采伐。由于牛樟的花属黏质虫媒花，母树间受粉困难，又多开于树冠顶端，易遭风害,偶有种子亦未成熟前即遭鸟、兽食害，因此采种极为困难。在自然状态下，也很少有天然更新丛生，偶有天然下种，也因林下亮度不足、种子又因枯枝落叶过厚而不易着床发芽等原因，多致失败，我们很难在林下找到牛樟小苗的原因便在于此。如果不进行人工培育繁殖，这个树种必将慢慢的消失。而采用植物组织培养的方法可以在短期内繁殖大量规格统一、种性稳定的牛樟种苗，因此，研究牛樟组织培养快速繁殖技术有着十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种牛樟的组培快繁方法。
本发明提供的技术方案如下：
一种牛樟组培快繁方法，包括如下步骤：
1)组培
a/外植体的灭菌：从牛樟上采芽进行无菌外植体的建立和诱导：将预处理好的牛樟茎段先用75％酒精浸泡60s,再用无菌水冲洗2次，然后再用0.l％HgCl2溶液浸泡15min-18min；
b/外植体的启动培养
启动培养基：ML+BA2.0+NAA0.5；
c/不定芽的增殖培养
继代增殖培养基6-BA1.5+NAAO.4；
d/不定根的诱导培养
将增殖培养30d后高3.0cm以上叶片正常展开的芽苗，通过无菌操作切取2.5cm左右的顶芽，接种于培养基1/2ML+IBA1.0+NAAO.1；
e/组培苗的移栽
生根培养25d的生根瓶苗及时移到高温高光强的炼苗区炼苗7-10d，炼苗区温度在30-35℃，光照在3000-500OLx，再洗去根部的培养基，放入2g·L-1浓度的多菌灵溶液中浸泡10min，然后用自来水冲洗干净，移栽至经过1g·L-1的高锰酸钾溶液消毒的基质中，移栽后浇透水，覆盖薄膜保湿并遮萌70-80％，7d后，每5d喷1次500倍的多菌灵或代森锰锌药液，每天打开薄膜通风5min，以防病害，保持相对湿度90％以上，15d(冬季可适当延长至25d)后可逐渐揭开薄膜。同时注意遮荫，移栽30d后检查，各种基质的小苗移栽成活率见表8。基质为是红土70％+河砂30％，
在本发明中，牛樟外植体的选取时机和选取的部位是十分关键的，应在连续晴天3天以上，萌芽条上无露水时进行采芽，采集的萌芽条应为伐桩基部无病虫害、健康正常的萌芽条，这对试验的成功十分关键。
在本发明的较佳实施例中，预处理为选取当年生幼嫩枝条带腋芽茎段，除去叶片，保留1-2cm长的叶柄，并将茎段切成4-6cm长，先用自来水冲洗30min后，再用洗衣粉水浸30min，再用无菌水冲洗2次，然后放在超净工作台上备用。
在本发明的较佳实施例中，外植体表面灭菌时用0.l％HgCl2溶液浸泡15min-18min。
本发明通过试验，得出牛樟增殖培养的最佳培养基和诱导不定根的培养基，使得其增殖率达到3.3倍，生根率达94％。然后通过组培快繁技术，短期内生产大量出规格统一、种性稳定的牛樟种苗，从而解决由于牛樟母树单株授粉困难，结实少，且种子有休眠性，自然繁殖有限的问题。
具体实施方式
实施例1
1材料和方法
1.1试验材料
选取当年生幼嫩枝条带腋芽茎段，除去叶片，保留1-2cm长的叶柄，并将茎段切成4-6cm长，先用自来水冲洗30min后，再用洗衣粉水浸30min，再用无菌水冲洗2次，然后放在超净工作台上备用。
l.2试验方法
1.2.1外植体表面灭菌时间的确定
将预处理好的牛樟茎段先用75％酒精浸泡60s,再用无菌水冲洗2次，然后再用0.l％HgCl2溶液分别浸泡12min、15min、18min、20min、25min等5种处理的表面灭菌时间试验，表面灭菌后再用无菌水冲洗4-5次，两端及叶柄各切去1cm左右，然后切成lcm左右长度的茎段，每段带1-2个腋芽,接种于备用培养基上,每瓶接一个芽，每个处理接种100瓶。
1.2.2基本培养基和启动培养基的选择
采用MS、B5、White、改良的MS(以下作者自命名为ML，即在MS的基础上另加Vc2mg·L-1、生物素0.24mg·L-1、L-半胱氨酸5mg·L-1)，分别外加6-BA2mg·L-1(单位下同)、NAA0.5，在相同的培养条件下进行试验，每组重复3次,每个处理20瓶,每瓶1个芽。
l.2.3增殖和生根培养基的选择
增殖培养基为选取的基本培养基附加6-BA 2、l.5、l.2、l四个浓度水平与NAA 0.8、0.6、0.4、0.2四个浓度水平的组合，用L16(45)正交表安排试验，每个处理10瓶，每瓶接入5个团块，重复3次。生根培养基为1/2选取的基本培养基(大量元素减半，其它不变)附加NAA0.1、0.2、0.3三个浓度水平与IBA 0.3、0.5、l.0三个浓度水平的组合，用L9(34)正交表安排试验，每一组合20瓶，每瓶接入10株。
1.2.4组培瓶苗移栽基质的选择
将生根培养25d的生根瓶苗及时移到高温高光强的炼苗区(炼苗区温度一般在30-35℃，光照在3000-5000Lx)炼苗7-10d，再洗去根部的培养基，放入0.2g·L-1浓度的多菌灵溶液中浸泡10min，然后用自来水冲洗干净，移栽至经过0.5g·L-1的高锰酸钾溶液消毒的各种基质(①纯红土②红土70％+椰糠30％③红土70+河砂30％④纯细河砂⑤细河砂60％+椰糠40％⑥红土70％+泥炭土30％)中进行移栽试验，每种基质移栽200株，移栽30d后调查并统计结果。
1.2.5培养条件
培养温度为25℃-28℃，培养基pH值为5.8，所有培养基中均加白糖30g·L-1，卡拉胶7g·L-1，采用日光灯作为人工光源，光强在1500～2000Lx，光照时数10～12h/d。
2结果与分析
2.1外植体表面灭菌时间的确定
外植体经过各种表面灭菌试验后接种于培养基中，经过20d培养后，进行数据统计并观察污染(包括细菌污染和真菌污染)和死亡情况(见表1)。灭菌时间为12min时污染率达到96％，几乎没有成活的无菌外植体留下；灭菌时间为15min时污染率达到45％，芽死亡率上升至6％，但还有49％的成活无菌外植体留下；灭菌时间为18min时污染率下降到17％，但芽死亡率上升至21％，有62％的成活无菌外植体留下；灭菌时间为20min时污染率下降到5％，但芽死亡率上升至52％，有43％的成活无菌外植体留下；灭菌时间为25min时虽然污染率下降到零，但芽死亡率上升至92％，几乎没有成活的无菌外植体留下。可见，消毒时间为15-20min均可，但灭菌时间为20min时对芽体损伤较大，前 期生长较慢，所以灭菌时间用15-18min为宜。
表1 各种灭菌时间对外植体的影响情况的比较
2.2基本培养基和启动培养基的选择
将表面灭菌后经过20d培养无污染并活的无菌外植体接种于各种试验培养基中，经过40d培养后，进行数据统计并观察生长状况(见表2)。采用MS为基本培养基的，有部分外植体的腋芽有萌发，能形成丛生芽，但叶片和茎生长极不正常，即叶片卷曲不能正常展开且叶片变厚最后变褐脱落，茎上到处有愈伤组织长出；采用B5和White为基本培养基的，只的少数外植体的腋芽能萌发，但只有芽点很难形成丛生芽，采用ML为基本培养基(即改良的MS培养基)的，大部分外植体的腋芽能正常萌发，能抽长并形成丛生芽，叶片及茎生长正常，通过对比分析，最终选择ML培养基作为基本培养基效果最佳，因此选择ML+BA2.0+NAA0.5为最佳启动培养基。
表2 四种培养基对腋芽萌发与生长影响的比较
2.3继代增殖培养
选取腋芽已萌发且生长正常的外植体，接种到各种增殖培养基上(采用ML为基本培养基，添加各种激素浓度配比组合(见表3)的培养基)10d后可见部分培养基中的继代材料基部叶腋处有芽点萌发，30d后开进行观察并统计数据。从表3可以看出随着6－BA含量的增加其外植体的增殖倍数不断增加，但芽不断变细。随着NAA含量的不断增加，平均每瓶有效芽的数量不断增加，但茎基部松散的愈伤组织不断增加，叶片逐渐开始卷曲变形，最后以6-BA1.5，NAAO.4的组合作为继代增殖培养基，其增殖倍数较高为3.3,且茎、叶生长正常，叶片能正常展开，平均每瓶可生根的有效芽数达到7个。方差分析结果表明(见表4)不同浓度水平的6-BA与NAA对不定芽的增殖有极显著影响.
表3 6-BA和NAA对芽苗生长分化的影响
注：有效芽为可用于进行生根培养的芽苗(即苗高达到3cm以上，叶片展开，无愈伤组织的芽苗)
表4 继代增殖效果方差分析表
2.4不定根的诱导培养
将增殖培养30d后高3.0cm以上叶片正常展开的芽苗，通过无菌操作切取2.5cm左右的顶芽，接种于以1/2ML(大量元素减半，其余不变)为基本培养基的各组试验培养基上培养25d后，进行观察并统计数据，试验结果表明(见表5)，以附加NAA0.1、IBA1.0为最佳激素浓度组合，生根率可达94％。生根效果的方差分析结果表明(见表6)不同水平的IBA浓度对芽苗的生根率有显著的影响；不同水平的NAA浓度对芽苗的生根率的影响不显著。
表5 IBA和NAA浓度对芽苗生根的影响
表6 生根诱导方差分析表
2.5组培苗的炼苗和移栽
生根培养25d的生根瓶苗及时移到高温高光强的炼苗区(炼苗区温度一般在30-35℃，光照在3000-500OLx)炼苗7-10d，再洗去根部的培养基，放入2g·L-1浓度的多菌灵溶液中浸泡10min，然后用自来水冲洗干净，移栽至经过1g·L-1的高锰酸钾溶液消毒的各种基质中(见表7)，移栽后浇透水，覆盖薄膜保湿并遮萌70-80％，7d后，每5d喷1次500倍的多菌灵或代森锰锌药液，每天打开薄膜通风5min，以防病害，保持相对湿度90％以上，15d(冬季可适当延长至25d)后可逐渐揭开薄膜。同时注意遮荫，移栽30d后检查，各种基质的小苗移栽成活率见表8。从表8中可以看出，小苗移栽成活率最高的基质是纯红土，其成活达到91.5％；其次是红土70％+河砂30％，其小苗成活率达到90.5％；其它几种基质的移栽成活率都偏低，成活率最低基质是纯细河砂，只有24.5％。在移栽成活率超过90％的两基质中，由于移栽到纯红土的小苗，后期生长不良，叶片黄化，多次施肥后基质表面易长苔藓，影响小苗后期生长。而移栽到红土70％+河砂30％ 上的小苗生长正常，多次施肥后基质表面长出的苔藓较少，对小苗后期生长的影响也较少，因此，最终选择红土70％+河砂30％作为牛樟组培瓶苗的移栽基质，其移栽成活率达到90.5％。
表7 移栽基质编号
表8 不同基质对牛樟生根瓶苗移栽成活率的影响
综上，
3.1牛樟外植体的表面灭菌方法为：将预处理好的牛樟茎段先用75％酒精浸泡60s,再用无菌水冲洗2次，然后再用0.l％HgCl2溶液浸泡15-18min，然后再用无菌水冲洗4-5次即可。
3.2以改良的MS培养基(即ML培养基)外加6-BA2.0mg/l、NAA0.5mg/l为诱导培养基，以ML+6-BA1.5+NAA0.4为继代增殖培养基，以l/2ML+NAA0.1+IBA1.0为生根培养基，可使牛樟外植体的诱导率达71.7％，增殖倍数达3.3倍，生根率达94％。
3.3以红土70％+河砂30％作为牛樟组培瓶苗的移栽基质，其移栽成活率达到90.5％，牛樟组培苗的年生产能力可达32万株。
3.4牛樟组培苗的移栽管理技术:当炼苗区的牛樟瓶苗苗高达4cm以上，根长达到2cm以上时，进行组培苗的移栽工作。移栽时先洗去根部的培养基，再放入2g·L-1浓度的多菌灵溶液中浸泡10min，然后用自来水冲洗干净，便可移栽到经过1g·L-1的高锰酸钾溶液消毒的基质中。移栽后浇透水，覆盖薄膜保湿并遮萌70-80％，7d后，每5d喷1次500倍的多菌灵或代森锰锌药液，每天打开薄膜通风5min，以防病害，保持相对湿度90％以上，15d(冬季可适当延长至25d)后可逐渐揭开薄膜。同时注意遮荫，移栽30d后每隔10至15d可进行追施叶面肥(800至1000倍)和复合肥(200至300倍)。
3.5在牛樟组培过程中，取材部位对腋芽的萌发和丛生芽的形成有一定影响，其中以当年生幼嫩枝条中上部带腋芽茎段较容易形成丛生芽。
实施例2 牛樟示范林的种植及高效栽培管理技术
本项目分别在漳州天宝国有林场、南靖永丰国有林场、龙海九龙岭国有林场、漳州亿绿园艺科技有限公司等地营造台湾牛樟示范林130多亩。总结出以下高效栽培管理技术。
1造林及抚育管理
1.1林地选择
牛樟对土壤适应性强，喜欢土壤湿润，但是不能积水，在土层深厚肥沃的壤土生长旺盛，在红土或者土质较差的地方要增施有机肥。因此，选林地选择在海拔1000m以下，土层深厚、含石率低、水气充足，排水良好、肥沃、疏松、交通方便的林地，进行造林。
1.2林地准备
造林前清杂、炼山，炼山后及时整地挖穴，采用块状整地，穴的规格为70×40×35cm， 株行距2×3m。在造林前10～30天，结合回表土进行施基肥，穴底施200g含N、P、K各15％的复合肥，回表土占穴体积一半时，每穴施400g钙镁磷肥，肥与土充分搅拌均匀后，覆盖表土高出穴面10～15cm。
1.3造林
在2～5月雨后阴天或小雨天进行造林，选择苗高25～60cm、根系发达、顶芽无机械损伤的健壮苗木上山造林为宜。由于是使用薄膜容器苗造林，所以提苗前要充分灌水，使根系与容器内土壤紧密结合，造林时将薄膜全部拆除。栽植做到认真细致，深根深植、覆土踏实，保持根土密接等技术要领，以保证苗木成活，提高造林成活率。种植深度一般比原根深高出2cm，造林密度每亩100～110株。
1.4幼林抚育
种植成活后二个月除草松土抚育一次，并结合除草抚育进行抹芽、修枝、扶直固定等工作。为培养优良主干，造林后1～3年用木棍扶直定干，并修枝、抹芽培育主干至3m以上。在幼林郁闭前加强抚育工作，采用锄草松土、扩穴扶直、除蔓修枝等措施，每年进行2～3次，时间一般在4～5月、8～9月。深度10cm左右，并进行培土。
1.5合理追肥
第一年在种植成活后2～3个月追肥一次，7～8月雨后再追肥一次，第二、三年3～4月结合锄草松土追肥一次，追肥使用尿素和复合肥(N、P、K)每次每株各施100g。方法为：采用在相当于树冠投影范围的外缘或种植行行间开沟施入肥料的沟施方法，施肥深度以使肥料集中在根标附近为宜，一般应使化肥在地表以下约20～30cm或更深一些的地方。
1.6主要病虫害防治
①樟叶蜂：幼虫取食樟叶当年抽的嫩梢，严重影响牛樟的生长。可用90％的敌百虫或50％的马拉松乳剂的2000倍液喷杀。
②樟巢螟：幼虫成群集结于新梢上取食叶芽，并吐丝把叶卷成球状，包住项芽，致使新梢枯死。此幼虫一年发生2代，第1代幼虫在5月底到7月中旬为害；第2代幼虫尚未结成网巢时用上述药剂喷杀，此时效果最佳。具体为刚开始活动尚未结成网巢时，用90％ 晶体敌百虫4000～5000倍液喷杀，如幼虫己结成网巢，可人工摘除烧掉。
③樟梢卷叶蛾。一年发生数代，糼虫蛀食嫩梢，被害苗枯死。可用40％乐果200～300倍液喷杀幼虫，当幼虫大量化蛹期间结合抚育进行林地除草培土，杀死虫蛹。
④樟天牛：主要危害主枝和侧枝，采用人工捕杀，或由排泄孔注入敌敌畏药剂。
⑤白粉病：多发生在圃地幼苗，开始幼苗嫩叶背面主脉附近出现灰褐色斑点，以后蔓延至整个叶背，并出理一层白粉。防治方法：注意苗圃卫生，适当疏苗，发现病株应立即拔除烧掉，病症明显时，用波美0.3～0.5度的石硫合剂，每10天喷一次，连续喷射3～4次。
2示范林调查
通过对示范林的调查(见表9)，牛樟种植后第一年的高生长量可达到1.2～1.5m，病虫害发生率为3.5％。以下分别对种植半年和种植一年半的牛樟扦插苗及种植一年的牛樟组培苗进行调查，调查数据如下：
表9 示范林生长情况调查表