一种基于花序浸渍诱导板栗2n花粉的方法与流程

本发明属于果树育种技术领域，具体涉及一种用化学药剂诱导多倍体的方法。

背景技术：

板栗原产中国，栽培历史悠久，是优良的干果树种。中国板栗三分之二以上的种植面积位于经济欠发达的边老穷山区，随着历史的发展逐渐形成了独具特色的山区板栗产业，成为山区农民贫致富的重要经济依赖。品种是一个产业得以健康发展的重要保证，也是永恒的基础需求。目前，国内外均采用多种方式来培育新品种为生产服务，植物上获得新品种的主要方式包括：实生选种、芽变选种、杂交育种、辐射育种、转基因育种、多倍体育种等，其中多倍体育种一直是应用普遍、育种效果突出的新品种培育方式之一。多倍体是指具有三套或者三套以上完整染色体组的所有个体。染色体组加倍使植物体可用的遗传物质增加，重复的基因可能会发生功能分化，从而使多倍体物种在自然选择中具有更大环境适应优势，如更强的抗旱能力、抗病虫害能力、无融合生殖等，使植物可以适应更广泛的自然环境(Rieseberg LH.Hybrid origins of plant species.Ann Rev Ecol Syst,2003,28(1):359-389)。目前，多倍体育种的途径主要包括：从自然界选择天然多倍体植株；利用不同倍性水平植株杂交；利用天然或人工诱导2n花粉(2n雄配子)授粉；利用天然或者人工诱导2n雌配子杂交以及体细胞染色体加倍等。实践业已证实，利用2n配子杂交是获得植物多倍体的一种高效方式。2n配子是指在减数分裂过程中某些因素导致形成具有体细胞染色体数的花粉或卵细胞，其在植物界普遍发生，目前至少26个科的60个属中发现能产生2n配子的植物种(张正海等.小胡杨小孢子发生及微管骨架变化.北京林业大学学报,2008(6):36-40.)；Nassar N.Cassava,Manihot esculenta Crantz and wild relatives:their relationships and evolution.Genetic Resources and Crop Evolution,2001,48(5):429-436.)。特别是2n花粉(具有体细胞染色体数的花粉)，由于其与正常倍性花粉在形态及大小方面存在差异，易于识别和鉴定，广泛应用于植物多倍体育种(杨倩等.，杨树2n花粉形态判别方法飞比较.东北林业大学学报,2015(2):33-35.)。国内外学者多年育种实践证实，利用化学药剂诱导出2n花粉与二倍体雌株杂交，是迅速获得三倍体的有效途径之一，而提高2n花粉产生频率是利用2n花粉进行多倍体育种成败的关键(向素琼等，柑橘属2n花粉自然发生与沙田柚2n花粉诱导研究.西南大学学报：自然科学版,2005,27(5):616-620)。

在植物雌雄配子多倍化过程中，由于各物种间遗传物质、器官构成、发育时期和方式等因素千差万别，其达到好的多倍化诱导效果所需的药剂、剂量、时间、材料和方法等因素也各不相同(吴潇，等.诱变技术在落叶果树育种中的应用.园艺学报，2016，43(09)：1633-1652.)。板栗的遗传背景复杂，保守性强，无法直接利用其自然花粉中2n花粉进行多倍体育种实践；在目前的相关研究中，尚未发现有关成功诱导出板栗大频率2n花粉的报道。

技术实现要素：

为了克服板栗自然花粉中2n花粉比率过低、无法直接应用于育种实践的不足，弥补大频率板栗2n花粉人工诱导方法空白，本发明旨在提供一种基于花序浸渍诱导板栗2n花粉的方法，该方法可以获得大频率2n花粉。

实现本发明目的的技术方案为：

一种基于花序浸渍诱导板栗2n花粉的方法，包括以下步骤：

1)选择诱导材料：选择板栗品种的花序为诱导处理材料，所述花序为雄花枝上的花序；

2)配制诱导药剂：配置秋水仙素的水溶液为诱导药剂，处理花序之前1～3天配制好诱导药剂，置于1～6℃温度下备用；

3)诱导药剂浸渍花序：选择板栗品种花枝上的花序为处理对象。诱导药剂处理花序时期为每年5月，将选用的雄花枝上的每条花序单独用脱脂棉包覆，保留花序着生部位叶片；将诱导药剂注射在包裹花序的脱脂棉上，直至脱脂棉吸收诱导药剂至饱和状态，

4)花序散粉前套袋：在板栗花朵开放前(每年6月1～10日)，将诱导药剂处理过的花序全部套入纸袋中，封口，以防止该花序上混入其它花粉。

5)花粉收集：待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期，此时花粉已成熟，将纸袋和花序一同采下，收集袋中自然散落的花粉，即获得大频率板栗2n花粉。采下花序后优选置于阴凉干燥处24h。

其中，步骤1)所述板栗品种为燕奎(Castanea mollissima‘Yankui’)。

其中，步骤2)所述诱导药剂中，秋水仙的浓度为0.1～1％(W/V)。该浓度表示溶液每100mL体积中加入秋水仙0.1～1g。

其中，所述诱导药剂中含有体积浓度为0.02～0.2％的助渗剂，所述助渗剂为环氨基甲酸酯、内酰胺、二甲基亚砜中的一种或多种。

步骤3)所述处理对象为板栗健康无病、生长健壮的雄花枝，其上保留的4～6个花序为处理对象。

其中，步骤3)选择板栗花序以基部直径不超过5mm，长度不超过15cm，花朵紧抱花蕊未开放为标准。

进一步地，诱导药剂处理花序时期为每年5月10日～25日，这个时期内花序大多符合上述的标准。在5月15至18日是更优选的时间。

进一步地，步骤3)中，花序用脱脂棉包好，包覆的棉层厚度为2±0.5mm，之后用塑料条将雄花枝上所有包裹好脱脂棉的花序连同其着生部位叶片封好，留有适当透气缝隙；用注射器将诱导药剂注射在包裹花序的脱脂棉上，直至脱脂棉吸收诱导药剂至饱和状态，如此使板栗雄花枝上的花序在药剂浸渍状态下。

其中，步骤3)所述使板栗雄花枝上的花序在药剂浸渍状态下为使板栗雄花枝上的花序在药剂浸渍状态下保持24～74h。之后拆除塑料条，去除花序上的脱脂棉，将药剂处理后的花序重新暴露在空气中。试验中发现，浸渍72小时花粉诱导率到极限值，再延长浸渍时间会导致花粉败育或死亡。考虑到操作时间，浸渍状态保持最多74h。

本发明所述的基于花序浸渍诱导板栗2n花粉的方法在板栗多倍体育种中的应用。

自然界中的板栗花粉中2n花粉的比率不足1‰(试验证实：对照板栗花序花粉中2n花粉的比率为0.03‰)，无法直接利用其进行多倍体育种实践。在目前的相关研究中，尚未发现有关成功诱导出板栗大频率2n花粉的报道。本发明以板栗花序为对象，筛选其适宜的诱导药剂、剂量、时期、部位等因素，创建一套基于花序浸渍的板栗2n花粉诱导技术，获得大频率2n花粉，为今后提供一种切实可行的板栗2n花粉诱导方法，从而为板栗倍性育种的成功提供技术支撑。

本发明基于花序浸渍诱导板栗2n花粉的方法：第一通过选择花粉量充足的板栗品种‘燕奎’的雄花枝上的花序为处理材料；第二选用以秋水仙素为诱导剂、二甲基亚砜为助渗剂的特定成分、特定浓度和特定配比的2n花粉诱导药剂；第三选择诱导药剂处理花序特定时期为每年5月17日前后；第四采用脱脂棉包裹花序并使其在药剂浸渍状态下保持72h。以上4个优选的措施来共同达到诱导板栗花粉中2n花粉比率提高的目的，获得大比率板栗2n花粉。

板栗花序采用本发明提出的方法处理后，可以获得大比率2n花粉，试验证实处理的板栗花序所产生的花粉中2n花粉比率高达11.6％。

附图说明

图1未处理的正常板栗花序(对照)照片；

图2脱脂棉包裹的板栗花序照片；

图3塑料封条封好的板栗花序照片；

图4诱导处理完成后解除塑料封条的板栗花序照片；

图5散粉前板栗花序套袋照片；

图6诱导出的大比率板栗2n花粉照片；

图7自然板栗花粉(对照)照片。

具体实施方式

现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。

实施例及对比例中所用药剂、脱脂棉、塑料条、医用一次性注射器、硫酸纸袋等材料均为市购。

实施例1：

对比例1所用试验材料位于河北省昌黎果树研究所板栗育种基地。按下述方法进行基于花序浸渍诱导板栗2n花粉试验。

试验随机区组设计，单株小区，3次重复，以未处理‘燕奎’花序为对照。该试验以诱导药剂(4个水平)、诱导药剂处理花序时期(5个水平)和药剂浸渍花序时长(3个水平)为因素，进行完全试验设计，共60个处理(见表1)。按照下述步骤进行板栗2n花粉诱导操作：

1)选择诱导材料

选择花序长、花朵多、花粉量充足的板栗品种‘燕奎’(Castaneamollissima‘Yankui’)的雄花枝上的花序为处理材料。选择板栗花序以基部直径不超过5mm，长度不超过15cm，花朵紧抱花蕊未开放为标准。

2)配制诱导药剂

于采用诱导药剂处理花序前2天配制好各处理所需诱导药剂(浓度见表1)的水溶液(W/V的单位是g/mL)，置于4℃冰箱中备用。

3)诱导药剂浸渍花序

选择板栗品种‘燕奎’健康无病，生长健壮的雄花枝，每条雄花枝上保留5个花序为处理对象，多余疏除。各处理的诱导药剂处理花序时期按照表1所列执行。将选用的雄花枝上的每条花序单独用脱脂棉包好，棉层厚度2±0.5mm，保留花序着生部位叶片；之后用塑料条(厚度0.06mm，宽度3cm)将雄花枝上所有包裹好脱脂棉的花序连同其着生部位叶片自下而上缠好，留有适当透气缝隙；用医用一次性注射器将配置好的诱导药剂注射在包裹好花序的脱脂棉上，直至脱脂棉吸收诱导药剂至饱和状态，如此使板栗雄花枝上的花序在药剂浸渍状态下保持24—72h(各处理所用时长见表1)；之后拆除塑料条，去除花序上的脱脂棉，将药剂处理后的花序重新暴露在空气中。

4)花序散粉前套袋

在板栗花朵开放前(6月5日)，将诱导药剂处理过的花序全部套入硫酸纸袋中，封口，以防止该花序上混入其它花粉。

5)花粉收集

待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期，此时花粉已成熟，将硫酸纸袋和花序一同采下，带回实验室，置于阴凉干燥处24h，之后收集袋中自然散落的花粉。

6)2n花粉检测

随机选取收集的部分花粉，经卡诺固定液V(乙醇)：V(乙酸)＝3：1固定24—48h。将固定好的花粉制成临时涂片，45％醋酸洋红染液染色20min，置于显微镜上观察。根据花粉的直径判断是否为2n花粉，并计算比例。每个处理单次随机检测500个花粉，重复3次。SPSS 20.0进行数据统计分析。

所有花粉检测均在Olympus BX-51光学显微镜下观察，Olympus DP70照相系统数码摄相，照片见图1-7。

表1试验设计各处理的相关因素

7)实施效果

由表2可见，处理Ch37～60(5月25日之后)诱导的板栗花粉中2n花粉比率极低，故不对其进行差异显著性分析。

不同处理诱导出的板栗2n花粉比率不尽相同，处理ch-1～36诱导出的板栗2n花粉比率均高于自然板栗花粉(CK)，处理ch42、ch-51、ch-58诱导产生的板栗2n花粉比率和对照无显著差异，其余处理诱导产生的2n花粉比率低于对照。所有处理中诱导产生2n花粉比率最高的为ch-24，其诱导产生的板栗2n花粉比率为11.6％，显著高于对照(板栗自然花粉中2n花粉比率为0.067％)，亦显著高于其它处理产生的2n花粉。

由此可见，以诱导产生的2n花粉比率为评价指标，ch-24处理中各因素组合为最佳，诱导产生的2n花粉比率是所有处理中最高的(可获得高达11.6％的板栗2n花粉)。换言之，在以获得大频率2n花粉为目的的前提下，选用诱导药剂[0.75％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亚砜]，于5月17日处理花序，并保持药剂浸渍花序72h的处理，可以取得理想的试验结果。

表2板栗2n花粉诱导效果

注:表中数据后不同字母表示差异显著(α＝0.05)。

试验数据也表明，板栗的自然花粉中2n花粉的比率不足1‰，由于其比率过低，无法直接利用其自然花粉中2n花粉进行多倍体育种实践。

实施例2～10

以下实施例共对“燕奎”、X44-21、燕明、南垂5号、替码珍珠、燕昌、燕红、燕龙、燕丰、怀九共10个花期相近的板栗品种进行基于花序浸渍诱导板栗2n花粉试验。

按照下述步骤进行板栗2n花粉诱导操作：

1)选择诱导材料

选择燕奎、X44-21、燕明、南垂5号、替码珍珠、燕昌、燕红、燕龙、D7-43、怀九共10个板栗品种的雄花枝上花序作为诱导处理材料。

2)配制诱导药剂

于采用诱导药剂处理花序前2天配制好所需诱导药剂[0.75％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亚砜]，置于4℃冰箱中备用。

3)诱导药剂浸渍花序

选择各板栗品种健康无病，生长健壮的雄花枝，每条雄花枝上保留5个花序为处理对象，多余疏除。将选用的雄花枝上的每条花序单独用脱脂棉包好，棉层厚度2±0.5mm，保留花序着生部位叶片；之后用塑料条(厚度0.06mm，宽度3cm)将雄花枝上所有包裹好脱脂棉的花序连同其着生部位叶片自下而上缠好，留有适当透气缝隙；用医用一次性注射器将配置好的诱导药剂注射在包裹好花序的脱脂棉上，直至脱脂棉吸收诱导药剂至饱和状态，如此使板栗雄花枝上的花序在药剂浸渍状态下保持72h；之后拆除塑料条，去除花序上的脱脂棉，将药剂处理后的花序重新暴露在空气中。

4)花序散粉前套袋

在板栗花朵开放前(6月5日)，将诱导药剂处理过的花序全部套入硫酸纸袋中，封口，以防止该花序上的花粉混入其它花粉。

5)花粉收集和检测

待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期，此时花粉已成熟，将硫酸纸袋和花序一同采下，带回实验室，置于阴凉干燥处24h，之后收集袋中自然散落的花粉。

6)2n花粉检测

随机选取收集的部分花粉，经卡诺固定液V(乙醇)：V(乙酸)＝3：1固定24～48h。将固定好的花粉制成临时涂片，45％醋酸洋红染液染色20min，置于显微镜上观察。根据花粉的直径判断是否为2n花粉，并计算比例。每个处理单次随机检测500个花粉，重复3次。SPSS 20.0进行数据统计分析。

所有花粉检测均在Olympus BX-51光学显微镜下观察，Olympus DP70照相系统数码摄相。显微观察诱导出的花粉尺寸和实施例大致相等。

7)实施效果

由表3可知，10个板栗品种采用同一基于花序浸渍诱导板栗2n花粉方法，均可诱导产生6.24％比率以上的2n花粉，显著高于板栗自然花粉中2n花粉比率(0.067％，表2)，说明发明方法在不同板栗品种上实施均可诱导大频率2n花粉，该方法具有广泛性。

该发明方法在不同品种上实施，诱导产生的2n花粉比率亦有差别，品种‘燕奎’、‘南垂5号’、‘燕昌’、‘D7-43’经同一方法诱导产生的2n花粉比率较高，但这4个品种间无显著差别，其中以品种‘燕奎’诱导处理后产生的2n花粉比率最高。

表3各品种诱导出的2n花粉比率统计表

注:表中数据后不同字母表示差异显著(α＝0.05)。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。