本发明设计植物组织培养
技术领域：
，尤其涉及大花斑叶兰科植物的优化培养基配方及其快速繁殖方法。
背景技术：
：大花斑叶兰(学名:Goodyerabiflora):为兰科斑叶兰属多年生草本植物，植株高5～15厘米。根状茎伸长，茎状，匍匐，具节。茎直立，绿色，具4～5枚叶。花茎很短，被短柔毛；总状花序通常具2朵花，罕3～6朵花，常偏向一侧；花苞片披针形，长1.5～2.5厘米，宽6～7毫米，先端渐尖，背面被短柔毛；花期2～7月。生于海拔560～2200米的林下阴湿处。野生资源分布于陕西南部、甘肃南部、江苏、安徽、浙江、台湾、河南南部、湖北、湖南、广东、四川、贵州、云南、西藏。尼泊尔、印度、朝鲜半岛南部、日本也有。大花斑叶兰是名贵珍稀药用植物，味苦，性寒；清热解毒，行气活血，解毒消肿，软坚散结，祛风止痛。用于风湿关节痛，痛风，瘀肿疼痛，痈疮肿毒，毒蛇咬伤。另外，由于大花斑叶兰叶片及花朵极具观赏价值，也可用于栽培观赏之用。由于大花斑叶兰种子微小，没有胚乳结构，所以种子自然萌发可能是借助共生菌的作用提供营养，生命力弱，极易夭折，自然界种子繁殖率小于0.01%，大花斑叶兰在自然界的繁殖一般靠无性分株繁殖，繁殖率很低，植株生长缓慢，矮小，加上人为采挖，故已濒危，濒临灭绝。所以迫切需要一种快速繁殖大花斑叶兰的方法，缓解目前存在的大花斑叶兰生长繁殖的危机，同时供应市场需求。技术实现要素：本发明目的旨在克服以上问题，提供一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法。一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：MS或改良N6培养基，其中，蔗糖或白糖15～30g/L，琼脂条7～10g/L，香蕉肉50～100g/L，pH5.5～6.2；2）诱导培养基：MS或改良N6+KT0.2～1.0mg/L+6-BA2.0～4.5mg/L+NAA0.2～1.0mg/L或IBA0.2～1.0mg/L；3）增殖培养基：MS或改良N6+6-BA2.0～4.0mg/L+NAA0.5～1.0mg/L或IBA0.2～1.0mg/L；4）生根壮苗培养基：MS或改良N6+NAA0.2～1.0mg/L或IBA0.2～0.5mg/L+活性炭0.5～1.5g/L。优选的，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：MS或改良N6培养基，其中，蔗糖或白糖15g/L，琼脂条7g/L，香蕉肉50g/L，pH5.5；2）诱导培养基：MS或改良N6+KT0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L或IBA0.2mg/L；3）增殖培养基：MS或改良N6+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L或IBA0.2mg/L；4）生根壮苗培养基：MS或改良N6+NAA0.2mg/L或IBA0.2mg/L+活性炭0.5g/L。优选的，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：MS或改良N6培养基，其中，蔗糖或白糖30g/L，琼脂条10g/L，香蕉肉100g/L，pH6.2；2）诱导培养基：MS或改良N6+KT1.0mg/L+6-BA4.5mg/L+NAA1.0mg/L或IBA1.0mg/L；3）增殖培养基：MS或改良N6+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L或IBA1.0mg/L；4）生根壮苗培养基：MS或改良N6+NAA1.0mg/L或IBA0.5mg/L+活性炭1.5g/L。优选的，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：MS或改良N6培养基，其中，蔗糖或白糖20g/L，琼脂条8g/L，香蕉肉75g/L，pH5.9；2）诱导培养基：MS或改良N6+KT0.6mg/L+6-BA3.3mg/L+NAA0.6mg/L或IBA0.6mg/L；3）增殖培养基：MS或改良N6+6-BA3.0mg/L+NAA0.8mg/L或IBA0.6mg/L；4）生根壮苗培养基：MS或改良N6+NAA0.6mg/L或IBA0.4mg/L+活性炭1.0g/L。本发明还提供了一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，包括如下步骤：1）外植体的选取与表面灭菌：取大花斑叶兰的茎尖或茎段为外植体，经消毒后，用无菌水清洗备用；2）诱导培养：在无菌条件下将处理好的外植体接种在诱导培养基中进行培养，温度20～28℃，光照500～2000Lux，经过30～50天诱导出初代芽或丛生芽或拟原球茎；3）增殖培养：将诱导出的初代芽或丛生芽或拟原球茎接种到增殖培养基中进行继代培养，45～60天为一个继代周期；4）生根壮苗培养：将继代过程中的幼芽接种到生根壮苗培养基中进行生根壮苗培养，温度20～28℃，光照500～2000Lux，经过30～50天，植株高达4～6cm；5）组培苗驯化与移栽：将生长达4～6cm以上的组培苗常温下驯化适应10～30天后，打开瓶盖再适应3～5天，用清水洗净苗子根部的培养基后移栽入基质中。优选的，步骤5）所述常温下驯化适应的条件为将生长达4～6cm以上的组培苗的培养瓶放到常温遮光的日光塑料膜棚里进行驯化适应。优选的，步骤5）所述栽培基质包括椰糠、碎树皮、锯末、泥炭土和珍珠岩中的一种或多种。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1.本发明提供的大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，不受季节及环境条件的节限制，可全年规模化生产。2.本发明提供的大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，可快速生产优良健壮、性状一致的大花斑叶兰种苗。所生产的大花斑叶兰组培苗不经栽种，也具有和栽种或野生的大花斑叶兰相差不大的药用效果，所以生根壮苗后的组培苗可以不经过栽种直接新鲜入药或干燥后入药。3.本发明以大花斑叶兰的茎尖或茎段为外植体，无菌条件下在人工配制的培养基中诱导产生丛生芽或拟原球茎的方式增殖进行快速繁殖，增殖率可高达6～8倍。幼苗经壮苗生根培养，生根率100%，驯化、移栽后成活率95%以上，可应用于规模化生产。具体实施方式为了更详细地进一步阐明而不是限制本发明，给出下列实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：（1）基本培养基：选用MS培养基；其中白糖20g/L，琼脂条8.0g/L，香蕉肉100g/L，pH6.0；（2）诱导培养基：MS+KT0.2mg/L+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L；（3）增殖培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；（4）生根壮苗培养基：MS+NAA0.2mg/L+IBA0.2mg/L+活性炭1.0/L。其组织培养及快速繁殖的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选取与表面灭菌：取大花斑叶兰的带腋芽茎段为外植体，用自来水清洗干净表面的脏物，用75%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞溶液表面灭菌2次，各5分钟；然后用无菌水清洗4次后，接种在诱导培养基中；（2）诱导培养：在超净工作台上无菌条件下将处理好的外植体接种在诱导培养基中进行培养，温度25℃，光照1000Lux，经过40天可诱导出初代芽或丛生芽或拟原球茎；（3）增殖培养：将诱导出的初代芽或丛生芽或拟原球茎接种到增殖培养基中进行继代培养，60天为一个继代周期，可增殖出大量的幼芽或丛生芽或拟原球茎，增殖倍数可达6倍；（4）生根壮苗培养：将继代过程中的幼芽接种到生根壮苗培养基中进行生根壮苗培养，温度温度25℃左右，光照2000Lux，经过50天，植株可达5cm高，生根率100%；（5）组培苗驯化与移栽：将生长达4cm以上的组培苗的培养瓶放到常温遮光光照3000Lux的日光塑料膜棚里进行驯化适应30天后，打开瓶盖再适应5天，用清水洗净苗子根部的培养基后移栽入基质中，所述栽培基质包括锯末、泥炭土和珍珠岩，其重量比为锯末：泥炭土：珍珠岩为2:2:1的基质中，注意保持基质湿度，适当遮阴，精心管理，30天后统计成活率为99%。实施例2一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：（1）基本培养基：选用改良N6培养基：其中，白糖30g/L，琼脂条8.0g/L，香蕉肉100g/L，pH5.8；（2）诱导培养基：N6+KT0.5mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L；（3）增殖培养基：N6+6～BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L；（4）生根壮苗培养基：MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+活性炭1.0/L。其组织培养及快速繁殖的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选取与表面灭菌：取大花斑叶兰的带腋芽茎段为外植体，用自来水清洗干净表面的脏物，用70%的酒精浸泡40s，再用0.1%升汞溶液表面灭菌3次，各6分钟；然后用无菌水清洗5次后，接种在诱导培养基中；（2）诱导培养：在超净工作台上无菌条件下将处理好的外植体接种在诱导培养基中进行培养，温度20℃，光照500Lux，经过30天诱导出初代芽或丛生芽或拟原球茎；（3）增殖培养：将诱导出的初代芽或丛生芽或拟原球茎接种到增殖培养基中进行继代培养，45天为一个继代周期；增殖倍数可达6倍；（4）生根壮苗培养：将继代过程中的幼芽接种到生根壮苗培养基中进行生根壮苗培养，温度20℃，光照500Lux，经过30天，植株高达4cm，生根率100%；（5）组培苗驯化与移栽：将生长达4cm以上的组培苗的培养瓶放到常温遮光的日光塑料膜棚里进行驯化适应10天后，打开瓶盖再适应3天，用清水洗净苗子根部的培养基后移栽入基质中，所述栽培基质包括椰糠、碎树皮、锯末、泥炭土和珍珠岩，其重量比为椰糠：碎树皮：锯末：泥炭土和珍珠岩为1:1:2:3:1；保持基质湿度，适当遮阴，精心管理，35天后统计成活率为96%。实施例3一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：选用MS培养基，其中，蔗糖15g/L，琼脂条7g/L，香蕉肉50g/L，pH5.5；2）诱导培养基：MS+KT0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L；3）增殖培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；4）生根壮苗培养基：MS+NAA0.2mg/L+活性炭0.5g/L。其组织培养及快速繁殖的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选取与表面灭菌：取大花斑叶兰的茎尖为外植体，用自来水清洗干净表面的脏物，用80%的酒精浸泡20s，再用0.1%升汞溶液表面灭菌3次，各8分钟；然后用无菌水清洗3次后，接种在诱导培养基中；2）诱导培养：在超净工作台台上无菌条件下将处理好的外植体接种在诱导培养基中进行培养，温度28℃，光照2000Lux，经过50天诱导出初代芽或丛生芽或拟原球茎；3）增殖培养：将诱导出的初代芽或丛生芽或拟原球茎接种到增殖培养基中进行继代培养，60天为一个继代周期；增殖倍数可达8倍；4）生根壮苗培养：将继代过程中的幼芽接种到生根壮苗培养基中进行生根壮苗培养，温度28℃，光照2000Lux，经过50天，植株高达6cm，生根率100%；5）组培苗驯化与移栽：将生长达6cm以上的组培苗的培养瓶放到常温遮光的日光塑料膜棚里进行驯化适应30天后，打开瓶盖再适应5天，用清水洗净苗子根部的培养基后移栽入基质中，所述栽培基质为椰糠；保持基质湿度，适当遮阴，精心管理，25天后统计成活率为98%。实施例4一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：选用改良N6培养基，其中，白糖15g/L，琼脂条7g/L，香蕉肉50g/L，pH5.5；2）诱导培养基：改良N6+KT0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+IBA0.2mg/L；3）增殖培养基：改良N6+6-BA2.0mg/L+IBA0.2mg/L；4）生根壮苗培养基：改良N6+IBA0.2mg/L+活性炭0.5g/L。其组织培养及快速繁殖的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选取与表面灭菌：取大花斑叶兰的茎尖为外植体，用自来水清洗干净表面的脏物，用72%的酒精浸泡35s，再用0.1%升汞溶液表面灭菌4次，各8分钟；然后用无菌水清洗3次后，接种在诱导培养基中；2）诱导培养：在超净工作台台上无菌条件下将处理好的外植体接种在诱导培养基中进行培养，温度24℃，光照1200Lux，经过40天诱导出初代芽或丛生芽或拟原球茎；3）增殖培养：将诱导出的初代芽或丛生芽或拟原球茎接种到增殖培养基中进行继代培养，50天为一个继代周期；增殖倍数可达7倍；4）生根壮苗培养：将继代过程中的幼芽接种到生根壮苗培养基中进行生根壮苗培养，温度24℃，光照1200Lux，经过40天，植株高达5cm，生根率100%；5）组培苗驯化与移栽：将生长达5cm以上的组培苗的培养瓶放到常温遮光的日光塑料膜棚里进行驯化适应20天后，打开瓶盖再适应4天，用清水洗净苗子根部的培养基后移栽入基质中，所述栽培基质包括椰糠、碎树皮、锯末、泥炭土和珍珠岩，其重量比为椰糠：碎树皮：锯末：泥炭土和珍珠岩为3:2:1:1:0.5；保持基质湿度，适当遮阴，精心管理，30天后统计成活率为97%。实施例5一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：选用MS培养基，其中，蔗糖15g/L，琼脂条7g/L，香蕉肉50g/L，pH5.5；2）诱导培养基：改良N6+KT0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+IBA0.2mg/L；3）增殖培养基：MS+6-BA2.0mg/L+或IBA0.2mg/L；4）生根壮苗培养基：改良N6+NAA0.2mg/L+活性炭0.5g/L。其组织培养及快速繁殖的方法见实施例1。实施例6一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：MS培养基，其中，蔗糖30g/L，琼脂条10g/L，香蕉肉100g/L，pH6.2；2）诱导培养基：MS+KT1.0mg/L+6-BA4.5mg/L+NAA1.0mg/L或IBA1.0mg/L；3）增殖培养基：MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L；4）生根壮苗培养基：MS+NAA1.0mg/L+活性炭1.5g/L。其组织培养及快速繁殖的方法，见实施例1实施例7一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：MS培养基，其中，蔗糖30g/L，琼脂条10g/L，香蕉肉100g/L，pH6.2；2）诱导培养基：改良N6培养基+KT1.0mg/L+6-BA4.5mg/L+NAA1.0mg/L；3）增殖培养基：改良N6+6-BA4.0mg/L+IBA1.0mg/L；4）生根壮苗培养基：MS+IBA0.5mg/L+活性炭1.5g/L。其组织培养及快速繁殖的方法，见实施例1实施例8一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：改良N6培养基，其中，白糖30g/L，琼脂条10g/L，香蕉肉100g/L，pH6.2；2）诱导培养基：改良N6+KT1.0mg/L+6-BA4.5mg/L+IBA1.0mg/L；3）增殖培养基：改良N6+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L或IBA1.0mg/L；4）生根壮苗培养基：改良N6+IBA0.5mg/L+活性炭1.5g/L。其组织培养及快速繁殖的方法，见实施例1。实施例9一种大花斑叶兰组织培养及快速繁殖的方法，基本培养基及不同培养阶段的培养基的组分及其含量如下：1）基本培养基：MS培养基，其中，蔗糖30g/L，琼脂条10g/L，香蕉肉100g/L，pH6.2；2）诱导培养基：改良N6+KT1.0mg/L+6-BA4.5mg/L+NAA1.0mg/L；3）增殖培养基：MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L或IBA1.0mg/L；4）生根壮苗培养基：改良N6+NAA1.0mg/L或IBA0.5mg/L+活性炭1.5g/L。其组织培养及快速繁殖的方法，见实施例1。效果说明以发明专利CN102872347B实施例3的公开的配方和制备方法为例，进行本发明组织培养所得大花斑叶兰入药的效果的实验。以本发明组织培养及快速繁殖所得大花斑叶兰取代普通正常状态下生长的斑叶兰入药，选取手足口病人300例，随机分为10组，每组30人，以普通正常状态下生长的斑叶兰入药获得的实施例3的药物组为对照组，以实施例1-9所得大花斑叶兰取代普通正常状态下生长的斑叶兰入药的组，依次设为实验组1-9；其中，实验组药的大花斑叶兰可随机选用新鲜药材入药或者干燥后入药。相同的治疗条件和治疗时间，个体差异忽略不计，痊愈率统计均无明显差异，见下表1.说明作为中药材料，组培及快速繁殖的大花斑叶兰苗，不经过栽种，新鲜入药或干燥后入药，药效皆能达到正常栽培大花斑叶兰的效果。表1药效对比对照组实验组1实验组2实验组3实验组4实验组5实验组6实验组7实验组8实验组9痊愈率90%86.7%83.3%80%83.3%83.3%86.7%83.3%86.7%76.7%最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页1 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