专利名称：太行菊的组织培养快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物无性繁殖方法，尤其是一种太行菊的组织培养快速繁殖方 法。
背景技术：
太^于菊(Opisthopappus taihangensis (Ling) Shih)是太ti菊属(Opisthopappus Shih)植物，分布范围狭窄，生存环境独特，大多生长在人们难以到达、非常险峻的悬崖石 缝中，为我国太行山区特有珍稀物种，仅见于豫、晋、冀三省交界的太行山区，为国家珍稀 濒危保护植物(参看丁保章，王遂义，河南植物志(第三卷)，郑州，河南科技出版社， J998. 632)。目前对太行菊组织培养的研究仅有两篇报道，采用了茎段、茎顶芽作为外植体 (姚连芳，河南科技学院园艺系；朱根发，白鹤芋属植物的组织培养和快速繁殖，中国农学 通报，2003，(3) 75 76)。但对太行菊无菌苗体系建立的操作方法及技术都未给出可实施 的指导。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种太行菊的组织培养快速繁殖方法，对太行菊 无菌苗体系的建立给予详细的指导，尤其是给出其诱导愈伤培养基、增殖继代培养基、生根 培养基的最佳配方，具有极强的可实施性与可重复性，能够一次繁殖大量太行菊幼苗。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是太行菊的组织培养快速繁殖 方法，其包含以下步骤A、外植体获取从太行菊无菌苗上采取外植体；B、诱导愈伤培养上步所得外植体材料转移至诱导愈伤培养基中进行培养，设定 光照强度为2000LX，光照时长为12h/d，培养至产生愈伤组织；所述诱导愈伤培养基的成分 为MS培养基+0. 5mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分数的琼脂+3%重量分数的 蔗糖；C、增殖继代培养选取结构致密、质地脆硬、细胞呈不规则球形或近等径型、生长 较慢、颜色为淡绿色的愈伤组织接种到增殖继代培养基上继代培养，此后每20天继代一 次，继代4 5次后芽体变得茁壮，并逐渐长出绿色小叶，形成完整的太行菊小植株体；所述 增殖继代培养基的成分为MS培养基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分数的 琼脂+3%重量分数的蔗糖；D、生根培养将生长高度在2cm以上的无菌苗，转移至生根培养基，接种时注意 保持芽体原有的形态学上下端，使生根端进入培养基，保持植株直立且稳定，在恒温光照 培养室中培养30d 60d，培养温度为25士2°C，光照时间为12h/d 14h/d，光照强度为 1800LX 2000LX ；所述生根培养基的成分为1/2MS培养基+0. 4mg/L的ΝΑΑ+0. 65%重量分 数的琼脂+3%重量分数的蔗糖；
E、驯化与移栽上步所得生根幼苗经室温驯化，然后移栽至基质，即得大量太行菊 幼苗。作为本发明的一种优选技术方案，步骤A所述外植体获取的具体步骤为A-1、种子预处理选取籽粒饱满的太行菊种子，在超净工作台上，于37°C无菌水 浴中浸种2h 4h，处理结束后用无菌吸水纸将材料表面的水分吸干；A-2、接种培养上步所得种子接种到接种培养基上，30d 40d长出2 4片真叶； 所述接种培养基的成分为MS培养基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分数的 琼脂+3%重量分数的蔗糖；A-3、外植体的选择及消毒接种35d 45d后最大叶片可长至2cm 3cm，摘取靠 近顶芽颜色淡绿的幼叶，消毒处理，然后将材料放到无菌培养皿中，在超净工作台上用消过 毒的剪刀剪成小片，即得。作为本发明的一种优选技术方案，步骤E所述驯化与移栽的具体步骤为E-1、驯化上步所得生根幼苗开盖于室温下炼苗七天，每天喷水，保持叶片表面的 湿润，七天后用自来水冲洗干净试管苗根部的培养基并将植株取出，将根浸没于水中放置 三天，使根粗壮；此时苗高5cm 8cm ；E-2、移栽对上步所得生根苗进行移栽，栽苗的基质组分为田园土 营养土 蛭 石=1 1 1，用水浇透基质，使得基质的含水量以手捏指缝中水不滴下为度，移栽时以埋 住根系为准，保持温度在15°C 30°C、湿度在60% 65%，移栽成活率可达95% 100%。作为本发明的一种优选技术方案，步骤A-3中摘取幼叶后的消毒处理步骤为在 超净工作台上，用无菌水将幼叶冲洗2 3遍，75%酒精消毒30s，10% H2O2消毒lOmin，无 菌水冲洗4 5遍，即可。作为本发明的另一种优选技术方案，步骤A-3中摘取幼叶后的消毒处理步骤还可 以为在超净工作台上，用无菌水将幼叶冲洗2 3遍，75%酒精消毒30s，0. 1% NaClO中 浸泡20min，用无菌水冲洗4 5遍，即可。采用上述技术方案所产生的有益效果在于本发明对太行菊组织培养的外植体材 料取得、诱导愈伤培养、增殖继代培养、生根培养、炼苗移栽等的操作及具体实施方法给予 了具体指导，建立了完备的太行菊组织培养体系，具有极强的可实施性与可重复性，能够快 速、大量的繁殖太行菊，成本低廉，成活率高，对保护太行菊物种资源以及对于人类进行系 统科学研究和综合开发利用太行菊植物基因资源，具有重要的实际意义和经济价值。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是自来水冲洗过的太行菊种子。图2是每天12小时光照培养15天的太行菊愈伤组织。图3是继代增殖4次的太行菊。图4是生根培养15天的太行菊苗。图5是开盖于室温下炼苗7天的太行菊。图6是移栽于园田土基质中一个月的太行菊。
具体实施例方式以下实施例详细说明了本发明。制备本发明所使用的各种原料及各项设备均为常 规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中对培养基成分的描述采用“MS培养基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的 6-BA+0. 65%重量分数的琼脂+3%重量分数的蔗糖”的方式，其具体意义为MS培养基作为 主体，其中NAA的含量为0. 2mg/l、6-BA的含量为2. Omg/1、琼脂的重量分数为0. 65%、蔗糖 的重量分数为3%。另外，1/2MS的意义为MS培养基中大量元素含量减半，微量元素含量不变。实施例1太行菊的组织培养快速繁殖方法，其包含以下步骤A、外植体获取A-1、种子预处理选取籽粒饱满的太行菊种子，在超净工作台上，于37°C无菌水 浴中浸种2h 4h，处理结束后用无菌吸水纸将材料表面的水分吸干；A-2、接种培养上步所得种子接种到接种培养基上，每个接种瓶中接种10颗， 30d 40d长出2 4片真叶；所述接种培养基的成分为MS培养基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/ 1的6-BA+0. 65%重量分数的琼脂+3%重量分数的蔗糖；A-3、外植体的选择及消毒接种35d 45d后最大叶片可长至2cm 3cm，摘取 靠近顶芽颜色淡绿的幼叶，在超净工作台上，用无菌水将幼叶冲洗2 3遍，75%酒精消毒 30s, 10% H2O2消毒lOmin，无菌水冲洗4 5遍，然后将材料放到无菌培养皿中，在超净工 作台上用消过毒的剪刀剪成小片，即得；B、诱导愈伤培养上步所得外植体材料转移至诱导愈伤培养基中进行培养，每个接种瓶中接种3个 外植体，设定光照强度为2000LX，光照时长为12h/d，培养至产生愈伤组织；所述诱导愈伤 培养基的成分为MS培养基+0. 5mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+O. 65%重量分数的琼脂+3% 重量分数的蔗糖；C、增殖继代培养选取结构致密、质地脆硬、细胞呈不规则球形或近等径型、生长较慢、颜色为淡绿 色的愈伤组织接种到增殖继代培养基上继代培养，此后每20天继代一次，继代4 5次后 芽体变得茁壮，并逐渐长出绿色小叶，形成完整的太行菊小植株体；所述增殖继代培养基的 成分为MS培养基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分数的琼脂+3%重量分 数的蔗糖；D、生根培养将生长高度在2cm以上的无菌苗，转移至生根培养基，每个接种瓶中接种3 7 个芽，接种时注意保持芽体原有的形态学上下端，使生根端进入培养基，保持植株直立且稳 定，在恒温光照培养室中培养45d，培养温度为25士2°C，光照时间为12h/d 14h/d，光照强 度为1800LX 2000LX ；所述生根培养基的成分为1/2MS培养基+0. 4mg/L的ΝΑΑ+0. 65% 重量分数的琼脂+3%重量分数的蔗糖；E、驯化与移栽E-1、驯化上步所得生根幼苗开盖于室温下炼苗七天，每天喷水，保持叶片表面的湿润，七天后用自来水冲洗干净试管苗根部的培养基并将植株取出，将根浸没于水中放置 三天，使根粗壮；此时苗高5cm 8cm ；E-2、移栽对上步所得生根苗进行移栽，栽苗的基质组分为田园土 营养土 蛭 石=1 1 1，用水浇透基质，使得基质的含水量以手捏指缝中水不滴下为度，移栽时以埋 住根系为准，保持温度在15°C 30°C、湿度在60% 65%，移栽成活率可达95% 100%。参看附图，图1是自来水冲洗过的太行菊种子；图2是每天12小时光照培养15天 的太行菊愈伤组织；图3是继代增殖4次的太行菊；图4是生根培养15天的太行菊苗；图5 是开盖于室温下炼苗7天的太行菊；图6是移栽于园田土基质中一个月的太行菊。上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一 限制条件。
权利要求
太行菊的组织培养快速繁殖方法，其特征在于包含以下步骤A、外植体获取从太行菊无菌苗上采取外植体；B、诱导愈伤培养上步所得外植体材料转移至诱导愈伤培养基中进行培养，设定光照强度为2000LX，光照时长为12h/d，培养至产生愈伤组织；所述诱导愈伤培养基的成分为MS培养基+0.5mg/l的NAA+2.0mg/l的6 BA+0.65％重量分数的琼脂+3％重量分数的蔗糖；C、增殖继代培养选取结构致密、质地脆硬、细胞呈不规则球形或近等径型、生长较慢、颜色为淡绿色的愈伤组织接种到增殖继代培养基上继代培养，此后每20天继代一次，继代4～5次后芽体变得茁壮，并逐渐长出绿色小叶，形成完整的太行菊小植株体；所述增殖继代培养基的成分为MS培养基+0.2mg/l的NAA+2.0mg/l的6 BA+0.65％重量分数的琼脂+3％重量分数的蔗糖；D、生根培养将生长高度在2cm以上的无菌苗，转移至生根培养基，接种时注意保持芽体原有的形态学上下端，使生根端进入培养基，保持植株直立且稳定，在恒温光照培养室中培养30d～60d，培养温度为25±2℃，光照时间为12h/d～14h/d，光照强度为1800LX～2000LX；所述生根培养基的成分为1/2MS培养基+0.4mg/L的NAA+0.65％重量分数的琼脂+3％重量分数的蔗糖；E、驯化与移栽上步所得生根幼苗经室温驯化，然后移栽至基质，即得大量太行菊幼苗。
2.根据权利要求1所述的太行菊的组织培养快速繁殖方法，其特征在于步骤A所述 外植体获取的具体步骤为A-1、种子预处理选取籽粒饱满的太行菊种子，在超净工作台上，于37°C无菌水浴中 浸种2h 4h，处理结束后用无菌吸水纸将材料表面的水分吸干；A-2、接种培养上步所得种子接种到接种培养基上，30d 40d长出2 4片真叶；所 述接种培养基的成分为=MS培养基+0. 2mg/l的NAA+2. Omg/1的6-BA+0. 65%重量分数的琼 脂+3%重量分数的蔗糖；A-3、外植体的选择及消毒接种35d 45d后最大叶片可长至2cm 3cm，摘取靠近顶 芽颜色淡绿的幼叶，消毒处理，然后将材料放到无菌培养皿中，在超净工作台上用消过毒的 剪刀剪成小片，即得。
3.根据权利要求1所述的太行菊的组织培养快速繁殖方法，其特征在于步骤E所述 驯化与移栽的具体步骤为E-1、驯化上步所得生根幼苗开盖于室温下炼苗七天，每天喷水，保持叶片表面的湿 润，七天后用自来水冲洗干净试管苗根部的培养基并将植株取出，将根浸没于水中放置三 天，使根粗壮；此时苗高5cm 8cm ；E-2、移栽对上步所得生根苗进行移栽，栽苗的基质组分为田园土 营养土 蛭石= 1:1: 1，用水浇透基质，使得基质的含水量以手捏指缝中水不滴下为度，移栽时以埋住根 系为准，保持温度在15°C 30°C、湿度在60% 65%，移栽成活率可达95% 100%。
4.根据权利要求2所述的太行菊的组织培养快速繁殖方法，其特征在于步骤A-3中 摘取幼叶后的消毒处理步骤为在超净工作台上，用无菌水将幼叶冲洗2 3遍，75%酒精 消毒30s, 10% H2O2消毒lOmin，无菌水冲洗4 5遍，即可。
5.根据权利要求2所述的太行菊的组织培养快速繁殖方法，其特征在于步骤A-3中摘取幼叶后的消毒处理步骤为在超净工作台上，用无菌水将幼叶冲洗2 3遍，75%酒精 消毒30s, 0. 1% NaClO中浸泡20min，用无菌水冲洗4 5遍，即可。
全文摘要
本发明公开了一种太行菊的组织培养快速繁殖方法，其包含以下步骤A、外植体获取从太行菊无菌苗上采取外植体；B、诱导愈伤培养上步所得外植体材料转移至诱导愈伤培养基中进行培养，至产生愈伤组织；C、增殖继代培养选取结构致密、质地脆硬、细胞呈不规则球形或近等径型、生长较慢、颜色为淡绿色的愈伤组织接种到增殖继代培养基上继代培养；D、生根培养将生长高度在2cm以上的无菌苗转移至生根培养基进行生根培养；E、驯化与移栽上步所得生根幼苗经室温驯化，然后移栽至基质，即得大量太行菊幼苗。本发明对太行菊无菌苗体系的建立给予详细的指导，尤其是给出其诱导愈伤培养基、增殖继代培养基、生根培养基的最佳配方，具有极强的可实施性与可重复性，能够一次繁殖大量太行菊幼苗。
文档编号A01H4/00GK101965799SQ20101054132
公开日2011年2月9日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者孙莉莉, 曾献秋, 苗一帆, 黄进勇 申请人:黄进勇;苗一帆;孙莉莉;曾献秋