专利名称：改进的组织培养方法
若干年来，以组织培养法培养哺乳类细胞这一领域一直是生物科学中许多领域的研究中心。以组织培养培养这类细胞作为生化产物的来源，并供进行生化与生物技术方法的基础研究。哺乳类细胞在组织培养中的生长与近来分子生物学的几乎所有进展密切相关。
因此，当前研究组织培养的方法很重要，许多科学家正在研究组织培养的条件及组织培养细胞内发生的一些机理。
本发明属于生化领域，具体地说是属于组织培养领域。
本发明提供一种在无血清组织培养基中培养哺乳类细胞的方法，所述哺乳类细胞适于在组织培养中生长，并对组织培养基中所存在的胰岛素呈阳性反应，所述组织培养基含有约0.1至约10，000毫微克精氨酰-A-O-胰岛素/毫升。
本发明还提供一种适于在组织培养方法中培养哺乳类细胞的无血清组织培养基，它含有约0.1～约10，000毫微克精氨酰-A-O-胰岛素/毫升。
本发明的特征是以精氨酰-A-O-胰岛素(AAO-胰岛素)用作培养哺乳类细胞的组织培养基的生长促进剂。AAO-胰岛素是从人胰岛素原制备人胰岛素(HI)过程中的付产品，所述方法已详细发表，并以与可分裂的先导顺序共价连接的人胰岛素原开始，所述先导顺序由为此目的进行了遗传改造的微生物合成(Frank，B.H.，andChance，R.E.(1983)Munch.Med.Wschr.，125(Suppl.1)14-20.Frank，B.H.，andChance，R.E.(1985)Symposium“QuoVadis？”，Sanofi，May29-30，Toulouse-Labege，France，pp.138-146.Frank，B.H.，Petee，J.M.，Zimmerman，R.E.，andBurck，P.J.(1981)inPeptidesSynthesis-Structure-Function.ProceedingsoftheSeventhAmericanPeptideSymposium.D.H.RickandE.Grosseds.，PierceChemicalCo.，Rockford，Ill.，pp.729-738.)胰岛素原用胰酶和羧肽酶B切割，最好在金属离子存在下，如欧洲专利公报0264250(美国专利申请06/917939)所述。
众所周知，人胰岛素由一条30个氨基酸的B链与一条21个氨基酸的A链通过二硫桥连接而构成，所述二硫桥在A-7位与B-7位及A-20位和B-19位连接半胱氨酸。人胰岛素原是一种含有86个氨基酸的蛋白质，其中在HI的A-1位的甘氨酸通过一个内部连接肽(一个35个氨基酸的链)被连接到B-30位的苏氨酸上。所述连接肽在人胰岛素原转化成HI的过程中被切割而除去。
所述切割过程当然并不完全，不完全切割产生一些付产物，其中一种是精氨酰-A-O-胰岛素，它不同于HI，它在人胰岛素氨基端A-1位额外地连接了一个精氨酰基。该付产物可通过阳离子交换层析与HI分离，如下列制备1所示。
有趣的是AAO-胰岛素在体内降低兔血葡萄糖的作用比HI弱。在兔的测试中，AAO-胰岛素的效力为HI的75%(摩尔对摩尔)。但是，AAO-胰岛素至少在刺激组织培养中哺乳类细胞的生长方面同胰岛素一样有效。
当生物学家和生物化学家最初开始在组织培养方法中培养哺乳类细胞时，在含有5-10%浓度的动物血清的组织培养基中培养这些细胞已成为常规。血清给细胞提供了大量的营养物，许多重要的实验都是在这类培养中进行的。但是，由于需要更精确的实验，人们已在合成培养基中培养组织培养细胞，其中所有的组成成分都是经纯化并准确定性的化学物质。为了许多细胞的适当生长而应该或必须加到合成培养基中的一种物质便是胰岛素。
例如，下列细胞类型为文献中已描述过的对加入胰岛素的组织培养基呈阳性反应的类型。
大鼠垂体癌细胞人颈癌细胞犬肾癌细胞大鼠成神经细胞瘤小鼠黑素瘤大鼠神经胶质瘤人乳腺癌细胞大鼠卵巢小鼠胚胎癌细胞小鼠睾丸人结肠癌细胞Balb/c小鼠胚胎大鼠成肌细胞人肺表皮样癌细胞仓鼠肾人成纤维细胞人表皮样癌细胞大鼠甲状腺小鼠胚小鼠淋巴绵羊脂肪细胞显然，胰岛素是培养哺乳类细胞的培养基中的一种必要的共同因子。在培养所有受培养基中胰岛素刺激的哺乳类细胞时都需使用本发明。因此，所用细胞的性质和来源不限制本发明。
组织培养基也不是限制因素。30多年来，无血清组织培养基已被广泛研究及公开。为方便读者，下列文献可作为关于培养基资料的来源，并作为本文的参考文献。
JaymeandBlackman，CultureMediaforPropagationofMammalianCells，VirusesandOtherBiologicals，AdvancesinBiotechnologicalProcesses5，1-30，A.R.Liss，Inc.(1985)HamandMcKeehan，MethodsEnzymol.58，44-93(1979)TheGrowthRequirementsofVertebrateCellsInVitro，Waymouth，HamandChapple，Eds.，CambridgeUniversityPress(1981)MethodsforSerum-FreeCultureofCellsoftheEndocrineSystem，Barnes，SirbaskuandSato，Eds.，A.R.Liss，Inc.(1986)
一般说来，用于哺乳类细胞的无血清培养基由许多成份构成，它们包括必需氨基酸如精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸等;非必需氨基酸如丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸等;及氨基酸衍生物如谷胱甘肽、羟脯氨酸、丁二胺等。这类培养基通常还含有维生素如叶酸、生物素、烟酰胺、泛酸、吡多醇、核黄素及维生素B12。使用碳水化合物如葡萄糖和丙酮酸，常用的还有核酸衍生物如腺嘌呤、次黑嘌呤和胸腺嘧啶。
这类培养基含有一种类脂源如胆碱和异肌醇，无机离子包括钙、镁、钠、磷酸根等。还常含有无机微量元素如钴、铁、硒和锌。培养基通常是缓冲的以维持所需的pH，经常用碳酸氢根离子或二氧化碳气体缓冲。上面引用的Ham和Mckeehan的文章便是已通过使用证实的并在本领域内公知的一个培养基配方的特别好的来源。在《TCA手册》(theTCAManual，theTissueCultureAssociation出版，12111ParkLawnDrive，Rockville，MD.20852)中可找到关于组织培养基的更详细的描述。
如上所述，AAO-胰岛素是作为从人胰岛素原制备HI的付产品而发现的，因此，只需从不纯的HI产品中分离便可容易地得到而用于本发明。下面的制备为用于上述分离的层析方法和用于纯化AAO-胰岛素的结晶步骤。
制备1层析将含有AAO-胰岛素和HI的混合物溶于32ml含有7M脲、0.05M醋酸钠和0.1M氯化钠的缓冲液(pH3.8)中。用硫代丙基TRISACRYL树脂(Rhone-Poulenc的分部ReactifsIBF制造，颗粒大小为40-80微米)装1×15cm层析柱。将AAO-胰岛素溶液上柱，用9倍于柱体积的梯度缓冲液洗脱，所述缓冲液的组成与上面的相同，只是氯化钠浓度升到0.2M。流速为1ml/分。从柱中的流出液通过在280nm处的吸收而监测。发现胰岛素最先流出，它基本上在梯度洗脱开始后的最初70ml中洗出。然后AAO-胰岛素流出，在洗出液的72～105ml中收集，得到基本没有HI污染的富含AAO-胰岛素的部分。
结晶840ml的AAO-胰岛素产品溶液，含有2.32gAAO-胰岛素，用10%NaOH将其pH调至8.0。用截留分子量为3000的膜将溶液在4℃下浓缩至260ml，然后将浓缩液对280ml去离子水透析。将溶液稀释至蛋白浓度为2g/l，并加入16.2ml冰醋酸和850ml去离子水，制成0.25M溶液(在醋酸中)。然后使其升温至23℃，并加入0.93ml的20%氯化锌水溶液。用浓氢氧化铵将pH调至6.0，然后在23℃下搅拌该混合物4小时。然后冷却到4℃，并在此温度下静止保温16小时。然后倾出上清液，将剩余的稠的结晶浆离心。所得的结晶用纯水洗两次。然后再用无水乙醇洗两次，每次用23ml。将结晶在室温下真空干燥，得到2.11g基本纯净的AAO-胰岛素。
实例1在一种无血清培养基中，用AAO-胰岛素培养中国仓鼠卵细胞，所述培养基已被证明对培养这类细胞有效。培养基由三份Dulbecco′s修改的Eagle′s培养基(DME)和一份(体积)F12培养基组成，还加入了10-8M硒、50μM乙醇胺、20mM羟乙基哌嗪乙磺酸和1μg/ml人铁传递蛋白。下表所述的AAO-胰岛素的量以各种比例加入培养基，在12孔的Corning培养皿中培养细胞，培养皿用昆布氨酸(一种促进细胞在培养孔上附着和分散的蛋白)预处理。每一种条件都重复进行。
每个装满培养基的培养孔在实验的0天接种25，000个细胞，在第6天用Colter计数器计数。在这些实验中用了4批不同的AAO-胰岛素，AAO-胰岛素以0.1N盐酸溶液形式加入培养基，其浓度在所有情况中都以毫微克/毫升表示。
对照实验不向培养基中加入胰岛素或AAO-胰岛素，细胞的数目为10，000～200，000细胞/孔。培养在含有HI或小牛胰岛素(而不是AAO-胰岛素)的同样培养基中的同样的细胞，生长情况和本文所描述的实验一样。
AAO-胰岛细胞数(x1，000)素浓度批批批批ng/mlABCD0.2538028027033013703603302702.54804204203801054055054047025600600530510100670640580580上述实验表明了AAO-胰岛素刺激细胞生长的有效性，所述细胞是在组织培养中对胰岛素有反应的细胞。的确，在这些实验中，根据AAO-胰岛素的浓度不同，每孔的细胞平均数增加到240，000～610，000。
权利要求
1.一种适于培养哺乳类细胞的无血清组织培养基，它含有约0.1～10，000毫微克的精氨酰-A-O胰岛素/毫升。
2.权利要求1的培养基，其中精氨酰-A-O胰岛素的浓度约为1～1，000毫微克/毫升。
3.权利要求2的培养基，其中精氨酰-A-O胰岛素的浓度约为1～100毫微克/毫升。
4.一种在权利要求1所述的组织培养基中培养哺乳类细胞的方法，所述哺乳类细胞适于在组织培养中生长，并对组织培养基中存在的胰岛素呈阳性反应。
5.一种在权利要求2所述的组织培养基中培养哺乳类细胞的方法，所述哺乳类细胞适于在组织培养中生长，并对组织培养基中存在的胰岛素呈阳性反应。
6.一种在权利要求3所述的培养基中培养哺乳类细胞的方法，所述哺乳类细胞适于在组织培养中生长，并对组织培养基中存在的胰岛素呈阳性反应。
全文摘要
将精氨酰-A-O胰岛素，一种由人胰岛素原用生物技术合成人胰岛素过程中的副产品，加入无血清组织培养基中，以刺激哺乳类细胞的生长，所述哺乳类细胞在组织培养中对胰岛素呈阳性反应。
文档编号C12N5/00GK1045125SQ9010096
公开日1990年9月5日 申请日期1990年2月26日 优先权日1989年2月27日
发明者沃尔特·弗朗西斯·普劳蒂 申请人:伊莱利利公司