组培苗蔗糖利用率的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组培苗蔗糖利用率的测定方法，属于植物生物技术领域。 技术背景
[0002] 植物的组织培养是当前生物技术中的最基本的技术和手段，现已被广泛应用到园 艺、农业和林业生产中。它是一种在人为提供的一定温度、光照、湿度、营养、激素等条件下 快速繁育植物的技术。
[0003]在植物组织培养过程中，组培苗的生长方式有三种：一是小植株靠光合作用进行 的自养生长;二是小植株靠培养基中的有机碳源进行异养生长;三是小植株既靠培养基中 的有机碳源又靠人工光照，同时进行异养和自养的兼养生长。现在常规的植物组织培养快 繁技术大多数是以第三种方式进行。因此蔗糖成为组织培养过程中不可或缺的碳源和能 源，且在目前组织培养中用量最大。所以判断组培过程中蔗糖的利用率为组培的培养基调 控提供了理论依据。同时组培苗的自养能力决定了组培苗生长的情况，仅异养生长的组培 苗，将会导致植株生理、形态上的紊乱，造成生长发育延缓或死亡，引起玻璃化、生根困难等 问题。由此可见，组培苗的自养作用是其良好地生长发育的基础。
[0004] 因此，组培苗自养份额的测定和蔗糖利用率的测定就显得特别重要，目前虽然有 用Li-840型C02/H 20分析仪建立的CO2交换速率测定系统来测定组培苗的自养能力，但是测 的只是瞬时的自养能力，不能代表一段时间内组培苗自养能力的情况，更不能测定出一段 时间内组培苗的自养份额和异养份额和来自组培苗呼吸所贡献的份额。组培苗自养份额的 测定和蔗糖利用率的测定对培养基的优化具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是:提供一种组培苗在一个培养周期(例如增殖培养）中 各种份额的测定方法;结合组培苗的异养份额，计算出组培苗的蔗糖利用率。为组培过程中 各种环境因子的调控，培养基组成，激素配比等提供理论依据。
[0006] 本发明的技术方案：
[0007] 它包括以下步骤：
[0008] 第一，培养瓶采用完全透气的封口膜封口，分别用C3植物蔗糖和C4植物蔗糖作为 有机碳源配制C3植物蔗糖培养基和C4植物蔗糖培养基；
[0009] 第二，测定上述C3植物蔗糖和C4植物蔗糖的S13C值，C3植物蔗糖的S13C值记为δ τ，〇4 植物蔗糖的S13C值记为Sc;
[0010] 第三，选取长势一致的组培苗，记录它们的鲜重Μ〇,分别接种到C4植物鹿糖培养基 和C3植物蔗糖培养基，培养至鲜重增重超20倍后，结束培养；
[0011] 第四，同期，一方面将待测植物的组培苗分别培养在无〇)2的03植物蔗糖培养基和 C4植物蔗糖培养基中；另一方面利用pH为5.5的营养液在待测环境中对长有2片展开叶的待 测植物进行溶液培养；
[0012] 第五，分别获取培养前C4植物蔗糖和C3植物蔗糖培养基的蔗糖浓度CO和体积Vo，培 养结束后培养基的C4植物蔗糖和C3植物蔗糖浓度c和体积V，根据蔗糖浓度和体积的变化的 计算出鹿糖的消耗。鹿糖的消耗C = CO X VQ-C X V ;
[0013] 第六，测定培养结束后的组培苗鲜重M。计算出组培苗的增重为B=M-M0;
[0014]第七，获取培养结束后的用C4植物蔗糖培养基和C3植物蔗糖培养基培养的组培苗 新生叶片的S13C值Sgi和δτ1;
[0015] 第八，获取培养结束后的在无〇)2的03植物蔗糖培养基和C4植物蔗糖培养基中培 养的组培苗新生叶片的S 13C值δ?和δτο;
[0016] 第九，获取培养结束后在溶液培养中的待测植物新生叶片S13C值Sair;
[0017] 第十，测定培养期间的待测培养环境中空气中的二氧化碳S13C值
[0018] 第^^一，依据δ?和δτ〇以及δτ和6(；计算出待测植物的组培苗利用C4植物蔗糖和C3植 物鹿糖产生碳同位素分馏值Δ G和Δ τ，Δ G = 5G -δ?，Δ τ=δτ-δτο。
[0019] 第十二，依据Sair和33计算出待测植物利用空气二氧化碳的分馏值Aair; Aair = Sa 5air;
[0020] 第十三，将上述所得数据，δτ、δ(；、Δ G、Δ T、Δ air、δα、δτ1、代入方程：
H十算出异养份额fb;
[0021] 第十四，根据上述计算得到的fb，结合组培苗的增重B和蔗糖消耗C，计算组培苗蔗 糖利用率A。鹿糖利用率A的计算公式为:f bXB = AXC，即A=fbXB/C。
[0022] 本发明的优点
[0023] 在植物组织培养过程中，组培苗通常是进行兼养生长，因此，就得额外提供蔗糖作 为有机碳源。蔗糖是培养过程中用量最大的营养物质，所以监测组培苗蔗糖利用率对节约 生产成本具有重要意义。稳定碳同位素可以示踪营养源。因此，通过稳定碳同位素技术，就 可以计算出组培苗的自养和异养份额和来自组培苗呼吸所贡献的份额;根据计算得到的组 培苗异养份额，结合组培苗的增重和蔗糖消耗，就可以计算出组培苗的蔗糖利用率。
[0024] 自然界中碳元素有两种稳定同位素：12C和13C，它们的天然平均丰度分别为 98.89%和1.11 %。稳定碳同位素组成通常用δ13(Χ%。)表示，自然界中S13C的变化为_90%〇~ +20%〇 〇
[0025] 分别选用C3植物和C4植物的蔗糖作为有机碳源。C3植物S13C的变化范围为-20%。~-35%。，C 4植物S13C的变化范围为-9%。~-17%。X3植物的代表性蔗糖是甜菜蔗糖，C 4植物的代 表性蔗糖是甘蔗蔗糖。
[0026] 组培苗在生长过程中会利用有机碳源和无机碳源来生长，因此就会造成新生叶片 的S13C值既有来自有机碳源的组分(异养来源），又有来自无机碳源的组分（自养来源），其 中，自养份额包括组培苗自身呼吸作用的份额fc和来自利用空气的份额fa，即fa= 1-fb- fCo
[0027] 因此，利用三端元的同位素混合模型就可获取组培苗利用有机碳源的份额。
[0028]三端元的同位素混合模型可以表示为：
[0029] 6Gl = fb(5G- Δ G)+fc(SGl- Δ air) + ( l_fb_fc)5air ( I )
[0030] 5xi = fb(5x- Δ τ)+?〇(δτι- Δ air) + ( l_fb_fc)5air (2)
[0031] 这里的δα为甘蔗蔗糖作为碳源培养的新生组培苗叶片的S13C值;δη为甜菜蔗糖作 为碳源培养的新生组培苗叶片的S 13C值;Sair为待测植物以空气二氧化碳为碳源培养的新生 叶片的S13C值;S g为甘蔗蔗糖的S13C值;δτ为甜菜蔗糖的S13C值；Ag为组培苗利用甘蔗蔗糖产 生的同位素分馏值。A τ为组培苗利用甜菜蔗糖产生的同位素分馏值。Aair为待测植物以空 气二氧化碳为碳源培养产生的同位素分馏值。
[0032]联立方程(1)和方程(2)，求解得到：
[0033]
[0034]
[0035] 根据计算得到的fb，结合组培苗的增重和蔗糖消耗，就可以计算出组培苗蔗糖利 用率A。鹿糖利用率的计算公式为:f bXB = AXC，即A=fbXB/C。
[0036] 本方法采用的步骤少，计算简单，准确，能定量测定组培苗一个生长周期内的各种 份额，如自养份额、异养份额等，同时能计算出组培苗在一个培养周期内蔗糖利用率，对组 培环境因子的调控具有重要的指导价值，为后期组培苗的驯化和移栽提供技术参数。
【具体实施方式】
[0037]本发明的实施例：
[0038] 第一步骤，选用两种S13C值差较大的C3植物的代表性蔗糖甜菜蔗糖和C4植物的代 表性蔗糖甘蔗蔗糖作为有机碳源，分别测定其S 13C值，甜菜蔗糖的S13C值记为δτ，甘蔗蔗糖的 S13C值记为Sc;用这两种蔗糖同时培养被考察组培苗，培养条件完全一样，区别在于一个是 以甜菜蔗糖为有机碳源，另一个是以甘蔗蔗糖为有机碳源。分别计算出培养前甘蔗蔗糖和 甜菜蔗糖培养基的蔗糖浓度(Co)和体积(Vo)，培养结束后测定培养基的甘蔗蔗糖和甜菜蔗 糖浓度(c)和体积(V)，根据蔗糖浓度和体积的变化的计算出蔗糖的消耗。蔗糖的消耗C = C0 Xv〇-c XV；
[0039] 第二步骤，选取长势一致(鲜重为Mo)的组培苗分别培养在甜菜蔗糖和甘蔗蔗糖培 养基上，培养一个月后（增重20倍以上），测定其鲜重M。计算增重B = M-Mo。同时取一定量的 组培苗新生叶片，测定其稳定碳同位素组成S13C值。用甜菜蔗糖培养的组培苗新生叶片的 S13C值记为δτ1，用甘蔗蔗糖培养的组培苗新生叶片的S13C值记为S ci;
[0040] 第三步骤，同期将油菜组培苗分别培养在无 CO2气体培养瓶内（用碱石灰吸收空气 中的CO2和植物自身呼吸产生的CO 2)，分别用甜菜蔗糖和甘蔗蔗糖培养一个月，然后测定新 生叶片的S13C值。计算出油菜组培苗利用有机碳产生碳同位素分馏Δ (；和Δ τ，Δ G = SG - SG0， Δ T= δτ-δΤ()。在进行组培苗各份额计算时，扣除分馏值；
[0041] 第四步骤，在培养室萌发种子(种子与组培苗所用种子相同），待幼苗长出两片子 叶后用PH为5.5霍格蓝培养液培养植物，同期培养一个月后，取新生叶片，烘干，磨成粉末后 测定其S 13C值，记为Sair;同时测定培养室空气中二氧化碳的S13C值，记为计算得到A air， A air - 5a-5air ;
[0042] 第五步骤，计算被考察组培苗在各培养条件下的有机碳利用份额，将甜菜蔗糖的 S13C值记为δτ，由甜菜蔗糖做为有机碳源的组培苗新生叶片的S13C值记为δη;将甘蔗蔗糖的 S13C值记为Sc，由甘蔗蔗糖做为有机碳源的组培苗新生叶片的S13C值记为S ci;用霍格蓝培养 液培养植物的叶片的S13C值记为Sair和霍格蓝培养液培养植物利用空气二氧化碳产生的分 馏Δ air;油菜组培苗利用有机碳产生碳同位素分馏△ G和△ τ;带入方程(3)和方程(4)，计算 出各个培养条件下组培苗利用有机碳源的份额，即异养份额。还可以计算得到组培苗利用 呼吸作用产生的二氧化碳的份额f。，同时还可得到组培苗利用空气二氧化碳的份额f a;
[0043] 第六步骤，根据计算得到的fb，结合组培苗的增重和蔗糖消耗计算组培苗蔗糖利 用率(表征为字母A)。蔗糖利用率的计算公式为:f bXB = AXC，即A=fbXB/C。
[0044] 本发明的实施效果如下：
[0045] 培养材料:甘蓝型油菜组培苗
[0046] 培养基配方为:13+6-8六2.〇11^/1+祖4 0.111^/1，其中进行不同氮源及氮浓度配比 实验，其它实验条件完全一致。pH值:5.8，琼脂:7.5g/L，培养温度:25 ± 2 °C。光周期：12h/d， 光照强度:30001x。
[0047] 分别用甘蔗蔗糖和甜菜蔗糖作为有机碳源，其稳定碳同位素值为：甘蔗蔗糖-12.00%〇(PDB)，甜菜蔗糖-24.64%q(PDB)。测定的待测植物新生叶片的S 13C值（Sair)为-35.97%。，培养室空气CO2的S13C值队)为-15.75%。，因此待测植物利用