专利名称：：一种橡胶树蔗糖转化酶及其编码基因的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种橡胶树蔗糖转化酶及其编码基因与应用。
背景技术：
：蔗糖转化酶(β-D-呋喃果糖苷酶)催化蔗糖不可逆地降解为葡萄糖和果糖。在高等植物中，蔗糖转化酶是一个中等大小的基因家族，包含十几个到二十几个基因。根据亚细胞定位不同，蔗糖转化酶分为细胞壁、液泡和胞质三类。根据最适酶活PH值的不同，又可将蔗糖转化酶分为酸性和中性/碱性两类，其中细胞壁和液泡蔗糖转化酶属于酸性转化酶(Ac-Inv)，最适酶活ρΗ值为4.55.0，胞质蔗糖转化酶的最适酶活ρΗ值为7.08.0，属于中性/碱性蔗糖转化酶(Ν/Α-Ιην)。许多研究证实，植物蔗糖转化酶广泛参与韧皮部装载和卸载、生长发育调节、生物和非生物胁迫应答，并且在光合产物同化碳分配中起核心调控作用，是决定作物经济产量的关键酶。早期蔗糖转化酶的研究集中在Ac-Inv上，而对Ν/Α-Ιην的研究较少。近几年，有关Ν/Α-Ιην的研究不断增多，许多研究证实这类转化酶在一些大量需求单糖或己糖的生物过程，如产能和生物合成中发挥重要作用。Wang等人(2000)指出，在缺水条件下Ν/Α-Ιην可能参与控制甘薯细胞中的碳水化合物分配和能量产生(WangHL，LeePD,ChenWL，HuangDJ,SuJC.2000.Osmoticstress-inducedchangesofsucrosemetabolisminculturedsweetpotatocells.JExpBot51:1991-1999)；Fernandes等人(2004)发现，在盐胁迫条件下，白花羽扇豆的Ν/Α-Ιην酶活性和葡萄糖消耗同时增加了，推测这样可保障ATP和NAD(P)H的持续供给，是避免或修复盐渍伤害所必需的(FernandesFM,ArrabacaMC,CarbalhoLMM.2004.SucrosemetabolisminLupinusalbusL.undersaltstress.BiolPlant48:317_319)；在桃树中，推测N/A-Inv的活性在控制果实中的糖含量，以及果实生长发育中发挥重要作用(NonisAjRupertiB,FalchiR,CasattaE,EnferadiST,VizzottoG.2007.Differentialexpressionandregulationofaneutralinvertaseencodinggenefrompeach(Primuspersica)-evidenceforaroleinfruitdevelopment.PhysiologiaPlantarum129:436-446.)；Kim等人(2007)的研究显示，在盐胁迫条件下，蔗糖降解产物可能通过一个复杂的代谢网络最终产生氨基酸和甘氨酸甜菜碱，而这些物质是参与逆境胁迫(如缺水或冷胁迫)应答的高效植物细胞渗透调节剂(KimJK,BambaT，HaradaK，FukusakiE，KobayashiA.2007.Time-coursemetabolicprofilinginArabidopsisthalianacellculturesaftersaltstresstreatment.J.Exp.Bot.58415-424)；Vargas等人(2007)的研究发现，由Ν/Α-Ιην催化的蔗糖降解可能是植物为满足高能需求和合成化合物以应对不良环境所产生的一种普遍性应答机制的早期反应(VargasWA,PontisHG,SalernoG.2007.Differentialexpressionofalkalineandneutralinvertasesinresponsetoenvironmentalstresses!characterizationofanalkalineisoformasastress-responseenzymeinwheatleaves.Planta2261535-1545)。天然橡胶(顺式-1，4_聚异戊二烯，橡胶烃)是一种重要的工业原料和不可或缺的军工原料，在世界经济发展中扮演重要角色。目前，巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源。橡胶生物合成是在一种特化的细胞(乳管)中进行，并且是其主要的细胞代谢活动，橡胶烃占其细胞质(胶乳)干重的90%以上。TupyJ等人(TupyJ.1969.Stimulatoryeffectsof2,4-dichlorophenoxyaceticacidandof1-naphthylaceticacidonsucroselevel,invertaseactivityandsucroseutilizationinthelatexofHeveabrasiliensis.Planta(Berl.)88144-153；TupyJ.1973.TheregulationofinvertaseactivityinthelatexofHeveabrasiliensisMuell.Arg:theeffectsofgrowthregulatorsbarkwounding,andlatextapping.J.Exp.Bot.24516~524；TupyJ.&PrimotL1976.ControlofcarbohydratemetabolismbyethyleneinlatexvesselsofHeveabrasiliensisMuel.Arg.Inrelationtorubberproduction.BiologiaPlantarum18,373-384；TupyJ.1985.SomeaspectsofsucrosetransportandutilizationinlatexproducingbarkofHeveabrasiliensis(Miill.Arg.).BiologiaPlantarum27,51-64；TupyJ.1989.Sucrosesupplyandutilizationforlatexproduction.InPhysiologyofRubberTreeLatex(edsJ.dfAuzac，J·LJacob&H.Chrestin),pp.179-199.C.R.C.PressiBocaRaton,FL.)多年的生理生化研究证实蔗糖转化酶是橡胶树胶乳代谢的限速酶；该酶定位于细胞质，最适酶活PH值为7.25^7.40，属于中性/碱性蔗糖转化酶；该酶活性受橡胶产量刺激剂，如乙烯利和2，4-D刺激上调，是决定胶乳(橡胶)产量的关键酶。但是，未见任何有关橡胶胶乳蔗糖转化酶基因克隆与研究的相关报道。
发明内容本发明的目的是提供一种蔗糖转化酶及其编码基因与应用。本发明所提供的蔗糖转化酶，来源于大戟科橡胶属的巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)，名称为HbNIN2，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖转化酶功能的由序列1衍生的蛋白质。序列表中的序列1由557个氨基酸残基组成。所述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。为了使(a)中的HbNIN2便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列raipf^ijPoly-Arg5_6(通常为5RRRRR个)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的HbNIN2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的HbNIN2的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。所述蔗糖转化酶(HbNIN2)的编码基因也属于本发明的保护范围。所述蔗糖转化酶(HbNIN2)的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蔗糖转化酶的DNA分子；3)与序列表中SEQIDNa2的核苷酸序列具有80%以上的同源性的且编码蛋白具有蔗糖转化酶功能的核苷酸序列。序列表中的序列2由2146个核苷酸组成。所述严格条件可为在0.IXSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜。含有所述蔗糖转化酶编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。本发明的具有蔗糖转化酶活性，转入植物或微生物中，可提高其对蔗糖利用效率，从而提高产量。图1为HbNIN2的系统进化分析.杨树(Populustrichocarpa)蔗糖转化酶PtVINl,PtVIN2,PtVIN3,PtCIN3,PtCIN4,PtNIN9,PtNINlO和PtNmi2的详细信息见已发表文献(BocockPN,MorseAM,DervinisCandDavisJM.2008.EvolutionanddiversityofinvertasegenesinPopulustrichocarpa.Planta227(3):565-76.)图2为HbNIN2的原核表达分析.箭头所示条带为受IPTG诱导后所产生的特异表达的目标蛋白图3为HbNIN2基因的组织特异性表达分析图4为割胶对HbNIN2基因表达的影响图5为脱落酸处理对HbNIN2基因表达的影响图6为水杨酸处理对HbNIN2基因表达的影响图7为乙烯利处理对HbNIN2基因表达的影响具体实施例方式下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、蔗糖转化酶及其编码基因的获得及其效果验证我们首次克隆了橡胶树胶乳蔗糖转化酶基因的全长cDNA，并进行了序列分析和功能研究。1.蔗糖转化酶及其编码基因的获得在我们建立的橡胶树胶乳EST序列数据库，发现蔗糖转化酶基因的EST片段，进一步利用cDNA末端的快速扩增技术(RACE)，最终获得包含完整读码框的cDNA序列。具体方法如下<1>保守片段获得通过搜索我们建立的已经注释好的橡胶树胶乳EST序列数据库，发现一段SOObp上下的蔗糖转化酶基因的EST片段。根据Genetyx软件分析，该EST片段已经包括完整的3’末端序列，5’末端序列尚不完全。<2>5，端RACE根据蔗糖转化酶基因的EST片段设计5’RACE引物(第一轮5，CCTTGCCTGTTTACCGAT3，；第二轮5，CTCCTCCCAGCGAGATTC3，)，通用引物QT,QO和Ql的序列及RACE操作流程参照文献(迪芬巴赫CW，德维克斯勒GS.PCR技术实验指南.黄培堂译.北京科学出版社，1998:268277)。进行5，RACE时，以Randomprimer反转录进行cDNA第一链合成，反应产物经乙醇沉淀去除多余dNTP和引物后，利用末端转移酶TdT催化加polyA尾巴。第一轮扩增以加尾的巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)第一链cDNA为模板，使用引物QT、QO和第一轮引物(5’-CCTTGCCTGTTTACCGAT-3’)，终浓度分别为0.04μmol/L、0.41111101/1和0.41111101/1，在25111反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为首先，94°C变性5min，50°C退火2min，72°C延伸40min；然后，94°C变性Imin，54°C退火Imin，72°C延伸lmin，共30次循环；最后，72°C延伸lOmin。PCR产物稀释100倍后，取1μ1稀释产物作为模板，使用终浓度均为0.4μmol/L的Ql和第二轮引物(5’-CTCCTCCCAGCGAGATTC-3’)进行第二轮嵌套扩增，PCR扩增程序为94°C预变性5min；94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30次循环；72°C延伸lOmin。获得两段段1400bp和800bp左右的核苷酸片段。根据测序结果分析，只有SOObp大小核苷酸片段是RACE扩增结果。但拼接后的序列经NCBI的BLAST工具进行同源比对后发现5’端长度不够，即又重新在此SOObp序列间设计RACE引物(第一轮AGTCAATATAAGCCTCATCC；第二轮ACTTGGTATATGCACGCAGC)再次做PCR，扩增程序同5，RACE。第二次RACE获得一段850bp左右的核苷酸片段。<4>HbNIN2cDNA全长克隆根据上述所得到的巴西橡胶树HbNIN2基因的cDNA部分片段，5，端和3，端序列，利用SECentral软件进行序列拼接，得到HbNIN2基因全长cDNA的拼接序列。根据拼接序列，分别在5’末端和3’末端各设计一条引物(2-1F(正义链引物)5，-ATTCATCGTCTCTTCGCCG-3，；2_2146R(反义链引物)5，-GTCCTTGGCGATGAAGATAA-3，)。以巴西橡胶树热研7-33-97的第一链cDNA为模板，使用Taqpluspolymerase进行PCR扩增，引物终浓度均为0.4μmol/L，扩增程序为94°C预变性3min；94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸2.5min，共30次循环；72°C延伸lOmin。将该PCR获得的片段克隆到pMD18_T载体进行测序，经测序表明获得获得片段大小为2146bp的cDNA全长序列。该获得的片段即为本发明的蔗糖转化酶基因基因，该片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，序列表中序列1全长为2146个核苷酸(nt)，包含一个长度为1674个核苷酸的开放阅读框(ORF，自序列2的5'端第179-1852位核苷酸序列)、178nt的5，-UTR(自序列2的5'端第1-178位核苷酸序列)和294nt的3，_UTR(自序列2的5'端第1853-2146位核苷酸序列)，推测编码一个长度为557个氨基酸(序列表中序列1)、分子量为63.6KDa的蛋白，即为蔗糖转化酶HbOTN2，将该蔗糖转化酶基因命名为HbOTN2。将上述含有序列2的核苷酸的PMD18-T重组载体命名为pMD18-HbNIN2。我们分别从杨树和拟南芥中挑选8个(BocockPN,MorseAM,DervinisCandDavisJM.2008.EvolutionanddiversityofinvertasegenesinPopulustrichocarpa.Planta227(3):565_76·)和6个不同类别(酸性和中/碱性)的蔗糖转化酶氨基酸序列，以及两个蓝细菌(Anabaenasp.)(VargasW,CuminoA,SalernoGL.2003.Cyanobacterialalkaline/neutralinvertases.Originofsucrosehydrolysisintheplantcytosol？Planta216:951-960)的蔗糖转化酶氨基酸序列作为模板，来分析HbNIN2的系统进化地位。利用ClustalX(version1.81)软件对这17个蔗糖转化酶蛋白序列进行多重比对，并用TreeView[Win32](version1.6.6)构建系统进化树(图1)。从图上可清楚看出，这些蔗糖转化酶可以分为两个进化枝，中性/碱性蔗糖转化酶属一个进化枝，而酸性(细胞壁和液泡)蔗糖转化酶形成另外一个进化枝。HbNIN2与植物中性/碱性蔗糖转化酶聚在一起，进一步证实它是中性/碱性蔗糖转化酶。利用不同在线软件(Predotar，TargetP和PS0RT)分析了这个橡胶树蔗糖转化酶的亚细胞定位，结果显示它可能定位在胞液，即胶乳的C-乳清中，这表明它是胶乳代谢主要蔗糖转化酶的编码基因。表2为HbNIN2亚细胞定位的预测。同时，比较分析了两个细胞定位已知的植物蔗糖转化酶拟南芥的CINVl(定位在胞液中)和水稻的OsNim(定位在线粒体中)。表2.HbNIN2亚细胞定位的预测蛋白__预测软件_PredotarTargetP__PSORT_HbNIN2__无信号肽无信号肽胞液或叶绿体CINl(Atlg35580)无信号肽无信号肽胞液_OsNINl_线粒体线粒体线粒体_2.原核表达与重组蛋白的活性分析利用pET28a(张一折等.应用pET系统表达rhIFN-α2b基因的研究.中国生物制品学杂志.2003年.第03期)构建了HbNIN2基因的原核表达载体，具体方法如下<1>含巴西橡胶树HbNIN2基因编码区重组载体的获得通过Genetyx软件分析HbNIN2基因的编码区限制性内切酶酶切位点，确定两个HbNIN2基因编码区修饰用的限制性内切酶(NdeI和Sail)。设计HbNIN2基因编码区引物(2-N5，-CCATATGATGGATGGGACTAAAGAGG-3，(正义链引物，下划线标注的是NdeI酶切位点))，2-S:5，-CGTCGACTTAGCAAGTCCAAGAAGAA-3，(反义链引物，下划线标注的是SalI酶切位点)；该引物对扩增的片段具有序列表中序列)，以pMD18-HbNIN2为模板，进行PCR扩增，扩增程序为95°C预变性3min；94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30次循环；72°C延伸IOmin0扩增得到1674bp的产物，测序表明该片段具有序列表中序列2的第179-1852位核苷酸序列。将该片段用与PMD18-T连接，获得pMD-HbNIN2重组质粒，经测序确认扩增序列的正确性。在37°C水浴中，用NdeI和SalI双切重组质粒，电泳回收1680bp左右的目的条带。将该目的片段插入到pET28a质粒的NdeI和SalI限制性内切酶位点之间，得到重组载体，将重组载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明正确的含有序列表中序列2的第179-1852位核苷酸序列的重组载体命名为pET28a-HbNIN2。<2>本发明的蔗糖转化酶的表达和其功能验证将获得的重组载体pET28a_HbNIN2导入E.coliBL21(DE3)中(陆海等.大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白的研究.北京林业大学学报.2001年第23卷第6期)，得到重组表达菌，将鉴定正确的重组菌在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养至0D600=0.40.6，添加IPTG至终浓度为lmM，37°C下诱导培养4h或6h，以未加IPTG的培养基培养的同样重组菌为对照，离心收集菌体，菌体蛋白进行12%SDS-PAGE电泳检测。结果表明，在IPTG诱导下HbNIN2这个基因实现了高效异源表达，并且表达蛋白的表观分子量与理论分子量相近，大约64kDa(图2)。蛋白表达产物经镍柱纯化后(具体方法参照Clontech公司的TALONresin产品说明书)，用14C-标记蔗糖进行蔗糖转化酶活性分析，具体方法参考文献(VargasWA,PontisHG,SalernoG.2007.Differentialexpressionofalkalineandneutralinvertasesinresponsetoenvironmentalstressescharacterizationofanalkalineisoformasastress-responseenzymeinwheatleaves.Planta2261535-1545)进行取5μ114C标记的蔗糖(比活性0.2μCi/μ1)(比活力为5XIO6Cpm/μmol)，力口入终浓度为200mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)，再加入2μg经镍柱纯化的含组氨酸标签的蔗糖转化酶重组蛋白，总体积为50μ1反应体系。30°C水浴条件下反应不同时间(Omin、10min,30min,60min)后，100°C2min终止反应。反应产物经混合床离子交换柱脱盐，不同的糖分经层析法分离和鉴定，并用液闪仪测定14C标记的不同糖分(蔗糖、葡萄糖和果糖)的闪烁值(cpm)。在pH7.5的反应体系中中，处理IOmin后，就能明显的检测出蔗糖降解产物葡萄糖和果糖；并且，随处理时间的延长，14C-蔗糖的量不断减少，而14C-葡萄糖和14C-果糖的量不断增加，表明所表达的重组蛋白具有明显的蔗糖降解活性，因此我们所克隆的这个HbNIN2基因编码功能性蔗糖转化酶。3.表达研究<l>HbNIN2基因的组织功能表达验证以巴西橡胶树热研7-33-97叶片、树皮和胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板，用Hbmm基因特异引物进行实时荧光定量PCR，根据各自对应的Qr值(Qr=ECt(18S-rRNA)-Ct(HbNINl)j常数川每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)的大小，同时乘以相同的倍数，即得到不同处理的相对表达丰度。结果显示HbNIN2主要在胶乳中表达(图3)，在叶片和树皮中的表达丰度相比要低的多，表明它具有明显的组织表达特异性，并且可能是胶乳再生蔗糖转化酶的编码基因。<2>割胶对HbNIN2基因的表达影响割胶可刺激胶乳生产，在未开割橡胶树中这种效果更明显。未开割树茎干部树皮中的乳管代谢活性低，随着割胶次数的增加，乳管蔗糖吸收加速，代谢活性增强，最终胶乳产量也增加了。未开割树的这种特性使其成为一个鉴定和研究胶乳再生相关基因的理想材料。以未开割巴西橡胶树热研7-33-97不同刀次的胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbNIN2基因特异引物(rINV2-F2:GAAGAGAGGCAAACAAACAAG(正义链引物，对应序列表中序列2的第1845-1874位核苷酸)，rINV2_R2:CGAAAGCAAACATTTCTCACTTTAC(反义链引物，对应序列表中序列2的第1921-1945位核苷酸))进行实时荧光定量PCR，结果分析同步骤<1>。结果如图4所示，结果表明割胶影响HbNIN2基因的表达——诱导HbNIN2的表达。<3>激素对HbNIN2基因的表达影响有研究认为，一些植物激素可调控蔗糖转化酶的基因表达和酶促活性，并且这种调控可能在某些激素调控植物生长发育中发挥核心作用(Tymowska-LalarmeΖ.andKreisΜ.1998.Theplantinvertases:physiology,biochemistryandmolecularbiology.Adv.Bot.Res.28:71_117)。在橡胶树生产中，在割线或割面上施用乙烯利(乙烯缓释剂)可刺激胶乳产量，已成为现代割胶制度不可或缺的组成部分。本研究选取六种植物激素(或生长调节剂，乙烯利、脱落酸、水杨酸、细胞分裂素、赤霉素和茉莉酸)，分别涂于橡胶树割线以及割线上方Icm割面处刺激橡胶树(0h、2h、12h，个别含24h)。实时荧光定量PCR结果显示(结果分析同步骤<1>)在所测定的六种植物激素(或生长调节剂)中，HbNIN2基因的表达显著受脱落酸(ABA)和水杨酸(SA)诱导(图5、6)；同时乙烯利(ET)对HbNIN2基因的表达也有诱导作用(图7)，但不如ABA和SA显著。此外，其它几种激素如细胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA)和茉莉酸(JA)对这个橡胶树蔗糖转化酶基因无明显影响。4.结论我们首次克隆了橡胶树胶乳蔗糖转化酶基因的全长cDNA，它是典型的中性/碱性蔗糖转化酶基因，并且可能就是胶乳蔗糖利用关键酶的编码基因；基因表达分析也初步显示它可能是决定乳管蔗糖利用效率的蔗糖转化酶基因。该基因可作为橡胶树转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来合理调节乳管的蔗糖利用和同化碳分配率，进而协调橡胶树的营养生长和橡胶生产，从而最大潜力的挖掘橡胶树生产潜力。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他植物或微生物的高产或抗逆基因工程中得到应用。权利要求一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中的SEQID1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQID1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖转化酶相关功能的由SEQID№1衍生的蛋白质。FSA00000051908900011.tif,FSA00000051908900012.tif2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质为蔗糖转化酶。3.权利要求1或2所述的蛋白质的编码基因。4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列是下述1)、2)或3)1)序列表中SEQIDΜ2的核苷酸序列；2)在严格条件下可与1)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。3)与序列表中SEQIDJV2:2的核苷酸序列具有80%以上的同源性的且编码蛋白具有与蔗糖转化酶功能的核苷酸序列。5.含有权利要求3或4所述的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌6.权利要求1或2所述的蛋白质及其编码基因在培育蔗糖利用率提高的重组微生物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述重组微生物为大肠杆菌。8.权利要求3或4所述的编码基因在培育产量提高的转基因橡胶树种的应用。9.权利要求1或2所述的蛋白质及其编码基因在降解蔗糖中的应用。全文摘要本发明公开了一种蔗糖转化酶及其编码基因与应用。该蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQID№.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQID№.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖转化酶功能的由SEQID№1衍生的蛋白质。该蛋白具有蔗糖转化酶活性，对蔗糖具有降解活性，转入植物或微生物中，可提高其对蔗糖利用效率，从而提高产量。文档编号C12N15/56GK101812433SQ20101013888公开日2010年8月25日申请日期2010年3月19日优先权日2009年11月10日发明者刘术金,唐朝荣,戚继艳,阳江华申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所