一种右旋糖酐的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种右旋糖酐的制备方法，属于右旋糖酐制备技术领域。本发明将培养得到的肠膜状明串珠菌菌体和产黄青霉菌菌体与海藻酸钠混合，滴入氯化钙中造粒，之后过滤，干燥，得固定化颗粒，置于装有甘蔗溶液的发酵罐中，发酵后提升温度搅拌灭活，从而得到右旋糖酐的制备方法。实例证明，本发明方法独特新颖，发酵过程简单易行，无需后续加工，且在制备的过程中无任何大量氯化物，简化工艺的同时保证了右旋糖酐的质量和品质，使得最终制得的右旋糖酐重均分子量为5000～7000D，分子量分布小于2.0，完全符药用标准。
【专利说明】
一种右旋糖酐的制备方法
技术领域
[0001 ]本发明公开了一种右旋糖酐的制备方法，属于右旋糖酐制备技术领域。
【背景技术】
[0002]右旋糖酐又名葡聚糖，是若干葡萄糖脱水形成的聚合物。它是世界上最早发现的并较早作为主要血浆代用品的微生物多糖。右旋糖酐是若干葡聚糖脱水形成的聚合物，主要由葡萄糖α-1，6糖苷键连接而成，由肠膜状明串菌株产生的右旋糖酐蔗糖酶。
[0003]目前已经应用于许多药物中作为载体，包括有降血糖药、抗肿瘤药、免疫蛋白和DNA等。在食品工业上的应用，右旋糖酐作为一种天然的来源丰富的微生物多糖是食品的一种优良的配料。主要是作为在食品中的保湿剂、稳定剂、增量剂和增稠剂。在石油工业上，右旋糖酐被作为油井钻泥的添加剂。
[0004]目前，微生物发酵合成右旋糖酐是目前工业上主要采用的一种方法。
[0005]微生物发酵法是将右旋糖酐蔗糖酶的生成和合成右旋糖酐两大步合到同一个反应器中同时进行。传统的右旋糖酐生产工艺是以蔗糖作为底物，以游离的微生物为转化菌，控制一定的发酵条件，经微生物发酵利用蔗糖分子中的葡萄糖单元，因发酵过程对形成的分子量不能调控，最终发酵合成分子量巨大的右旋糖酐产物;而分子量巨大的右旋糖酐产物一般很少能直接使用。因此，发酵合成的分子量巨大的右旋糖酐须再经过一系列的后续加工(一般包括乙醇沉淀、捏洗、酸水解、划分、纯化、干燥等工序)，最终才得到不同分子量级别的右旋糖酐成品。
[0006]除此以外，发酵方法制备高分子右旋糖酐，再利用盐酸水解得到不同分子量的药用右旋糖酐，由于生产的右旋糖酐含有大量的氯化物严重影响了右旋糖酐的质量和品质，在临床使用过程中常出现过敏反应，可引起皮肤反应、严重的呼吸和循环衰竭，甚至导致死亡。同时由于是酸催化水解，水解过程无序，得到的产品分子量分布不集中，影响产品的质量。另外，由于利用盐酸水解需要高温高酸等恶劣条件，不利于环保、低碳。
[0007]因而，通过适当的方法来定向制得右旋糖酐，以到达临床医学所需的右旋糖酐，是非常有必要的。
【发明内容】
[0008]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统微生物发酵法在制备右旋糖酐的过程中，发酵过程对形成的分子量不能调控，最终形成分子量巨大的右旋糖酐产物，导致不能够直接使用，需后续加工，使得操作复杂，且生产出来的右旋糖酐含有大量的氯化物，严重影响了右旋糖酐的质量和品质的现状，提供了一种将培养得到的肠膜状明串珠菌菌体和产黄青霉菌菌体与海藻酸钠混合，滴入氯化钙中造粒，之后过滤，干燥，得固定化颗粒，置于装有甘蔗溶液的发酵罐中，发酵后提升温度搅拌灭活，从而得到右旋糖酐的制备方法。该方法独特新颖，发酵过程简单易行，无需后续加工，且在制备的过程中无任何大量氯化物，简化工艺的同时保证了右旋糖酐的质量和品质，使得最终制得的右旋糖酐重均分子量为5000?7000D，分子量分布小于2.0，完全符药用标准。
[0009]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)向500mL培养皿中依次加入10?20g蔗糖、0.2?0.4g蛋白胨、0.2?0.4g磷酸氢二钠、0.03?0.05g磷酸二氢钾、0.5?0.7g酵母浸膏、200?300mL去离子水，混合制成I号培养基，培养肠膜状明串珠菌；
(2)称取0.1?0.3g肠膜状明串珠菌接种到上述I号培养基中，在20?25°C下，用摇床振荡培养96?120h后，将培养液在5000?7000r/min下离心30?40min，弃去上清液，得到肠膜状明串珠菌菌体，备用；
(3)称取20?30g去皮土豆，切成块后放入烧杯中，向烧杯中加入400?500mL去离子水，加热至沸腾，保温20?30min，再过滤，得滤液，向滤液中依次加入2?3g鹿糖、3?5g琼脂，混合制成2号培养基，培养产黄青霉菌；
(4)称取0.1?0.3g产黄青霉菌接种到上述2号培养基中，在25?30°C下，用摇床振荡96?120h后，将培养液在6000?8000r/min下离心40?50min，弃去上清液，得到产黄青霉菌菌体；
(5)向烧杯中加入50?60mL质量浓度为6?8%海藻酸钠溶液，再称取5?7g上述产黄青霉菌菌体和5?7g上述步骤(2)中备用的肠膜状明串珠菌菌体依次加入到海藻酸钠溶液中，搅拌20?30min，得到混合液，用5mL—次性注射器将混合液滴入盛有300?400mL0.05mol/L氯化钙溶液中造粒，在25?27 °C下静置固定化24h，过滤，将滤渣用去离子水洗涤3?5次，在45?55 °C烘箱中干燥5?6h，得到固定化颗粒；
(6)将上述固定化颗粒加入到盛有200?300mL质量浓度为12?14%蔗糖溶液的发酵罐中，在30?50°C下，发酵24?26h，待发酵结束，将温度升至70?100 V，持续搅拌直至肠膜状明串珠菌、产黄青霉菌以及产生的内切右旋糖酐酶灭活，过滤，将滤液进行减压蒸馏，从而得到一种右旋糖酐。
[0010]本发明的原理是:本发明用海藻酸钠将肠膜状明串珠菌与产黄青霉菌固定，共同发酵，肠膜状明串珠菌产生右旋糖酐的同时，产黄青霉菌产生内切右旋糖酐酶，水解右旋糖酐的α(1—6)键，使其分子量减小，避免了大分子右旋糖酐的产生。
[0011]本发明的应用方法是:将本发明制得的右旋糖酐放入消毒后的医用吊瓶中，其中每瓶医用吊瓶规格含量为250mL，密封医用吊瓶口，于干燥处保存即可，使用时，对患者采用静滴形式注射，根据病情，每次静滴250?500mL，连续静滴2?4天，可以增加患者血浆容量和维持血压，而且能够阻止红细胞及血小板聚集，降低血液粘滞行，效果显著，可安全使用。
[0012]本发明的有益效果是:
(1)本发明操作简便易行，在发酵过程中无任何大量氯化物产生，保证了右旋糖酐的质量和品质，且后续无需再次加工，简化了制备工艺；
(2)本发明最终制得的右旋糖酐重均分子量为5000?7000D，分子量分布小于2.0，完全符合药用标准，可大规模推广应用。
【具体实施方式】
[0013]首先向500mL培养皿中依次加入10?20g蔗糖、0.2?0.4g蛋白胨、0.2?0.4g磷酸氢二钠、0.03?0.05g磷酸二氢钾、0.5?0.7g酵母浸膏、200?300mL去离子水，混合制成I号培养基，培养肠膜状明串珠菌;然后称取0.1?0.3g肠膜状明串珠菌接种到上述I号培养基中，在20?25°C下，用摇床振荡培养96?120h后，将培养液在5000?7000r/min下离心30?40min，弃去上清液，得到肠膜状明串珠菌菌体，备用；随后称取20?30g去皮土豆，切成块后放入烧杯中，向烧杯中加入400?500mL去离子水，加热至沸腾，保温20?30min，再过滤，得滤液，向滤液中依次加入2?3g蔗糖、3?5g琼脂，混合制成2号培养基，培养产黄青霉菌;再称取0.1?0.3g产黄青霉菌接种到上述2号培养基中，在25?30°C下，用摇床振荡96?120h后，将培养液在6000?8000r/min下离心40?50min，弃去上清液，得到产黄青霉菌菌体;接下来向烧杯中加入50?60mL质量浓度为6?8%海藻酸钠溶液，再称取5?7g上述产黄青霉菌菌体和5?7g上述中备用的肠膜状明串珠菌菌体依次加入到海藻酸钠溶液中，搅拌20?30min，得到混合液，用5mL—次性注射器将混合液滴入盛有300?400mL0.05mol/L氯化钙溶液中造粒，在25?27°C下静置固定化24h，过滤，将滤渣用去离子水洗涤3?5次，在45?55°C烘箱中干燥5?6h，得到固定化颗粒;最后将上述固定化颗粒加入到盛有200?300mL质量浓度为12?14%蔗糖溶液的发酵罐中，在30?50°C下，发酵24?26h，待发酵结束，将温度升至70?100 °C，持续搅拌直至肠膜状明串珠菌、产黄青霉菌以及产生的内切右旋糖酐酶灭活，过滤，将滤液进行减压蒸馏，从而得到一种右旋糖酐。
[0014]实例I
首先向500mL培养皿中依次加入1g蔗糖、0.2g蛋白胨、0.2g磷酸氢二钠、0.03g磷酸二氢钾、0.5g酵母浸膏、200mL去离子水，混合制成I号培养基，培养肠膜状明串珠菌;然后称取
0.1g肠膜状明串珠菌接种到上述I号培养基中，在20°C下，用摇床振荡培养96h后，将培养液在5000r/min下离心30min，弃去上清液，得到肠膜状明串珠菌菌体，备用；随后称取20g去皮土豆，切成块后放入烧杯中，向烧杯中加入400mL去离子水，加热至沸腾，保温20min，再过滤，得滤液，向滤液中依次加入2g蔗糖、3g琼脂，混合制成2号培养基，培养产黄青霉菌;再称取0.1g产黄青霉菌接种到上述2号培养基中，在25°C下，用摇床振荡96h后，将培养液在6000r/min下离心40min，弃去上清液，得到产黄青霉菌菌体;接下来向烧杯中加入50mL质量浓度为6%海藻酸钠溶液，再称取5g上述产黄青霉菌菌体和5g上述中备用的肠膜状明串珠菌菌体依次加入到海藻酸钠溶液中，搅拌20min，得到混合液，用5mL—次性注射器将混合液滴入盛有300mL0.05mol/L氯化钙溶液中造粒，在25°C下静置固定化24h，过滤，将滤渣用去离子水洗涤3次，在45°C烘箱中干燥5h，得到固定化颗粒;最后将上述固定化颗粒加入到盛有200mL质量浓度为12%蔗糖溶液的发酵罐中，在30°C下，发酵24h，待发酵结束，将温度升至700C，持续搅拌直至肠膜状明串珠菌、产黄青霉菌以及产生的内切右旋糖酐酶灭活，过滤，将滤液进行减压蒸馏，从而得到一种右旋糖酐。
[0015]本实例操作简单易行，将本发明制得的右旋糖酐放入消毒后的医用吊瓶中，其中每瓶医用吊瓶规格含量为250mL，密封医用吊瓶口，于干燥处保存即可，使用时，对患者采用静滴形式注射，根据病情，每次静滴250mL，连续静滴2天，可以增加患者血浆容量和维持血压，而且能够阻止红细胞及血小板聚集，降低血液粘滞行，效果显著，可安全使用。
[0016]实例2
首先向500mL培养皿中依次加入15g蔗糖、0.3g蛋白胨、0.3g磷酸氢二钠、0.04g磷酸二氢钾、0.6g酵母浸膏、250mL去离子水，混合制成I号培养基，培养肠膜状明串珠菌;然后称取
0.2g肠膜状明串珠菌接种到上述I号培养基中，在23°C下，用摇床振荡培养IlOh后，将培养液在6000r/min下离心35min，弃去上清液，得到肠膜状明串珠菌菌体，备用；随后称取25g去皮土豆，切成块后放入烧杯中，向烧杯中加入450mL去离子水，加热至沸腾，保温25min，再过滤，得滤液，向滤液中依次加入2.5g蔗糖、4g琼脂，混合制成2号培养基，培养产黄青霉菌;再称取0.2g产黄青霉菌接种到上述2号培养基中，在28 °C下，用摇床振荡10h后，将培养液在7000r/min下离心45min，弃去上清液，得到产黄青霉菌菌体;接下来向烧杯中加入55mL质量浓度为7%海藻酸钠溶液，再称取6g上述产黄青霉菌菌体和6g上述中备用的肠膜状明串珠菌菌体依次加入到海藻酸钠溶液中，搅拌25min，得到混合液，用5mL—次性注射器将混合液滴入盛有350mL0.05mol/L氯化钙溶液中造粒，在26°C下静置固定化24h，过滤，将滤渣用去离子水洗涤4次，在50°C烘箱中干燥5.5h，得到固定化颗粒;最后将上述固定化颗粒加入到盛有250mL质量浓度为13%蔗糖溶液的发酵罐中，在40°C下，发酵25h，待发酵结束，将温度升至85°C，持续搅拌直至肠膜状明串珠菌、产黄青霉菌以及产生的内切右旋糖酐酶灭活，过滤，将滤液进行减压蒸馏，从而得到一种右旋糖酐。
[0017]本实例操作简单易行，将本发明制得的右旋糖酐放入消毒后的医用吊瓶中，其中每瓶医用吊瓶规格含量为250mL，密封医用吊瓶口，于干燥处保存即可，使用时，对患者采用静滴形式注射，根据病情，每次静滴380mL，连续静滴3天，可以增加患者血浆容量和维持血压，而且能够阻止红细胞及血小板聚集，降低血液粘滞行，效果显著，可安全使用。
[0018]实例3
首先向500mL培养皿中依次加入20g蔗糖、0.4g蛋白胨、0.4g磷酸氢二钠、0.05g磷酸二氢钾、0.7g酵母浸膏、300mL去离子水，混合制成I号培养基，培养肠膜状明串珠菌;然后称取
0.3g肠膜状明串珠菌接种到上述I号培养基中，在25°C下，用摇床振荡培养120h后，将培养液在7000r/min下离心40min，弃去上清液，得到肠膜状明串珠菌菌体，备用；随后称取30g去皮土豆，切成块后放入烧杯中，向烧杯中加入500mL去离子水，加热至沸腾，保温30min，再过滤，得滤液，向滤液中依次加入3g蔗糖、5g琼脂，混合制成2号培养基，培养产黄青霉菌;再称取0.3g产黄青霉菌接种到上述2号培养基中，在30 0C下，用摇床振荡120h后，将培养液在8000r/min下离心50min，弃去上清液，得到产黄青霉菌菌体;接下来向烧杯中加入60mL质量浓度为8%海藻酸钠溶液，再称取7g上述产黄青霉菌菌体和7g上述中备用的肠膜状明串珠菌菌体依次加入到海藻酸钠溶液中，搅拌30min，得到混合液，用5mL—次性注射器将混合液滴入盛有400mL0.05mol/L氯化钙溶液中造粒，在27°C下静置固定化24h，过滤，将滤渣用去离子水洗涤5次，在55°C烘箱中干燥6h，得到固定化颗粒;最后将上述固定化颗粒加入到盛有300mL质量浓度为14%蔗糖溶液的发酵罐中，在50°C下，发酵26h，待发酵结束，将温度升至100C,持续搅拌直至肠膜状明串珠菌、产黄青霉菌以及产生的内切右旋糖酐酶灭活，过滤，将滤液进行减压蒸馏，从而得到一种右旋糖酐。
[0019]本实例操作简单易行，将本发明制得的右旋糖酐放入消毒后的医用吊瓶中，其中每瓶医用吊瓶规格含量为250mL，密封医用吊瓶口，于干燥处保存即可，使用时，对患者采用静滴形式注射，根据病情，每次静滴500mL，连续静滴4天，可以增加患者血浆容量和维持血压，而且能够阻止红细胞及血小板聚集，降低血液粘滞行，效果显著，可安全使用。
【主权项】
1.一种右旋糖酐的制备方法，其特征在于具体制备步骤为: (1)向500mL培养皿中依次加入10?20g蔗糖、0.2?0.4g蛋白胨、0.2?0.4g磷酸氢二钠、0.03?0.05g磷酸二氢钾、0.5?0.7g酵母浸膏、200?300mL去离子水，混合制成I号培养基，培养肠膜状明串珠菌； (2)称取0.1?0.3g肠膜状明串珠菌接种到上述I号培养基中，在20?25°C下，用摇床振荡培养96?120h后，将培养液在5000?7000r/min下离心30?40min，弃去上清液，得到肠膜状明串珠菌菌体，备用； (3)称取20?30g去皮土豆，切成块后放入烧杯中，向烧杯中加入400?500mL去离子水，加热至沸腾，保温20?30min，再过滤，得滤液，向滤液中依次加入2?3g鹿糖、3?5g琼脂，混合制成2号培养基，培养产黄青霉菌； (4)称取0.1?0.3g产黄青霉菌接种到上述2号培养基中，在25?30°C下，用摇床振荡96?120h后，将培养液在6000?8000r/min下离心40?50min，弃去上清液，得到产黄青霉菌菌体； (5)向烧杯中加入50?60mL质量浓度为6?8%海藻酸钠溶液，再称取5?7g上述产黄青霉菌菌体和5?7g上述步骤(2)中备用的肠膜状明串珠菌菌体依次加入到海藻酸钠溶液中，搅拌20?30min，得到混合液，用5mL—次性注射器将混合液滴入盛有300?400mL0.05mol/L氯化钙溶液中造粒，在25?27 °C下静置固定化24h，过滤，将滤渣用去离子水洗涤3?5次，在45?55 °C烘箱中干燥5?6h，得到固定化颗粒； (6)将上述固定化颗粒加入到盛有200?300mL质量浓度为12?14%蔗糖溶液的发酵罐中，在30?50°C下，发酵24?26h，待发酵结束，将温度升至70?100 V，持续搅拌直至肠膜状明串珠菌、产黄青霉菌以及产生的内切右旋糖酐酶灭活，过滤，将滤液进行减压蒸馏，从而得到一种右旋糖酐。
【文档编号】C12N11/10GK105907830SQ201610477136
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】高大元, 张明, 孟浩影
【申请人】高大元