一种具有抗菌活性的蔗糖癸酸酯及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗菌活性的蔗糖癸酸酯及其制备方法，制备得到的蔗糖癸酸酯可作为兼具抗菌和乳化作用的多功能添加剂，属于食品、医药、化妆品等应用领域。本发明以丙酮作为有机介质，采用蔗糖和癸酸为原料，经脂肪酶催化制备得到反应物，经抽滤除去分子筛、酶和未反应的蔗糖，所得上清液旋蒸除去丙酮，随后经硅胶柱层析分离，得到蔗糖癸酸酯。以常见食品病原菌和腐败菌为供试菌，采用肉汤稀释法评价其抗菌活性，其抗菌性较强，强弱依次为：蜡样芽孢杆菌≈枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌≈沙门氏菌。本发明材料来源广、安全无毒，反应条件温和、对环境友好、制备的蔗糖癸酸酯具有广谱抗菌作用，并达到食品级标准，应用前景广阔。
【专利说明】一种具有抗菌活性的蔗糖癸酸酯及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有抗菌活性的蔗糖癸酸酯及其制备方法，具体讲是基于酶促方法合成蔗糖癸酸酯，可作为兼具抗菌和乳化作用的多功能添加剂，属于食品、医药、化妆品等应用领域。
【背景技术】
[0002]糖酯是由糖和脂肪酸缩合而成的一类可食用的有机化合物。糖酯具有良好的乳化、分散增溶、渗透、起泡、粘度调节等性能，还具有无毒、无臭、无刺激性、易生物降解等优良特性，可应用于食品、医药、化妆品、洗涤剂、纺织等行业。糖酯安全性高，是联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)等推荐使用的食品添加剂，其中，蔗糖酯在食品工业中应用最为广泛。
[0003]近年来研究表明，糖酯对微生物具有抑制作用，特别是对形成孢子的革兰氏阳性菌(G+)的抑制作用较大。因此，糖酯在作为表面活性剂使用的同时，还可具备良好的防腐性能。然而，有关糖酯对一些常见的食品病原菌和腐败菌(如，蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)的抗菌作用，尚缺乏系统研究。此外，尚未对不同糖酯的抗菌活性进行系统研究，从而筛选得到一种对常见食品病原菌及腐败菌具有强抗菌性的糖酯。随着人们生活水平的提高，人们对于添加剂的要求也越来越高，开发营养、安全的多功能食品添加剂在食品行业内广受推崇。因此，开发兼具抗菌作用的糖酯食品添加剂具有广阔的市场前景。
[0004]同时，国内外商 业化生产的糖酯常采用化学法合成，工艺复杂，反应条件苛刻，副产物多，转化率较低，产品色泽较深；而酶法合成选择性强，工艺简单，反应条件温和，副产物少，转化率较高，产品纯度高、色泽浅，容易分离纯化。采用酶法合成糖酯克服了化学法生产的诸多缺点，且符合绿色反应过程的要求，同时增强了糖酯产品的天然性和食用安全性，已越来越受到人们的重视。
[0005]本发明以鹿糖和癸酸为原料，以固定化脂肪酶(Novozym435)为催化剂,非水相体系合成，产物经硅胶柱梯度洗脱分离纯化，制备得到蔗糖癸酸酯。该糖酯对食品中常见病源菌和腐败菌具有较强的抗菌作用，可为开发安全、并具有广谱抗菌性的表面活性剂提供新思路。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种具有抗菌活性的糖酯及其脂肪酶催化合成的制备方法。该方法反应溶剂无毒，酶用量少可回收利用，反应产物易与反应溶剂和脂肪酶分离，可进行连续化生产。该方法合成的糖酯对食品中常见病源菌和腐败菌具有较强的抗菌作用，可作为兼具防腐和乳化作用的添加剂，应用于食品、药品、化妆品等行业。
[0007]本发明的技术方案:以蔗糖和癸酸为原料，在有机溶剂中采用脂肪酶催化，反应产物经硅胶柱层析分离纯化，得到一种具有高抗菌活性的蔗糖癸酸酯。具体制备方法为:[0008]以丙酮作为有机介质，分别加入蔗糖和癸酸，蔗糖癸酸摩尔比为1:3，混匀后加入适量的NOVOZym435脂肪酶，随后加入4人分子筛脱除反应过程中生成的水，促进酯化反应进行，于45°C下振荡反应72h。反应结束后，经抽滤除去分子筛、酶和未反应的蔗糖，所得上清液旋转蒸发除去丙酮，采用硅胶层析分离，以乙酸乙酯/甲醇为流动相进行纯化，减压干燥后得到蔗糖癸酸酯。
[0009]根据本发明方法制备的蔗糖癸酸酯，其特征在于具有良好的抗菌效果，其抑菌效果依次为:蜡样芽孢杆菌~枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌~沙门氏菌。[0010]本发明的优点和有益效果:
[0011]1.目前糖酯作为商品，主要是蔗糖与硬脂酸、棕榈酸和油酸的单酯、双酯和三酯以及它们的混合酯。用本发明方法制备得到的蔗糖癸酸酯在市场上鲜有商品化产品，其对食品中常见病源菌和腐败菌具有较强的抗菌作用，用量为0.12%~0.50% (相当于2.5~IOmM)即可达到抑菌效果。该糖酯单独或与其他糖酯配伍使用，可作为兼具防腐和乳化作用的添加剂，广泛应用于食品、药品、化妆品等行业，为开发安全、并具有广谱抗菌性的表面活性剂提供新思路。
[0012]2.本发明提供了一种具有抗菌活性的蔗糖癸酸酯的制备方法，该方法以蔗糖和癸酸为原料，丙酮作为反应溶剂，采用酶法合成，与传统方法相比具有如下优点:(1)采用食品加工助剂一丙酮作为反应溶剂，丙酮是以玉米或其他农副产品为原料，经过生物发酵获得，符合GB29227-2012食品安全国家标准，安全无毒，并可回收再利用；(2)采用高效的固定化脂肪酶催化合成蔗糖癸酸酯，选择性强，反应条件温和，原料转化率高，产物易分离，生产用固定化酶可回收重复利用，符合环境友好生产的要求；该方法克服了传统化学方法选择性差，副产物较多，高温高压，能耗高，效率低等缺点，增强了产品的天然性和食用安全性。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
[0014](I)分子筛活化:首先将4人分子筛置于200°C烘箱内活化4h，再置于干燥器内冷却
至室温，备用。
[0015](2)酶促反应:以丙酮作为有机介质，取51.7g癸酸和34.2g蔗糖，置于体积为1000mL的丙酮中混合，加入70g 4人分子筛，再加入15g的Novozym435脂肪酶(酶活为10，000PLU/g，以每Ig酶生成的月桂酸丙酯单位(PLU/g)来表示)，振荡速度为170~180r/min，于45°C下反应72h。反应结束后，经抽滤除去分子筛、酶和未反应的蔗糖，所得上清液于45°C旋转蒸发除去丙酮，得到蔗糖癸酸酯粗产物。
[0016](3)分离纯化:采用硅胶柱层析方法进行纯化，3mL粗产物溶液上硅胶层析柱(硅胶GlOO ~200 目，柱 12mmX600mm)，依次以 50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1 的乙酸乙酯/甲醇混合液进行梯度洗脱，流速为2mL/min，按I管/IOmin收集洗出液，并用薄层层析(TLC)检验、收集产物，经旋蒸、真空干燥去除溶剂后得到蔗糖癸酸酯。
[0017](4)TLC检验:先将硅胶板G于105°C活化30min，收集得到的样品采用毛细管点样，电吹风吹干溶剂，薄层板置于层析缸展开剂(乙酸乙酯:甲醇=16:1)蒸汽中平衡，展开完毕后将薄层板取出，吹风机吹干溶剂，均匀喷上碱性高锰酸钾显色剂。[0018]实施例2.蔗糖癸酸酯的体外抗菌试验
[0019]采用金黄色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus) ASl.89、大肠杆菌(Escherichia coli)ASl.90、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)ASl.1849、腊样芽抱杆菌(Bacillus cereus) ASl.1846、鼠伤寒沙门氏菌(Samonella Typhimurium) ASl.1174为供试菌。将菌种从斜面上用接种环接到新鲜培养基斜面上，各细菌于37°C培养箱培养24h。随后，分别从活化的菌种斜面上用接种环刮取少量菌体接种于已灭菌的MH(B)培养基，采用活菌计数法分别测定五种供试菌的原始菌液浓度，最后将制备好的菌液至于4°C保存备用。
[0020]最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定:采用肉汤稀释法，将上述实例中制得的蔗糖癸酸酯用无菌MH(B)进行稀释，制成浓度分别为1.25，2.5，5，10，20mmol/L的稀释液，吸取5mL各种浓度的蔗糖癸酸酯溶液于IOmL的具塞试管中，接入活化的供试菌，使初菌数为5X 105CFU/mL，将试管放入培养箱中，于37°C培养24h后，从各个试管中吸取菌液，进行活菌计数。试验设置3个平行，两次重复。计算加入每个成分后相对于初始菌落数量变化的对数值Log(NzX)，其中=N为培养24h后的细菌数量，NO为培养Oh的细菌数量。
[0021]结果评价:MIC，菌落计数等于或小于最初接种菌量的最低浓度，即Log(N/N0) ( 0 ;MBC，菌落计数等于或小于0.1 %最初接种菌量的最低浓度，即Log(NzX) ( _3。
[0022]蔗糖癸酸酯对五种供试菌的MIC和MBC
[0023]
【权利要求】
1.一种具有广谱抗菌活性的蔗糖癸酸酯的制备方法，其特征是以蔗糖和癸酸为原料，脂肪酶为催化剂，在有机溶剂体系中进行合成，经过分离纯化得到蔗糖癸酸酯。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂体系为丙酮，丙酮为食品加工助剂，以玉米或其他农副产品为原料，经过生物发酵获得，符合GB29227-2012食品安全国家标准-食品添加剂丙酮。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体工艺条件为:以丙酮作为有机介质，鹿糖100mmol/L,鹿糖癸酸摩尔比为1:3，4人分子筛70g/L,酶Novozym43515g/L,振荡速度为170~180r/min，于45°C下反应72h ;反应结束后，经抽滤除去分子筛、酶和未反应的蔗糖，所得上清液旋转蒸发除去丙酮，采用层析分离进行纯化，减压干燥后得到蔗糖癸酸酯。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的层析分离为正相硅胶柱层析分离，硅胶填料规格为硅胶G，洗脱剂为乙酸乙酯/甲醇混合液。
5.一种具有广谱抗菌活性的蔗糖癸酸酯，其特征在于，该糖酯以蔗糖和癸酸为原料，蔗糖主要来自于甜菜和甘蔗，癸酸是用椰子油、月桂油、山苍子油经水解生成月桂酸的副产物，原料易获得、具有良好的天然性。
6.如权利要求5所述的蔗糖癸酸酯，其特征在于，该糖酯对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及沙门氏菌等常见食品病原菌及腐败菌具有明显的抗菌作用。
7.如权利要求5所述的蔗糖癸酸酯，其特征在于，该糖酯单独或与其他糖酯配伍使用，可获得不同亲水亲油平衡值(HLB)且兼具防腐作用的糖酯产品，用于食品、医药、化妆品等领域。
【文档编号】C07H13/06GK103614433SQ201310542433
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】赵磊, 王成涛, 张鹤龑, 郝添阳, 李思然 申请人:北京工商大学