专利名称：一种检测土壤中羟胺还原酶活性的分析方法
技术领域：
本发明涉及土壤中羟胺还原酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中羟胺还原酶活性的分析方法。
背景技术：
土壤中的羟胺还原酶能将在土壤中氮代谢(亚硝酸盐的还原或者氨的氧化)过程中形成的中间产物羟胺还原成氨，土壤中的还原态化合物可作为氢的供体。
因此，土壤中羟胺还原酶活性的强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素的氨挥发损失，间接影响氮肥的利用效率。土壤中羟胺还原酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中羟胺还原酶活性的检验有很重要的意义。而到目前为止，有关羟胺还原酶活性的测定基本都是参照Φ.X.哈兹耶夫[苏]著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活性》一书中的方法。该种方法步骤比较繁琐，需用专用的试剂瓶和抽滤装置进行抽真空培养，且试验的厌氧培养程度随装置的不同、培养批次的不同具有差异性和不确定性，使其难以适应土壤中羟胺还原酶活性的定性比较和定量研究；同时，该种方法显色剂涉及到乙酸酐(冰毒前体)的应用，购买乙酸酐需要公安部门的毒品证明，无形中降低了分析的时效性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检验土壤中羟胺还原酶活性的分析方法。该方法是在借鉴前人测定方法的原理基础上，对羟胺还原酶活性的测定步骤和显色方法进行了部分改进(对其通过保持一定真空度而实现厌氧培养和使用乙酸酐作为显色剂进行了改进)，从而减少培养时厌氧程度的不确定性和试验步骤的复杂性，并通过应用较乙酸酐-三氯化铁更灵敏的显色剂，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种检测土壤中羟胺还原酶活性的分析方法1)分别称取0.5-1g土壤风干样品n(≥2)份于试管中，向其中n-1只试管中加入0.5-2ml0.5％-1.0％的盐酸羟胺，另1只试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；用弱碱调解pH至7-8.5，然后向试管中分别加入1-2ml0.5％-1％的葡萄糖溶液作为氢的供体，再用蒸馏水补充至5-10ml，用惰性气流排除试管中的空气，塞上不透气的橡胶塞，摇匀后置于30±0.5℃恒温箱中培养5±0.1h；同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)；2)培养结束后，用10-40ml蒸馏水将试管内的土水混合物完全转移至三角瓶中，再用蒸馏水补充至50-100ml；3)加入铝钾矾饱和溶液1-2ml；振荡、过滤；4)取滤液1ml于50ml容量瓶中，加缓冲液、相对盐酸羟胺过量的显色剂，然后用蒸馏水定容至刻度，在510nm下用分光光度计比色测定吸光值为A；5)在510nm下比色测定一系列(二组或二组以上)已知浓度的羟胺溶液(0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00μgNH2OH·ml-1)的吸光值A’，以羟胺溶液的浓度和测定的吸光值A’制作标准曲线，得到斜率b；6)根据吸光值A和斜率b，计算所测定溶液中羟胺的浓度S，S＝A*b；7)计算样品中羟胺浓度；8)计算羟胺还原酶活性，计算公式为[(S1-(S2-S3))*50*V/1000]/W，单位mgNH2OH·g-1soil·5h-1；式中，S1为试剂空白中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S2为样品中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S3为样品对照中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，50为定容后的溶液体积，V为步骤2中补充蒸馏水后的溶液体积，1000为单位转换系数，W为称土样重。
对于酸性土壤，调解pH为7-8.5，采用加入碳酸钙(CaCO3)的方法(对于石灰性土壤而言，碳酸钙无需加入，因为土壤本身的pH值既可以满足微生物的最适pH)。
厌氧培养所使用的蒸馏水，需加热至沸腾驱除水中的溶解O2，然后封闭冷却至室温。所使用的惰性气流既可以是氮气流也可以是二氧化碳气流。
所述缓冲液既可以是醋酸钠和盐酸的混合液，也可以是醋酸钠和醋酸等物质量的混合液。所述显色剂为硫酸铁铵水溶液和邻菲罗啉乙醇溶液。
本发明方法改进的依据土壤羟胺还原酶与土壤硝酸还原酶和亚硝酸还原酶一样，都是参与土壤中氮素代谢的还原酶类。三者测定过程中均需要厌氧培养条件。硝酸还原酶活性测定是以硝酸钾(KNO3)为底物，通过加入2，4-二硝基酚抑制亚硝酸还原酶的活性，来检测单位时间内NO2--N的生成量；亚硝酸还原酶活性的测定方法则是以亚硝酸钠(NaNO2)为底物，经过24小时厌氧培养，通过单位时间内NO2-N的减少量来表征。与此相同，本方法中羟胺还原酶活性的测定则是以羟胺(NH2OH)为底物，经过5小时厌氧培养，通过单位时间内羟胺的减少量来衡量羟胺还原酶的活性。加入5-10ml排除溶解氧的液封和用惰性气流排除培养试管中的空气，目的都是为培养试验创造良好的厌氧环境。
本发明所使用的显色反应原理为硫酸铁铵溶液中的Fe(III)将溶液中的羟胺氧化为氮气，而自身被还原为Fe(II)，Fe(II)与加入的邻菲罗啉(Phen)发生络合反应生成的三邻菲罗啉合亚铁离子(Fe(Phen)32+)显棕色(低浓度时为桔黄色)，而过量的邻菲罗啉与剩余Fe(III)络合生成无色的三邻菲罗啉合铁离子(Fe(Phen)33+)，因而可以通过比色测定Fe(Phen)32+的生成量衡量溶液中羟胺的量。
Fe3++NH2OH+3Phen----→Fe(Phen)32+(棕色)+1/2N2+H2OFe3++3Phen----→Fe(Phen)33+(无色)已有研究指出，在pH为2-9的范围内Fe(Phen)32+的吸光度不随pH值而变化，故本发明采取醋酸钠和盐酸的混合液或醋酸钠和醋酸等物质量的混合液作为缓冲溶液，使显色反应体系pH值保持在2-9范围内。
与过去的分析方法相比较，本发明的优点主要有1)所需设备简单、降低了试验成本。本发明中的培养试验是在直径10-15mm、长为100-150mm的普通玻璃试管中进行，不需用原来方法中提及的用来实现抽真空的带磨口塞的专用真空瓶及真空泵。
2)所使用的显色方法灵敏度更高，将分析精确度提高了一个数量级。由于羟胺质量浓度在0.4-15μg·ml-1的范围内与吸光度呈良好的线性关系，故本发明所涉及到的显色方法可将结果精确至0.1μg·ml-1，而原来方法的精确度为1.0μg·ml-1，新方法将分析精度提高了一个数量级。
3)操作简单，分析结果稳定可靠，重现性好。原来方法需要设置灭菌土壤作为对照，本方法只需用一个不加底物的溶液作为对照；同时，由于本发明所涉及到的培养方法减少了厌氧培养过程的复杂性和不确定性，故分析结果重现性非常良好。
4)简化了操作步骤，减少了厌氧培养过程的复杂性和不确定性。
具体实施例方式
试剂配制1.0.5-1.0％的盐酸羟胺溶液准确称取0.50-1.00g盐酸羟胺，用蒸馏水定容至100ml。
2.0.5-1.0％的葡萄糖溶液准确称取0.50-1.00g葡萄糖，用蒸馏水定容至100ml。
3.碳酸钙分析纯试剂。
4.铝钾矾饱和溶液将过量的硫酸铝钾溶于蒸馏水中，上层清液既为铝钾矾饱和溶液。
5.缓冲液一82g乙酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml，加入36％盐酸1ml。
缓冲液二80g乙酸钠与90.0g冰乙酸溶于蒸馏水中，定容至1000ml。
6.显色剂的配制
1)硫酸铁铵(NH4Fe(SO4)2)称取≥0.2g十二水合硫酸铁铵溶于100ml蒸馏水中，加两滴浓硫酸作稳定剂。
2)邻菲罗啉称取≥0.1g邻菲罗啉溶于100ml95％乙醇中。
7.标准贮备液的配制2.1046g盐酸羟胺溶于1L水中，则得到1mg·ml-1的贮备液。此贮备液需放入4℃的冰箱中保存，保存时间不宜超过数周。
8.标准曲线的制备吸取上述标准贮备液1ml，定容至100ml，得到0.01mg·ml-1的溶液。再分别吸取该溶液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，加入1ml缓冲溶液、1ml硫酸铁铵溶液和1ml邻菲罗啉乙醇溶液，用蒸馏水定容。则此标准系列含羟胺量分别为0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00μgNH2OH·ml-1。在510nm下比色测定此系列羟胺溶液的吸光值A’，以羟胺的浓度和测定的吸光值A’制备标准曲线，得到斜率b。
操作步骤1.称取1g过1mm筛的土壤风干样品4份于4只试管中，向其中3只试管中加入0.5-2ml0.5％-1.0％的盐酸羟胺，另1只试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；向4只试管中分别加入20mg碳酸钙，混合均匀后向4只试管中分别加入1-2ml0.5％-1％的葡萄糖溶液作为氢的供体，再用蒸馏水补充至5-10ml，用氮气流或二氧化碳气流排除试管中的空气，塞上不透气的橡胶塞，摇匀后置于30℃恒温箱中培养5h；同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)。
2.培养结束后，用25ml蒸馏水将试管内的土水混合物完全转移至三角瓶中，再用蒸馏水补充至50ml。
3.加入铝钾矾饱和溶液2ml；振荡10min、用致密滤纸过滤。
4.取滤液1ml于50ml容量瓶中，分别加缓冲液1ml、硫酸铁铵溶液1ml、邻菲罗啉乙醇溶液1ml，然后用蒸馏水定容至刻度，显色10min，在510nm下用分光光度计比色测定吸光值为A。
5.根据吸光值A和斜率b，计算所测定溶液中羟胺的浓度S，S＝A*b。
6.计算样品中羟胺的含量。
7.计算羟胺还原酶活性，计算公式为[(S1-(S2-S3))*50*V/1000]/W，单位mgNH2OH·g-1soil·5h-1；式中，S1为试剂空白中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S2为样品中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S3为样品对照中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，50为定容后的溶液体积，V为步骤2中补充蒸馏水后的溶液体积，1000为单位转换系数，W为称土样重。
实施例1本实施例所使用的三种土壤分别为1号为对照，即不经过任何处理和不添加任何土壤添加剂在25℃培养24h以上的普通土壤；2号为添加硝化抑制剂3，5-二甲基吡唑磷酸盐且在25℃培养24h以上的土壤；3号为添加硝化抑制剂1-羟甲基-3，5-二甲基吡唑且在25℃培养24h以上的土壤，土壤含水量均为20％。2号和3号添加硝化抑制剂的土壤，其中两种抑制剂的添加量都是1.15mg·kg-1土。用上述的方法检测三种土壤羟胺还原酶活性。
每种土壤的具体分析步骤如下1.称取1g过1mm筛的土壤风干样品4份于4只试管中，向其中3只试管中加入1ml0.5％的盐酸羟胺，另1只试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；分别向4只试管中加入20mg碳酸钙，混合均匀后向4只试管中分别加入1ml1％的葡萄糖溶液作为氢的供体，再用蒸馏水补充至5ml，用氮气流排除试管中的空气，塞上不透气的橡胶塞，摇匀后置于30℃恒温箱中培养5h；同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)。
2.培养结束后，用25ml蒸馏水将试管内的土水混合物完全转移至三角瓶中，再用蒸馏水补充至50ml。
3.加入铝钾矾饱和溶液2ml；振荡10min、用致密滤纸过滤。
4.取滤液1ml于50ml容量瓶中，分别加缓冲液一1ml、硫酸铁铵溶液1ml、邻菲罗啉乙醇溶液1ml，然后用蒸馏水定容至刻度，显色10min，在510nm下用分光光度计比色测定吸光值为A。
5.根据吸光值A和斜率b，计算所测定溶液中羟胺的浓度S，S＝A*b。
6.计算样品中羟胺的含量。
试验结果如下
由表中数据可以看出，各处理之间结果差异达到显著水平，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。
实施例2本实施例所使用的三种土壤均采自中国科学院沈阳生态实验站其中4号土壤前茬作物为水稻，5号土壤前茬作物为玉米，6号土壤前茬作物为大豆。三种不同耕作制度的土壤均在含水量为20％，温度为25℃条件下培养24h以上，测定其羟胺还原酶活性，具体分析步骤如下底物盐酸羟胺浓度为1％，加入0.5ml，葡萄糖浓度为1％，加入1ml，然后加入3.5ml蒸馏水，二氧化碳气流排空气厌氧培养。显色前加入缓冲液二，其余步骤同实施例1。试验结果如下
表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。
权利要求
1.一种检测土壤中羟胺还原酶活性的分析方法，其特征在于1)分别称取0.5-1g土壤风干样品n份于试管中，n≥2，向其中n-1只试管中加入0.5-2ml 0.5％-1.0％的盐酸羟胺，另1只试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；用弱碱调解pH至7-8.5，然后向试管中分别加入1-2ml0.5％-1％的葡萄糖溶液作为氢的供体，再用蒸馏水补充至5-10ml，用惰性气流排除试管中的空气，塞上不透气的橡胶塞，摇匀后置于29.5-30.5℃恒温箱中培养4.9-5.1h；同时作试剂不放土壤风干样品的空白对照；2)培养结束后，用10-40ml蒸馏水将试管内的土水混合物完全转移至三角瓶中，再用蒸馏水补充至50-100ml；3)加入铝钾矾饱和溶液1-2ml；振荡、过滤；4)取滤液1ml于50ml容量瓶中，加缓冲液、相对盐酸羟胺过量的显色剂，然后用蒸馏水定容至刻度，在510nm下用分光光度计比色测定吸光值为A；5)在510nm下比色测定二组或二组以上已知浓度的羟胺溶液的吸光值A’，以羟胺溶液的浓度和测定的吸光值A’制作标准曲线，得到斜率b；6)根据吸光值A和斜率b，计算所测定溶液中羟胺的浓度S，S＝A*b；7)计算样品中羟胺浓度；8)计算羟胺还原酶活性，计算公式为[(S1-(S2-S3))*50*V/1000]/W，单位mgNH2OH·g-1soil·5h-1；式中，S1为试剂空白中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S2为样品中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S3为样品对照中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，50为定容后的溶液体积，V为步骤2中补充蒸馏水后的溶液体积，1000为单位转换系数，W为称土样重。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于对于酸性土，采用加入碳酸钙的方法调解pH为7-8.5。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于厌氧培养所使用的蒸馏水，使用前，需将其加热至沸腾驱除水中的溶解O2，然后封闭冷却至室温。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述惰性气流既为氮气流或二氧化碳气流。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述缓冲液既为醋酸钠和盐酸的混合液，或醋酸钠和醋酸的混合液。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述显色剂为硫酸铁铵水溶液和邻菲罗啉乙醇溶液，而它们的加入量相对盐酸羟胺均为过量的。
全文摘要
本发明涉及一种检测土壤中羟胺还原酶活性的分析方法，1)称取0.5－1g土壤风干样品n份于试管中，向其中n－1只试管中加入盐酸羟胺，另1只试管中加入蒸馏水作样本对照；调pH为7－8.5，向试管中加入葡萄糖溶液，用蒸馏水补充至5－10ml，排除试管中的空气，塞上橡胶塞，摇匀后恒温培养；2)用蒸馏水补充至50－100ml；3)加入铝钾矾饱和溶液；振荡、过滤；4)取滤液加缓冲液、显色剂，在510nm下测定吸光值为A；5)计算样品中羟胺含量。本发明的优点主要有1)简化了操作步骤，减少了厌氧培养过程的复杂性和不确定性；2)显色灵敏度更高，将分析精确度提高了一个数量级；3)分析结果稳定可靠，重现性好。
文档编号C12Q1/26GK101082567SQ20061004680
公开日2007年12月5日 申请日期2006年6月2日 优先权日2006年6月2日
发明者武志杰, 史云峰, 陈利军, 王殳屹 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所