一种疏血通注射液的抗凝血酶活性测定方法
【专利说明】-种疏血通注射液的抗凝血酶活性测定方法
[0001 ]本申请是对专利号为201310596718.7的发明专利的分案申请。原申请的申请日为 2013年11月25日，申请号为201310596718.7，发明创造名称为一种疏血通注射液的抗凝血 酶活性测定方法。
技术领域
[0002] 本发明设及一种疏血通注射液的抗凝血酶活性测定方法，属于药品技术的领域。
【背景技术】
[0003] 疏血通注射液是水赔和地龙为原料制成的中药注射液，活血化疲，通经活络；用于 疲血阻络所致的中风中经络急性期，症见半身不遂，口舌歪斜、言语蹇涩；急性脑梗塞见上 述证候者;具有抗栓、溶栓、改善血液循环的作用。授权公告号CN 1192782C，公告日2005年3 月16日，发明名称"治疗屯、脑血管疾病的注射剂的制造方法及其产品"的发明专利公开了该 中药注射剂及其制备方法。
[0004] 目前疏血通注射液的执行标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准WS3-548 (Z-084)-2005(Z)，但是该标准中只是对化学成分进行测定和控制，缺乏生物学质控方法。 疏血通注射液具有抗凝血作用，为确保临床疗效，客观、有效、综合地对疏血通注射液的质 量进行控制，本发明提供了一种生物学的质控方法一一对其抗凝血酶活性进行了测定。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种疏血通注射液的抗凝血酶活性测定方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案和步骤实现：
[0007] 1、精密量取疏血通注射液适量，浓缩富集至一定浓度，作为供试品溶液；
[000引2、精密量取供试品溶液10~20化1，置适宜白瓷点滴板中，加入含纤维蛋白原的Ξ 径甲基氨基甲烧盐酸缓冲液(pH5.0-10.0)20~400μ1，揽匀，置水浴（30~45°C)溫热0~ 30min；
[0009] 3、滴加每1ml中含5~50单位的凝血酶溶液(边滴加边轻轻揽匀）至出现整块可挑 起透明凝胶状沉淀，记录消耗凝血酶溶液的体积；
[0010] 4、按下式计算抗凝血酶活性:U = CiVi/(C2V2);式中U--每1ml疏血通原液中含凝血 酶活性单位，U/ml; Cl-凝血酶溶液的浓度，U/ml; C2--供试品溶液的浓度，ml原液· mri; Vi--消耗凝血酶溶液的体积，μ1;ν2--供试品溶液的加入量，μ1。中和一个单位的凝血酶的 量，为一个抗凝血酶活性单位。
[0011]本发明的优点为:本发明提供了一种可W有效测定疏血通注射液抗凝血酶活性的 方法，该方法对中国药典一部"水赔"药材【含量测定】项测定水赔抗凝血酶活性的凝血酶滴 定法创新和改良，采用白瓷点滴板为反应载体，控制凝血酶滴定间隔时间、凝血酶浓度、揽 拌针揽拌频率，保证测定结果的稳定。本发明为疏血通注射液提供了一种生物学质控方法， 有助于综合评价其质量的可靠性和可控性，同时为进一步追踪活性成分奠定基础。
【附图说明】
[0012] 图1不同浓度疏血通注射液消耗凝血酶活性单位量
[0013] 图2不同浓度疏血通注射液抗凝血酶活性测定结果
【具体实施方式】
[0014] 为了更好地说明本发明（但不用来限制本发明的范围），下面通过实施例予W进一 步阐释。
[0015] W下实施例中所用到的相关试验仪器及试药如下：
[0016] DSY-1-6孔电热恒溫水浴锅(北京国华医疗器械厂）；AY1200型万分之一分析天平 (SHIMADZU日本岛津公司）；FE20K PH计（METTLER TOLEDO梅特勒-托利多有限公司）； Eppendorf移液器(2-2化1; 20化1);金雀牌J9-2II型电子秒表(上海手表五厂）。
[0017] 凝血酶(Biosharp，1000u，批号：BOO服031600);(牛血）纤维蛋白原（Biosharp，批 号：BOO服031600); Ξ径甲基氨基甲烧Tri s-Base (Biosha巧，批号：BOO服070100);其他试剂 均为分析纯。
[001引疏血通注射液，牡丹江友搏药业股份有限公司生产，批号：11091211、11091312、 11092011、11102022、11110312、111111211、11122521、12022011、12030321、12030622、 12031611、12032811、12040312、12051821、13012611、13021621、13022222、13070812、 13071321、13071412。
[0019] 实施例1疏血通注射液抗凝血酶活性测定方法的建立
[0020] 1、测试样品制备
[0021] 取50ml (批号：12040312)疏血通注射液，减压浓缩(50~60°C)至干，残渣加水溶解 并完全转移至5ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，则浓缩药液浓度为10ml原液· mri;将浓缩药 液与纯水W相应比例混合，制成10个浓度梯度疏血通药液作为测试用样品溶液，顺次编号 为1~10号。
[0022] 2、线性关系考察
[0023] 取一白瓷板洗净吹干后置于水浴锅中（37°C±0.5°C)预热，液面略低于白瓷板。精 密量取"1测试样品制备"项下不同浓度的测试样品溶液10化1，置白瓷板中，加入含0.5% (牛)纤维蛋白原的Ξ径甲基氨基甲烧盐酸缓冲液(pH7.4,临用配制）200μ1，揽匀，置水浴 (37±0.5°C )溫热5min，滴加每1ml中含10单位的凝血酶溶液(每Imin滴加1次，每次扣1，边 滴加边轻轻揽匀，每分钟揽拌10次左右)至出现整块可挑起透明凝胶状沉淀，记录滴定终点 时间和消耗凝血酶活性单位，按公式计算抗凝血酶活性。U = CiVi/(C2V2);式中U--每1ml疏 血通原液中含凝血酶活性单位，U/ml;Ci--凝血酶溶液的浓度，U/ml;C2--供试品溶液的浓 度，ml原液· mri;V广-消耗凝血酶溶液的体积，μ1;V2--供试品溶液的加入量，μ1。中和一个 单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。结果见表1、表2,图1、图2。
[0024] [注]溶液的配制
[0025] (1)Ξ径甲基氨基甲烧盐酸缓冲液的配制：取0.2mol/LS径甲基氨基甲烧溶液 25ml与0.1mol/L盐酸溶液约40ml，加水至100ml，调节抑值至7.4。
[00%] (2)凝血酶溶液的配制：取凝血酶试剂适量，加生理盐水配制成每1ml含凝血酶10 个单位的溶液(临用配制）。
[0027]表1不同浓度疏血通注射液消耗凝血酶活性单位量 [002引
[0029] 注表示未出现滴定终点，无法计算消耗凝血酶活性单位。疏血通注射液的浓 度单位为:ml原液.ml-i。
[0030] 表2不同浓度疏血通注射液滴定终点时间及抗凝血酶活性测定结果
[0031]
[0032]
[0033] 注表示生理盐水和浓度较高疏血通注射液无法测定抗凝活性。疏血通注射液 的浓度单位为:ml原液· mri。
[0034] 由表1、表2可见，当疏血通浓度为2.00~2.22ml原液· ml-i之间时，其滴定终点时 间和消耗凝血酶活性单位与生理盐水相当，因此其所测得的抗凝血活性数据是无效的；而 当疏血通浓度在2.50~4.44ml原液· mri之间时，疏血通浓度与消耗的凝血酶活性单位呈 良好线性关系(见图1)，因此可W较准确测定抗凝血活性;同时由图2可见，在此范围内所测 得疏血通的抗凝血酶活性也呈现较为稳定的状态(0.93~l.OlU/ml原液之间）；当疏血通浓 度大于5.00ml原液· mri时，其抗凝血酶活性极不稳定且有无法出现滴定终点的问题。 [00巧]综上，当疏血通注射液浓度在2.50~4.44ml原液· ml-i之间时，疏血通浓度与消耗 的凝血酶活性单位呈良好线性关系，可W较准确测定抗凝血活性。
[0036] 3、供试品溶液浓度的选择
[0037] 根据"2线性关系考