一种gbss1比酶活测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种GBSS1比酶活测定方法。提供了一种颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS1酶)比酶活测定的方法，应用ELISA技术对酶提取物在GBSS1蛋白水平上进行了定量，并对以往的GBSS1酶活测定步骤进行了简化。
【专利说明】—种GBSS1比酶活测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】；更具体地，本发明涉及一种GBSS I比酶活测定方法。【背景技术】
[0002]水稻腊质基因(Wx)编码的GBSSl (Granule-Bound Starch Synthase I,2.4.1.242)负责水稻种子胚乳中直链淀粉的合成(Sano Y et al (1985).Gamma FieldSymp, 24:63-77 ；Shapter et al (2009).J.Cereal Sci, 49:4-11)。水稻腊质基因的表达量、GBSSl酶活的高低与胚乳中直链淀粉的含量呈显著正相关(Wang ZY et al (1995).ThePlant Journal, 7:613-622 ；Sano Y et al (2008).Theor Appl Genet, 116:979-989)。近20多年来，水稻蜡质基因的表达与调控规律的研究及其在稻米品质改良上的应用研究取得了极大的进展。在上述研究过程中，GBSSl酶活的测定是经常用到的常规实验方法。
[0003]已有的GBSSl酶活的测定方法有两种，两种方法的原理都是根据GBSSl参与的酶促反应。第一种方法是用14C标记GBSSl酶促反应底物ADPG (腺苷二磷酸葡萄糖)中的葡萄糖加入反应体系，然后根据14C掺入反应产物中的量来定义其酶活水平(Singletary Gffet al (1997).Plant Physiol, 113:293-304)。第二种是间接测定的方法，它根据 GBSSl 参与的酶促反应中葡萄糖分子被转移入淀粉后，底物ADPG释放出ADP，再通过两步反应，最后检测NADPH的量来间接反映GBSSl的酶活。反应过程如下:
[0004]第一步反应是
[0005]
【权利要求】
1.一种测定作物种子中颗粒结合型淀粉合成酶的比酶活的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)从作物种子中提取颗粒结合型淀粉合成酶，获得酶提取液，作为待测样品；采用酶联免疫吸附测定获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量； (2)将待测样品与支链淀粉、底物ADPG进行如(I)反应并记录颗粒结合型淀粉合成酶反应时间:
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用制作标准曲线的方法获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，标准曲线如下制作:将颗粒结合型淀粉合成酶标准品进行梯度稀释，记录每一梯度酶浓度，蛋白变性后，应用酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合 型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后显色反应，测定光吸收值，将每一梯度酶浓度样品的光吸收值对酶浓度制成标准曲线。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量包括:将待测样品进行蛋白变性，应用颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后进行显色反应，测定光吸收值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的颗粒结合型淀粉合成酶的浓度；进而获得颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用制作标准曲线的方法测定产物ATP量。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将ATP标准品进行梯度稀释，测定每一梯度浓度ATP的发光值，将获得的每一梯度浓度ATP的发光值对ATP浓度制成标准曲线。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，测定产物ATP量的方法包括: 测定产物中ATP的发光值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的ATP浓度；进而获得产物ATP量。
8.如权利要求2-7任一所述的方法，其特征在于，对所述的待测样品、产物进行倍数稀释。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(I)反应包括:将待测样品加入到反应液I中，待测样品与反应液I体积比为:1: (1.5-2.1)，反应10-30min，终止反应后冰浴；其中反应液 I 包括:50mmol/L HEPES-NaOH ；1.6mmol/L ADPG ；0.7mg/ml 支链淀粉；15mmol/L DTT。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(II)反应包括:在(I)反应的产物中加入反应液II，30±2°C反应20±10min，终止反应；其中反应液II包括:50mmoI/LHEPES-NaOH ；4mmol/L PEP-K ；200mmol/L KCl ；10mmol/L MgCl2 ；1.2 单位丙酮酸激酶。
【文档编号】G01N33/573GK103808929SQ201210445572
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月8日 优先权日:2012年11月8日
【发明者】蔡秀玲, 刘德瑞 申请人:中国科学院上海生命科学研究院