专利名称：腺苷脱氨酶活性测定方法及腺苷脱氨酶诊断试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种腺苷脱氨酶活性测定方法，同时本发明还涉及用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水、脑脊液鉴别诊断、重症联合免疫缺陷病(SCID)、急、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。
腺苷脱氨酶的活性测定方法较多，主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是腺苷(Adenosine)+水(H2O)腺苷脱氨酶肌苷(Inosine)+氨离子(NH4+)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。
检索发现，申请号为03128092.7、申请日为2003.05.29、名称为《一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法》的中国专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。该发明的特点在于为腺苷脱氨酶的测试提供一个内源合成腺苷脱氨酶反应所需要的底物—还原型烟酰胺辅酶—的腺苷脱氨酶试剂。其缺点为这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰胺辅酶的同时，也抵消了部分腺苷脱氨酶试剂(腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶反应必定将还原型烟酰胺辅酶氧化成氧化型烟酰胺辅酶)的活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种不需要还原型烟酰胺辅酶，并且借助可见光分析仪即可测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂，从而大大方便通过测定腺苷脱氨酶活性的进行良恶性胸腹水、脑脊液鉴别诊断、重症联合免疫缺陷病(SCID)、急、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等等各种疾病的诊断，使之可以在中、小医院得到推广应用。
本发明腺苷脱氨酶活性测定方法步骤如下1、腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子2、肌苷+单价磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖3、次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢4、过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水5、将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400——600nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处直接反映吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)含量高低的光吸收大小，得出腺苷脱氨酶测定结果。
用于实现以上方法的腺苷脱氨酶诊断试剂主剂为腺苷、单价磷酸盐、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。
以上主剂按如下比例组合，测定结果较好腺苷1——50mmol/l单价磷酸盐 0.2——10mmol/l核苷磷酸酶 500——50000U/l黄嘌呤氧化酶500——50000U/l过氧化物酶 500——50000U/l还原型色原体组合0.1——20mmol/l其余是缓冲液、稳定剂。
以上测定的温度控制在20℃到50℃，各反应步骤的反应时间控制在2-30分钟，各试剂以基本相同的剂量按步骤加入，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的比例、即样品试剂比控制在1/10到1/250，可以获得较好的测定结果。
以上还原型色原体组合(Chromogen)可以是0.5-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone简称MBTH)或0.5-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)与0.1——20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine简称ESPAS)N，N-双乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-双氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid简称TBHB)3，5-双氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid简称DHBS)
N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine-sodium简称TOOS)仨溴羟基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)双甲基苯胺(Dimethylaniline简称DMA)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine简称EHSPT)2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)简称ABTS4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoicacid)简称HMB)3-甲基-乙基-羟基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline简称MEHA)本发明的测定方法通过腺苷脱氨酶、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶等一系列的酶偶联反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的吲嗒胺色原或醌亚胺色原，从而可以通过可见光分析仪器，在400——600nm波长处，测定吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量的高低，进而直接反映出腺苷脱氨酶活性的大小，为多种疾病的诊断提供方便，整个测定过程只需按步骤加入试剂即可，一气呵成，便于操作。与现有技术相比，本发明不仅便于推广应用，而且由于所生成的吲嗒胺色原或醌亚胺色原均有较高的摩尔消光系数，因此灵敏度高、精确度好。此外，反应过程中的成分都是外加的，所以不受内外源物质的污染。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂有缓冲液100mmol/l
腺苷 10mmol/l单价磷酸盐5mmol/l核苷磷酸酶6000U/l黄嘌呤氧化酶 8000U/l过氧化物酶20000U/l4-氨基抗砒2mmol/l石碳酸10mmol/l测定腺苷脱氨酶活性时，温度控制在36.5——37.5℃，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的比例约为1/25，具体测定步骤为1、腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子2、肌苷+单价磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖3、次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢4、过氧化氢+4-氨基抗砒+石碳酸过氧化物酶醌亚胺色原+水5、将最终反应物置于可见光分析仪下，检测500nm处的醌亚胺色原含量的高低，得出腺苷脱氨酶测定结果。
各反应步骤的反应时间控制在8-12分钟。
实施例二本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂有缓冲液 100mmol/l腺苷5mmol/l单价磷酸盐 1mmol/l核苷磷酸酶 800U/l黄嘌呤氧化酶800U/l过氧化物酶 800U/l4-氨基抗砒 0.6mmol/l2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/l
测定腺苷脱氨酶活性时，温度控制在29——31℃，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的比例约为1/15，具体测定步骤为1、腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子2、肌苷+单价磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖3、次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢4、过氧化氢+4-氨基抗砒+2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸过氧化物酶醌亚胺色原+水5、将最终反应物置于可见光分析仪下，检测546nm处的醌亚胺色原含量的高低，得出腺苷脱氨酶测定结果。
各反应步骤的反应时间控制在4-6分钟。
实施例三本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂有缓冲液 100mmol/l腺苷45mmol/l单价磷酸盐 8mmol/l核苷磷酸酶 40000U/l黄嘌呤氧化酶42000U/l过氧化物酶 50000U/l3-甲基-2-苯噻唑酮腙 15mmol/l双甲基苯胺 18mmol/l测定腺苷脱氨酶活性时，温度控制在24——26℃，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的比例约为1/200，具体测定步骤为1、腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子2、肌苷+单价磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖3、次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢4、过氧化氢+3-甲基-2-苯噻唑酮腙+双甲基苯胺过氢化物酶吲嗒胺色原+水5、将最终反应物置于可见光分析仪下，检测578nm处的吲嗒胺色原含量的高低，得出腺苷脱氨酶测定结果。
各反应步骤的反应时间控制在14-16分钟。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染。
权利要求
1.一种腺苷脱氨酶活性测定方法，步骤如下1)、腺苷+ 水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子2)、肌苷+单价磷酸盐核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖3)、次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢4)、过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水5)、将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400——600nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收大小，得出腺苷脱氨酶测定结果。
2.根据权利要求1所述腺苷脱氨酶活性测定方法，其特征在于测定温度控制在20℃到50℃。
3.根据权利要求2所述腺苷脱氨酶活性测定方法，其特征在于被测腺苷脱氨酶样品与试剂的比例控制在1/10到1/250。
4.根据权利要求2或3所述腺苷脱氨酶活性测定方法，其特征在于各反应步骤的反应时间控制在2-30分钟。
5.一种腺苷脱氨酶诊断试剂，主剂为腺苷、单价磷酸盐、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。
6.根据权利要求5所述腺苷脱氨酶诊断试剂，其特征在于所述主剂的比例为腺苷 1——50mmol/l单价磷酸盐 0.2——10mmol/l核苷磷酸酶 500——50000U/l黄嘌呤氧化酶 500——50000U/l过氧化物酶 500——50000U/l还原型色原体组合0.1——20mmol/l其余是缓冲液、稳定剂。
7.根据权利要求6所述腺苷脱氨酶诊断试剂，其特征在于所述还原型色原体为0.5-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙与0.1-20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺N，N-双乙基-m-甲苯胺2，4-双氯石碳酸2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3，5-双氯石碳酸磺酸3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐仨溴羟基苯甲酸双甲基苯胺N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)4-羟基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-乙基-羟基苯胺。
8.根据权利要求6所述腺苷脱氨酶诊断试剂，其特征在于所述还原型色原体组合为由0.5-20mmol/l的4-氨基抗砒与0.1-20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺N，N-双乙基-m-甲苯胺2，4-双氯石碳酸2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3，5-双氯石碳酸磺酸3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐仨溴羟基苯甲酸双甲基苯胺N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)4-羟基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-乙基-羟基苯胺。
全文摘要
本发明涉及一种腺苷脱氨酶活性测定方法，同时本发明还涉及用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂，属于医学检验测定技术领域。本发明以腺苷、单价磷酸盐、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合为诊断试剂主成分，通过一系列的酶偶联反应，将最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400－600nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出腺苷脱氨酶活性的大小，为多种疾病的诊断提供方便。与现有技术相比，本发明不仅便于推广应用，而且由于所生成的染料均有较高的摩尔消光系数，因此灵敏度高、精确度好。此外，反应过程中的成分都是外加的，所以不受内外源物质的污染。
文档编号C12Q1/25GK1641043SQ20041001409
公开日2005年7月20日 申请日期2004年2月18日 优先权日2004年2月18日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司