一种微球生物新材料包裹sod活性药物载体制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种微球生物新材料包裹SOD药物载体制备方法，它由空白壳聚糖微球的制备、SOD壳聚糖微球的制备、SOD壳聚糖微球载药量及其包封率的测定、SOD壳聚糖微球体外释药试验完成其制备；本SOD壳聚糖微球在光学显微镜下观察表面光滑均匀，在生理盐水中分散性好，粒径范围1.2~3.8um；SOD壳聚糖微球制备过程反应条件温和，不需有机溶剂，pH接近中性，SOD的活性损失小；待测样品平均值0.3，壳聚糖微球中SOD含量5KU=10mg或5.31×104U/g，包封率97.3%；本发明方法适于我国批量生产SOD保健品、美容酶制剂SOD化妆品，同时也为SOD药用酶制剂的生产应用提供了新的技术方法。
【专利说明】
一种微球生物新材料包裹SOD活性药物载体制备方法
[0001 ]
技术领域： 本发明涉及分子新材料生物技术领域，特指利用壳聚糖作为医用级S0D生物新材料制 备药物载体缓释、控释制剂用于药物临床及抗癌高效给药提供新途径新用途。
[0002]
【背景技术】： 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，S0D)是生物体内清除超氧阴离子自由基的 唯一的酶，是清除氧毒害的关键防线，因此，在临床上，S0D已经作为药物用于治疗早产儿由 于氧中毒而引起的呼吸系统疾病；另有研究表明，S0D对于神经和免疫系统疾病都有辅助治 疗作用，但S0D作为药用酶在应用上还存在以下缺陷:分子量偏大，体内半衰期短、给药次数 多、易被蛋白酶降解、利用率低等不易透过细胞膜等;为解决以上问题，国内科研者尝试对 S0D进行分子修饰，国内外多用一些水溶性高分子物质如聚乙二醇（PEG)、 polyacryloymorpholin、右旋糖酐、淀粉等作为修饰材料，PEG与S0D中的E-NH2缩合，无毒， 无免疫原性，活化简单但回收率低。 S0D在溶液中容易失活，无法长期保存，单纯地将S0D植入机体内，S0D很容易在机体内 被扩散、稀释、降解，生物利用度很低，且应用效果差，这就需要将S0D加入合适的载体中，使 其免受蛋白酶降解或扩散，在需要的地方较长时间控制释放，并保持其生物活性;通常做法 是加入保护物质如海藻糖、PEG等，或加入修饰材料有聚乙二醇、右旋糖酐、聚蔗糖、明胶、淀 粉、同源白蛋白以及聚烯属烃基氧化物等进行化学修饰，增强其稳定性，然后加入适合的载 体物质，製成脂质体(1 iposome)或微囊；由于S0D主要应用化妆品、食品及医疗保健上，不仅 要求S0D生產过程中及添加物质无污染、无毒，而且要保持S0D活力、不要被降解，同时还要 保证S0D在人体作用部位能正确释放。
[0003] S0D具有广泛的药理作用，在药物作用机理研究方面已经深入到分子水平，动物试 验研究已在基因治疗、与其他药物联合治疗、分子修饰等方面取得了一定的进展，临床研究 也进行了有意义的探索，但是总体来说还有一些问题需要解决：（1)进一步阐明S0D的抗氧 化作用及引起的体内抗氧化网络体系的一系列变化，寻求更佳的给剂途径；（2)进行S0D的 分子修饰和改构，进一步延长体内半衰期，减少使用剂量，从而降低S0D反应产物过氧化 氢引起的副作用；（3)进一步提高S0D体外表达水平，提高比活性，以适应产业化的需求。
[0004] 与现有技术相比较:刘玲，袁勤生(2003)等利用复乳溶剂挥发法制备了超氧化物 歧化酶(S0D)的乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)微球，采用超声w/ 〇/ w复乳溶剂挥发法制备 蛋白质微球，只是初步研究S 0 D对微球粒径、包封率、体外释放等的影响； StefanoGiovagnolipoly(D，L-lactide-co_glycolide)PLGA 制作S0D 微球，对于相对分子品 质较低的聚合物(Mr〈10 000)，药物可均勾分散于纳米颗粒中，但对于相对分子品质较大 的聚合物，由于溶解度小甚至不溶，而限制了这项技术的应用，有必要对现有制球方法进行 改进和创新。
[0005] 近年来，S0D生产及应用实践表明，现有的酶固定化修饰改造和脂质体技术，虽然 具有良好的酶活性及稳定性，在制药加工、临床检测及卫生防疫方面具有广泛用途，关于壳 聚糖作为微囊、微球的囊材或载体，已有相当多的报道，可用于激素类、抗生素、抗癌药、疫 苗、抗原、活细胞等物质;对于用壳聚糖来辅助多肽和蛋白质类等生化物质的微囊化，是正 在发展又非常有前景的课题;利用壳聚糖所制得的微囊或微球可以增加蛋白质、多肽类的 药物稳定性，降低药物在体内的副作用，延长药物疗效；目前利用壳聚糖微球包裹SOD作为 药物载体缓释、控释制剂尚未见报道，我们采用壳聚糠微球制备技术来解决SOD给药的问 题，为SOD的高效给药提供新途径。
[0006]
【发明内容】
： 本发明的目的是提出一种微球生物新材料包裹S0D活性药物载体制备方法，特别是一 种微球生物新材料包裹S0D药物载体制备方法。
[0007] 本发明是采用如下技术方案实现其发明目的的：一种微球生物新材料包裹S0D药 物载体，它由空白壳聚糖微球的制备1、S0D壳聚糖微球的制备2、S0D壳聚糖微球载药量及其 包封率的测定3、S0D壳聚糖微球体外释药试验4四个步骤完成其制备方法： 空白壳聚糖微球的制备1:取壳聚糖l〇〇g溶解于l〇〇〇mL 2%冰醋酸溶液中，磁力搅拌，加 吐温-80 l.OmL，磁力搅拌和超声处理，滴加30% Na2S〇4溶液，至上述溶液混浊，通过紫外 分光光度计于500 min处测定其池度来判定微球的形成，微球形成后继续搅拌及超声处理 lh，离心分离，取10000~12000 r/min，离心15 min，将所得沉淀物重新悬浮于水中洗涤纯 化，冷冻干燥，备用；另用含0.2%吐温-80的生理盐水分散，用扫描电子显微镜（SEM)和光学 显微镜观察微球外观形态，粒度分析仪测定微球粒径分布，用光学显微镜采用显微计数法 求平均粒径，每次计数200个，计数3次； S0D壳聚糖微球的制备2:选择医用级S0D，酶活力大于5.0X106 U/ g.蛋白样品，待配 制，用100克冷冻干燥的空白壳聚糖微球悬浮于250mL醋酸缓冲液中（pH= 6. 2)，加入lg，5 X106U/ g SOD于1000 mL水溶液，4°C下磁力搅拌，10000~12000 r/min离心沉淀，沉淀（ 微球）以去离子水洗3次，真空干燥，于4°C储存;将沉淀物重新洗涤纯化、冷冻干燥;将离心 液和洗涤液收集合并，得载药微球、分散液浓度为每l〇ml含S0D50000U(单位)微球合并液， 即S0D微球合并液； S0D壳聚糖微球载药量及其包封率的测定3:根据S0D酶联免疫检测试剂提供的方法，用 DG320酶联免疫检测仪，于492 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线；将上述S0D壳聚糖微球 的制备2步骤所得的"S0D微球合并液"用PBS稀释至100mL，然后取10uL并用roS稀释至100u L，作为待测样品，测定A492值;按下式计算SOD壳聚糖微球的载药量及包封率： 载药量(％)=(投药量-合并液中药量）/微球重量X100% 包封率(％)=(投药量-合并液中药量）/投药量X100% S0D壳聚糖微球体外释药试验4 :取1 OmgS0D壳聚糖微球，混悬于10.0 mLPBS溶液（ ρΗ7·4,0·1 mol/ L)中，37°C恒温下磁力搅拌，按时取样离心（10 000 r/min)15min，取上清 液10u L，按一定比例稀释，按上述S0D壳聚糖微球的制备2的方法测定S0D的浓度，以测算 S0D的体外释放规律； 在偏酸的条件下，水溶性药物如S0D较易被吸附进入壳聚糖微球内部，只需约6小时吸 附即达平衡;在体外PH7.2缓冲液中，壳聚糖微球能够缓慢控制释放S0D，初始有药物突释现 象，dlO释放度约为38.6%，至d20累积释放度约75.1%。
[0008] 由于采用上述技术方案，本发明采用沉淀凝聚法制备壳聚糖微球，再用壳聚糖微 球包裹S0D，制成S0D壳聚糖微球，S0D蛋白活性影响很小，本方法所制备的S0D壳聚糖微球在 光学显微镜下观察表面光滑，大小较均匀，在生理盐水中分散性好，粒径范围1. 2~3. 8um; SOD壳聚糖微球载药量及其包封率，在壳聚糖微球制备过程反应条件温和，不需要有 机溶剂，pH接近中性，SOD的活性损失很小，我们通过测定SOD壳聚糖微球制备后剩余SOD量 来推算微球中SOD含量;SOD标准曲线回归方程为:Y= 0.003 5C+ 0. 053 1( C:ng/ mL，r= 1);待测样品Α·平均值为0 · 3，壳聚糖微球中SOD含量为5KU=10mg或5 · 31 X 104U/g，包封 率为97.3%; SOD壳聚糖微球为浅蓝绿色或白色致密球体;本发明方法适于我国现行生产条 件批量生产SOD保健品、美容酶制剂SOD化妆品，同时也为SOD药用酶制剂的生产应用提供了 新的技术方法。
[0009] 本方法制得的S0D壳聚糖微球包封药物有以下特点：1.有明显的控制药物释放和 延长药效的作用，减少给药次数;2.增加药物的靶向性，提高药物的利用率;3.降低所包封 药物的毒副作用;4.可控释给药，延长S0D的半衰期;可增强S0D稳定性提高药物的稳定性； 5.体积微小，可透过组织的间隙，提高疏水性药物对细胞膜的通透性。
[0010]
【附图说明】： 附图1是本发明工艺流程示意图。
[0011] 附图标记说明见说明书最后一页表格。
[0012]
【具体实施方式】： 下面结合附图对
【发明内容】
作进一步说明： 实施例1: 由
【发明内容】
可知，一种微球生物新材料包裹S0D药物载体，它由空白壳聚糖微球的制备 1、S0D壳聚糖微球的制备2、S0D壳聚糖微球载药量及其包封率的测定3、S0D壳聚糖微球体外 释药试验4四个步骤完成其制备方法： 空白壳聚糖微球的制备1:取壳聚糖l〇〇g溶解于l〇〇〇mL 2%冰醋酸溶液中，磁力搅拌，加 吐温-80 l.OmL，磁力搅拌和超声处理，滴加30% Na2S〇4溶液，至上述溶液混浊，通过紫外 分光光度计于500 min处测定其池度来判定微球的形成，微球形成后继续搅拌及超声处理 lh，离心分离，取10000~12000 r/min，离心15 min，将所得沉淀物重新悬浮于水中洗涤纯 化，冷冻干燥，备用；另用含0.2%吐温-80的生理盐水分散，用扫描电子显微镜（SEM)和光学 显微镜观察微球外观形态，粒度分析仪测定微球粒径分布，用光学显微镜采用显微计数法 求平均粒径，每次计数200个，计数3次； S0D壳聚糖微球的制备2:选择医用级S0D，酶活力大于5.0X106 U/ g.蛋白样品，待配 制，用100克冷冻干燥的空白壳聚糖微球悬浮于250mL醋酸缓冲液中（pH= 6. 2)，加入lg，5 X106U/ g SOD于1000 mL水溶液，4°C下磁力搅拌，10000~12000 r/min离心沉淀，沉淀（ 微球）以去离子水洗3次，真空干燥，于4°C储存;将沉淀物重新洗涤纯化、冷冻干燥;将离心 液和洗涤液收集合并，得载药微球、分散液浓度为每l〇ml含S0D50000U(单位)微球合并液， 即S0D微球合并液； S0D壳聚糖微球载药量及其包封率的测定3:根据S0D酶联免疫检测试剂提供的方法，用 DG320酶联免疫检测仪，于492 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线；将上述S0D壳聚糖微球 的制备2步骤所得的"S0D微球合并液"用PBS稀释至100mL，然后取10uL并用roS稀释至100u L，作为待测样品，测定A492值;按下式计算SOD壳聚糖微球的载药量及包封率： 载药量(％)=(投药量-合并液中药量）/微球重量X100% 包封率(％)=(投药量-合并液中药量）/投药量x 100% sOD壳聚糖微球体外释药试验4 :取1 OmgSOD壳聚糖微球，混悬于10.0 mLPBS溶液（ ρΗ7·4,0·1 mol/ L)中，37°C恒温下磁力搅拌，按时取样离心（10 000 r/min)15min，取上清 液10u L，按一定比例稀释，按上述SOD壳聚糖微球的制备2的方法测定SOD的浓度，以测算 SOD的体外释放规律； 在偏酸的条件下，水溶性药物如SOD较易被吸附进入壳聚糖微球内部，只需约6小时吸 附即达平衡;在体外PH7.2缓冲液中，壳聚糖微球能够缓慢控制释放SOD，初始有药物突释现 象，dlO释放度约为38.6%，至d20累积释放度约75.1%。
[0013] 实施例2: 抗癌S0D微球药物实验 (1)取100mg冷冻干燥的壳聚糖微球悬浮于250mL醋酸缓冲液中（pH= 6.2)，加入5 X 103 U/mLS0D 1.0mL，4°C下磁力搅拌，10000~12000r/min离心沉淀，沉淀(微球）以去离子水洗3 次，真空干燥，于4 °C储存;将沉淀物重新洗涤纯化、冷冻干燥;将离心液和洗涤液收集合并， 得载药微球、分散液称"S0D微球合并液"；壳聚糖微球中S0D含量为5KU=10mg或5.31 X l〇4U/g，包封率为97. 3%;冷冻干燥制得50000U/g-S0D微球，感官为浅蓝绿色或白色致密球 体。
[0014] (2)磁性抗癌微球自然累积释药速率:精确称取抗癌S0D微球50mg，共4份；乙醚洗 净油膜，每份加生理盐水5mg，置密闭瓶中37°C温浴振摇;分别放置12 h、24 h、48h、96 h过 滤；取适量滤液按一定比例稀释后，紫外分光光度计测定各样品含量，计算药物累积释放 率;实验结果:抗癌S0D微球溶液释放速率，在37°C恒温中放置12h、24h、48h、96h的自然累 积释药速率分别为52.17%、67.12%、72.19%和74.14%。
[0015] (3)抗癌SOD微球磁场体外导向试验：内径4mm的塑料管50cm水平放置，以不同恒 速灌注15%的抗癌S0D微球生理盐水混悬液;管身中段放置4000GS双极永磁铁，极间距为 10mm，观察不同流速时，磁球滞留情况;实验结果:在4000GS磁场中，流速为每分钟10 cm、20 cm、60 cm、90cm时，微球滞留率分别为98%、87%、41%、29%;因人体微血管流速不超过3〇11/ min，故在很小磁场作用下，磁性微球即可滞留于毛细血管床中。
[0016] (4)抗癌S0D微球血管磁场导向试验：SD大白鼠10只，随机分为甲、乙两组;每只鼠 尾由近侧端依次均分为A、B、C三个区段;切开鼠尾根部暴露鼠尾动脉，5号头皮针插入A 区5mm，以0.15 ml/min的速度注入10%磁性抗癌微球盐水混悬液0.12 ml，甲组B区放置 4000GS双极磁铁30分钟，乙组不放磁铁40分钟后处死大白鼠，分离并精确称量两组B区滞留 磁球重量。
[0017] (5)抗癌S0D微球组织磁场导向试验:家兔8只，随机分为A、B两组;A组：左后腿 局部注射20%抗癌S0D微球盐水混悬液lml，注射完毕在注射部位放置4000 GS双极磁场;B 组：左后腿局部注射相同剂量悬液不加磁场;A组30 min后去除磁场;在15min时X线透视 下局部观察;3d后处死动物，剥离收集两级B区未被吸收的剩余磁球，精确称重。
[0018] 上述实验表明：根据局部用药的情况，按抗癌S0D微球的粒经在10~20 Lm设计较 为适宜;这样既可用普通61/ 2号针头顺利吸取注射，又可较长时间地缓释药物，使微球 成为肿瘤组织内抗癌药的"储存器"；抗癌S0D微球混悬液组织内注射后，迅速分布于局部， 在体表相应部位磁场的作用下，磁球滞留于局部，较长时间地溶出释放高浓度抗癌药，利于 集中杀伤癌细胞;局部磁场去除后，由于稀释液已被吸收，局部微球密度增大，粘度增加，限 制了微球向远处扩散，大大减少了抗癌药的全身分布。
[0019]本发明所述的微球生物新材料是指壳聚糖(Chitosan)，是甲壳素（Chitin)的部 分脱乙酰基产物，是自然界中存在的唯一碱性多糖，作为甲壳素的衍生物，壳聚糖无毒，具 有生物相容性和生物可降解性，有抗菌消炎，促进伤口愈合，抗酸，抗溃疡，降血脂和降胆固 醇等多种作用，因而成为医药界研究的热点之一;壳聚糖来源丰富，制备简单，且具有无毒、 无免疫原性、良好组织相容性、生物可降解性，在体内能完全降解并代谢;其分解产物及代 谢产物对人体健康无害，已应用于制备手术缝合线、人工皮肤、伤口愈合材料、抗凝血药物、 药物释放体系等。
【主权项】
1. 一种微球生物新材料包裹SOD活性药物载体制备方法，其特征是它由空白壳聚糖微 球的制备1、S0D壳聚糖微球的制备2、S0D壳聚糖微球载药量及其包封率的测定3、S0D壳聚糖 微球体外释药试验4四个步骤完成其制备方法： 空白壳聚糖微球的制备1:取壳聚糖l〇〇g溶解于l〇〇〇mL 2%冰醋酸溶液中，磁力搅拌，加 吐温-80 l.OmL，磁力搅拌和超声处理，滴加30% Na2S〇4溶液，至上述溶液混浊，通过紫外 分光光度计于500 min处测定其池度来判定微球的形成，微球形成后继续搅拌及超声处理 lh，离心分离，取10000~12000 r/min，离心15 min，将所得沉淀物重新悬浮于水中洗涤纯 化，冷冻干燥，备用；另用含0.2%吐温-80的生理盐水分散，用扫描电子显微镜（SEM)和光学 显微镜观察微球外观形态，粒度分析仪测定微球粒径分布，用光学显微镜采用显微计数法 求平均粒径，每次计数200个，计数3次； SOD壳聚糖微球的制备2:选择医用级S0D，酶活力大于5.0X106 U/ g.蛋白样品，待配 制，用100克冷冻干燥的空白壳聚糖微球悬浮于250mL醋酸缓冲液中（pH= 6. 2)，加入lg，5 X106U/ g SOD于1000 mL水溶液，4°C下磁力搅拌，10000~12000 r/min离心沉淀，沉淀（ 微球）以去离子水洗3次，真空干燥，于4°C储存;将沉淀物重新洗涤纯化、冷冻干燥;将离心 液和洗涤液收集合并，得载药微球、分散液浓度为每l〇ml含S0D50000U(单位)微球合并液， 即SOD微球合并液； SOD壳聚糖微球载药量及其包封率的测定3:根据SOD酶联免疫检测试剂提供的方法，用 DG320酶联免疫检测仪，于492 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线；将上述SOD壳聚糖微球 的制备2步骤所得的"SOD微球合并液"用PBS稀释至100mL，然后取10uL并用roS稀释至100u L，作为待测样品，测定A492值;按下式计算SOD壳聚糖微球的载药量及包封率： 载药量(％)=(投药量-合并液中药量）/微球重量X100% 包封率(％)=(投药量-合并液中药量）/投药量X100% SOD壳聚糖微球体外释药试验4:取lOmgSOD壳聚糖微球，混悬于10.0 mLPBS溶液（ ρΗ7·4,0·1 mol/ L)中，37°C恒温下磁力搅拌，按时取样离心（10 000 r/min)15min，取上清 液10u L，按一定比例稀释，按上述SOD壳聚糖微球的制备2的方法测定SOD的浓度，以测算 SOD的体外释放规律； 在偏酸的条件下，水溶性药物如SOD较易被吸附进入壳聚糖微球内部，只需约6小时吸 附即达平衡;在体外PH7.2缓冲液中，壳聚糖微球能够缓慢控制释放SOD，初始有药物突释现 象，dlO释放度约为38.6%，至d20累积释放度约75.1%。2. 根据权利要求1中所述的一种微球生物新材料包裹SOD活性药物载体制备方法，其特 征是在于SOD壳聚糖微球为浅蓝绿色或白色致密球体。3. 根据权利要求1中所述的一种微球生物新材料包裹SOD活性药物载体制备方法，其特 征在于在光学显微镜下观察表面光滑，大小较均匀，在生理盐水中分散性好，粒径范围1. 2 ~3. 8um〇4. 根据权利要求1中所述的一种微球生物新材料包裹SOD活性药物载体制备方法，其特 征是壳聚糖微球中300含量为51(1]=1011^或5.31\10 41]/^，包封率为97.3%。5. 根据权利要求1中所述的一种微球生物新材料包裹SOD活性药物载体制备方法，其特 征是SOD壳聚糖微球制备药物载体缓释、控释制剂用于药物临床及抗癌高效给药的应用。
【文档编号】A61K9/16GK105997892SQ201610358799
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】左有权
【申请人】湖南海熙生物科技有限公司