一种定量RNaseH活性测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量RNaseH活性测定方法，所述方法包括如下步骤：以一段RNA模板为底物，在DNA引物存在下，利用逆转录酶合成cDNA，形成DNA-RNA杂合链；以该DNA-RNA杂合链为底物，加入RNaseH酶，进行降解反应；降解反应后测定DNA单链或DNA-RNA杂合链的相对量，由该测定结果推导出RNaseH酶的活性程度。该方法与现有技术方法相比，无放射性污染，操作简单便利，逆转录方法得到的DNA-RNA杂合链可直接用于RNaseH的测活，不需要再经过酚氯仿抽题、乙醇沉淀等步骤，并且可以RNaseH活性进行定量的检测分析。
【专利说明】一种定量RNaseH活性测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生化【技术领域】，具体来说涉及一种定量RNaseH活性测定方法。
【背景技术】
[0002] RNaseH，即核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂 合链中的RNA。RNase H是基因工程技术中一种重要的工具酶，其应用包括cDNA第二条链 合成前去除mRNA ;通过互补的DNA序列实现对RNA的定点剪切；除去杂交到poly (dT)上的 mRNA中的poly(A);体外多腺苷酸化反应（polyadenylation reaction)产物研究。此外， RNaseH在逆转录病毒中起着非常重要的作用，并且也是目前非转录病毒的重要药物靶标。 因此，精确、快速、简便测定RNase H活性，可以保证RNase H作为工具酶的质量稳定性，且 有助于促进抗病毒药物的开发，具有极大的理论和现实意义。
[0003] 标准的RNaseH测活方法采用放射性同位素法。将RNaseH进行2倍连续梯度稀释， 加入到含％1〇17〇^)、？〇17((11')0嫩和1\1?1^6!1缓冲液的5(^1^反应体系中，371：条 件下孵育，产物用TCA沉淀并加在Whatman滤纸上，就可以实现掺入产物和标记物的分离。 再经过洗涤、干燥、洗脱，最后测定酸可溶性物质中放射性同位素的量，就可以计算出RNase H的活性。这种方法存在易产生放射性污染、步骤多、周期长的缺陷，难以实现高通量、自动 化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于建立一种简便、快速、非放射性且定量的RNaseH测活方法，其 原理如图1所示。
[0005] 具体来说，本发明采用了如下技术方案： 一种定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以一段RNA模板 为底物，在DNA引物存在下，利用逆转录酶合成cDNA，形成DNA-RNA杂合链；以该DNA-RNA杂 合链为底物，加入RNaseH酶，进行降解反应；降解反应后测定DNA单链或DNA-RNA杂合链的 相对量，由该测定结果推导出RNaseH酶的活性程度。
[0006] 优选地，DNA单链或DNA-RNA杂合链的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得 的，并且该相对量是以荧光强度表示的。更优选，所用的荧光染料是双链特异性荧光染料。 在一个实施方案中，所用的双链特异性突光染料是商购的picogreen染料。
[0007] RNA模板可以采用任何适合长度的RNA单链，只要能方便地测定RNaseH酶活即可。 在一个实施方案中，所用RNA模板为一段polyA RNA单链，所用的DNA引物为Oligo dT。
[0008] 本发明的优点： 1. 无放射性污染； 2. 操作步骤简单，重复性好，稳定性强，反应迅速； 3. 逆转录方法得到的DNA-RNA杂合链可直接用于RNaseH的测活，不需要再经过酚氯 仿抽题、乙醇沉淀等步骤； 4.可以对RNaseH活性进行定量的检测分析，便于操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1为本发明测定方法的原理图。
[0010] 图2为通过本发明方法测得的RNaseH活性-荧光强度曲线图。
[0011] 图3为不同来源RNaseH的酶活-荧光强度曲线图。
【具体实施方式】
[0012] 本发明建立了一种简便、快速、非放射性且定量的RNaseH测活方法，其原理如图1 所示。
[0013] 如图1所示，本发明选择PolyA作为RNA单链，以Oligo dT为引物，先用逆转录酶 进行相匹配的cDNA链的合成，生成的DNA-RNA杂合链作为本测活方法中的底物。若加入 RNaseH，则该酶会降解DNA-RNA杂合链中的RNA链，产生一条DNA单链，该单链不能被双链 特异性的Picogreen染料结合，不产生荧光；若不加入RNaseH，体系中仍是DNA-RNA杂合链 的结构，贝 1J可以被双链特异性的picogreen染料结合，发出突光。
[0014] 由此可见，RNaseH的活性在一定范围内同DNA-RNA杂合链的量成反比，而DNA-RNA 杂合链的量在一定情况下，同荧光强度成正比。因此，RNaseH的活性就可以用picogreen荧 光强度来进行测定。
[0015] 本发明人进一步证明了上述假设，从而建立了非放射性、简便、快速且可以定量的 RNaseH测活方法。
[0016] 下面将结合具体实施例来进一步说明本发明。
[0017] 实施例1.荧光法测定RNaseH活性方法的建立 1. 构建DNA+RNA杂合链体系： 逆转录酶为PrimeScript逆转录酶（TaKaRa 2680A)
【权利要求】
1. 一种定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以一段 RNA模板为底物，在DNA引物存在下，利用逆转录酶合成cDNA，形成DNA-RNA杂合链；以 该DNA-RNA杂合链为底物，加入RNaseH酶，进行降解反应；降解反应后测定DNA单链或 DNA-RNA杂合链的相对量，由该测定结果推导出RNaseH酶的活性程度。
2. 如权利要求1所述的定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，DNA单链或DNA-RNA 杂合链的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且该相对量是以荧光强度表示的。
3. 如权利要求2所述的定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，所用的荧光染料是双 链特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，所用的双链特异性荧 光染料是picogreen染料。
5. 如权利要求1所述的定量RNaseH活性测定方法，其特征在于，所用RNA模板为一段 polyA RNA单链，所用的DNA引物为Oligo dT。
【文档编号】C12Q1/68GK104293931SQ201410502173
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】徐晓昱, 王静 申请人:南京诺唯赞生物科技有限公司