专利名称：生物装置和使用其的定量测定装置及方法
技术领域：
本发明涉及生物装置，所述生物装置用在干化学(dry chemistry)检测方法中，用于测定包含在样品溶液中的物质，并涉及定量测定装置和使用这种生物装置的方法。
图1A和1B给出了常规免疫层析装置的结构。图1A是其平面图，图1B是其侧视图。常规免疫层析装置包括由多孔材料形成的基层11。测定部件16在基层11中。由不同材料形成的样品施加层13、指示剂物质保存部件12、吸水部分14在基层11上。基层11、样品施加部件13、指示剂物质保存部件12和吸水部分14叠加在底层基层15上。
指示剂物质保存部件12以第一抗体可以被洗脱的状态载有第一抗体，其特异性地与靶物质反应，并由标记物质标记。检测部分16具有第二抗体，其特异性地与固定化在那里的靶物质反应。在从指示剂物质保存部件12洗脱第一抗体时，施加于液体样品施加部件13的液体样品流动并到达检测部分16。当靶物质包含在液体样品中时，在检测部分16形成第一抗体-靶物质-第二抗体复合物。由于指示剂物质保存部件12和检测部分16由不同的材料形成，在第一抗体从指示剂物质保存部件12向检测部分16逐渐流动时，来自指示剂物质保存部件12的第一抗体扩散。因此，来自指示剂物质保存部件12的第一抗体的流动不中断。
除了干化学的上述优点之外，使用免疫层析的检测方法还具有容易操作、快速检测和价廉的优点。该方法适用于近来受到关注的床边检测(point of care testing，POCT)。POCT是用于临床检测的通用术语，对于其而言，从取样阶段至获得结果阶段的时间被认为是最重要的。
可用于POCT的常规生物装置在取样后需要3至5分钟获得检测结果。需要缩短这一时间。对于某些靶物质而言，除了定性检测之外，经常还需要定量检测。就重现性而言，可用于POCT的常规生物装置的定量测定不令人满意。
发明内容
根据本发明的一个方面，用于测定包含在液体样品中的靶物质的生物装置包括样品施加部件、指示剂物质保存部件，以及测定部件。样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件的位置使施加到样品施加部件的液体样品经过指示剂物质保存部件被转移到测定部件。至少指示剂物质保存部件与测定部件包含在一个元件中。指示剂物质保存部件具有含有与靶物质特异性反应的物质的第一物质组，其中第一物质组以能被所施加的液体样品洗脱的状态存在。在第一物质组被施加到样品施加部件的液体样品洗脱后，第一物质组以在流动过程中具有前端与尾端的物质(mass)流动。
根据本发明的另一方面，用于测定包含在液体样品中的靶物质的生物装置包括样品施加部件、指示剂物质保存部件，以及测定部件。样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件的位置使施加到样品施加部件的液体样品经过指示剂物质保存部件被转移到测定部件。至少指示剂物质保存部件与测定部件包含在一个元件中。指示剂物质保存部件具有含有与靶物质特异性反应的物质的第一物质组，其中第一物质组以能被所施加的液体样品洗脱的状态存在。测定部件具有含有与靶物质特异性反应的物质的第二物质组，第二物质组处于固定化状态。在包含在指示剂物质保存部件中的第一物质组被施加到样品施加部件的液体样品的作用洗脱，并在在液体样品的移动方向上扩散的同时与液体样品一起到达测定部件的过程中，在施加样品前，在液体样品的移动方向上的指示剂物质保存部件的保存宽度A，和扩散宽度B的比A∶B为1∶0.25至1∶1，扩散宽度B是当第一物质组的尾端到达测定部件时，在液体样品的移动方向上，相对于保存宽度A，指示剂物质的宽度。
在本发明的一个实施方案中，指示剂物质保存部件和测定部件之间的面积等于或大于3mm2，并且等于或小于150mm2。
在本发明的一个实施方案中，样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件在施加液体样品前处于干燥状态。
在本发明的一个实施方案中，液体样品是体液。
在本发明的一个实施方案中，包含在第一物质组中的与靶物质特异性反应的物质用着色物质、荧光物质、磷光物质、发光物质、氧化还原剂、酶、核酸或内质网标记。
在本发明的一个实施方案中，着色物质为金胶体颗粒。
在本发明的一个实施方案中，第一物质组包含抗靶物质的第一抗体，且第二物质组包含抗靶物质的第二抗体。
在本发明的一个实施方案中，第一物质组包含抗靶物质的第一抗体和第二抗体，第二抗体用生物素标记，且第二物质组包含与生物素特异性反应的抗生物素蛋白。
在本发明的一个实施方案中，第一物质组包含抗靶物质的第一抗体和第二抗体，第二抗体用磁性物质标记，且第二物质组包含以磁性捕获磁性物质的物质。
在本发明的一个实施方案中，指示剂物质保存部件和测定部件包含在多孔元件中。
在本发明的一个实施方案中，多孔元件是硝酸纤维素基膜。
在本发明的一个实施方案中，样品施加部件叠加在包括指示剂物质保存部件和测定部件的多孔元件上。
在本发明的一个实施方案中，该生物装置另外包括位于包括指示剂物质保存部件和测定部件的多孔元件上的吸水部件，相对于测定部件而言，吸水部件在指示剂物质保存部件对面。
在本发明的一个实施方案中，该生物装置另外包括液体样品不能透过的元件，所述元件附着在样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件的至少一部分上。
根据本发明的另一方面，用于测定包含在液体样品中的靶物质的定量测定装置包括上述任何生物装置，以及用于定量测定在生物装置的测定部件获得的物理或化学信号的测定设备。
根据本发明的另一方面，使用上述定量测定装置测定包含在液体样品中的靶物质的定量测定方法包括以下步骤将预定量的液体样品施加到样品施加部件；以及通过定量测定装置的测定装置定量测定在测定部件获得的物理或化学信号。
因此，本文所描述的本发明使利用生物装置的优点而实现快速、高精密度和高重现性地定性和定量测定液体样品中的靶物质成为可能；并且本发明也提供了使用这种生物装置的定量测定装置和定量测定装置方法。
在参照附图阅读和理解以下详细描述后，本发明的这些和其它优点对本领域技术人员而言将变得清楚。
根据本发明，该生物装置包括样品施加部件52、指示剂物质保存部件51，以及测定部件54。样品施加部件52、指示剂物质保存部件51和测定部件54的位置使施加到样品施加部件52的液体样品经过指示剂物质保存部件51被转移到测定部件54。至少指示剂物质保存部件51和测定部件54包含在一个元件中。指示剂物质保存部件51具有含有与靶物质特异性反应的带有指示剂的物质的第一物质组。该物质组以能被洗脱的状态存在。
在第一物质组被施加到样品施加部件52的液体样品洗脱后，第一物质组以在流动过程中具有前端和尾端的物质流动。
更具体地说，包含在指示剂物质保存部件51中的第一物质组被施加到样品施加部件52的液体样品的作用洗脱，并在在液体样品的移动方向(图5A中箭头M的方向)上扩散的同时与液体样品一起到达测定部件54。
测定部件54具有含有与靶物质特异性反应的物质的第二物质组。第二物质组固定化于测定部件54。
在本说明书中，术语“保存宽度A”(holding width)定义为在施加液体样品前，在液体样品的移动方向上，由第一物质组形成的指示剂物质保存部件的宽度。术语“扩散宽度B”定义为当第一物质组的尾端到达测定部件时，在液体样品的移动方向上，相对于保存宽度A而言，第一物质组的宽度。根据本发明，保存宽度A和扩散宽度B的比A∶B为1∶0.25至1∶1。同时，在本说明书中，术语“移动方向”定义为由图5A中箭头M代表的液体样品的移动方向。
在本发明的生物装置中，指示剂物质保存部件51和测定部件54包含在一个元件中。由于这种结构，当将液体样品引入样品施加部件52时，被液体样品的作用洗脱的第一物质组以物质状态开始向测定部件54移动，同时在移动方向上扩散。接着，第一物质组在短时间内通过测定部件54。相反，在常规生物装置中，在第一抗体不间断地逐渐流动时，来自指示剂物质保存部件12的第一抗体(相应于第一物质组)向测定部件16扩散。因此与本发明的生物装置相比，足量的第一抗体到达测定部件16所需的时间更长。本发明的生物装置与常规生物装置相比，在更短的时间内引发在测定部件54中的反应，从而缩短测定时间。例如，大多数通过免疫层析装置进行的妊娠试验在取样后需要3至5分钟以获得充分的测定结果。本发明的生物装置在少于3分钟的时间内获得可靠的测定结果。
当第一物质组开始从指示剂物质保存部件51洗脱时，相对于保存宽度A，第一物质组在移动方向上的宽度小于25％。当第一物质组接近测定部件54时，第一物质组的宽度增加。
由于以下原因第一物质组的宽度增加。当液体样品施加到样品施加部件52时，移动第一物质组的液体样品流动速度最大，其随时间降低。随液体样品流动速度降低，第一物质组越来越容易扩散。因此，第一物质组的宽度随时间增加。
为了提高用本发明的生物装置测定包含在液体样品中的靶物质的定量测定的精密度，要求在测定部件54中的反应均一地发生。随第一物质组的宽度增加，由于移动速度的差异，第一物质组的扩散状态在第一物质组的不同点的均一性变差。因此，定量测定精密度取决于扩散宽度B的量级。
显示定量测定的精密度的一个示例性指数是变异系数(本文以下称为“CV值”，其计算为标准偏差/平均值×100)。随CV值变小，测定的精密度变高。
在本例的生物装置中，测定部件54的位置使A∶B在1∶0.25至1∶1的范围内，即B/A比在25％至100％的范围内。由于这样的设置，可以在更短的时间内重现性更高地获得比常规装置更精密的测定。
在测定部件54的位置使B/A比小于25％的情况下，在液体样品施加到样品施加部件52后，靶物质-第一物质组复合物在极短时间内通过测定部件54。因此，靶物质-第一物质组复合物在与测定部件54的第二物质组充分反应前就以极高速度通过测定部件54。因此，不能获得充分的测定结果。
在测定部件54的位置使B/A比大于100％的情况下，在靶物质-第一物质组复合物通过测定部件54之前需要极长时间。虽然靶物质-第一物质组复合物与第二物质组充分反应，但液体样品的流动速度低，因而不能获得快速测定。另外，扩散宽度B很大，并且不均一，因此破坏了定量测定的精密度。
在液体样品具有相对较高粘度的情况下，例如血液，液体样品的流动速度相对较低。因此，A∶B比优选在1∶0.25至1∶0.50的范围内，从而缩短靶物质-第一物质组复合物通过测定部件54之前的时间。相反，在液体样品具有相对较低粘度的情况下，例如尿，液体样品的流动速度相对较高。因此A∶B比优选在1∶0.50至1∶1的范围内，从而延长靶物质-第一物质组复合物通过测定部件54之前的时间。
保存宽度A和扩散宽度B可以通过，例如光学方法测定。首先将描述用于测定保存宽度A的示例性方法。
将生物装置放在反射吸光光度计的扫描部位(scanning stage)。扫描生物装置以测定第一物质组的反射吸光度。图2是说明所得的保存宽度A和吸光度间的关系的图。根据图2，保存宽度A定义为吸光度等于或大于0.01的扫描长度(scanning length)。
扩散宽度B(即当第一物质组的尾端到达测定部件54时，在移动方向上，相对于保存宽度A而言，第一物质组的宽度)可以如下测定。当液体样品施加到样品施加部件52时发生的在生物装置上的第一物质组的流动方式通过随时间测定反射吸光度检测。预置光线使其指向对于测定部件54而言适当的生物装置的位置。接着，将液体样品滴至生物装置，从而引起第一物质组流动。当第一物质组到达光线照射的位置时，吸光度急剧增加。当第一物质组进一步移动并通过光线照射的位置时，吸光度降低。根据吸光度的差异，找到第一物质组的前端和尾端。这样可以获得当第一物质组的尾端到达测定部件54时的第一物质组的宽度。从而可以获得扩散宽度B。在本例中，用不含第二物质组的生物装置的部分作为参比，测定吸光度。吸光度在首次增加后下降到0.3的点定义为尾端。
当获得第一物质组的尾端位置时，在与液体样品的移动方向相反的方向(与图5A中箭头M代表的方向相反的方向)上扫描生物装置。这样，如图3所示，获得有关扫描距离的反射吸光度。根据图3，当从第一物质组的尾端在相反方向上扫描生物装置时，在吸光度首次增加并接着下降后基本上稳定的点定义为前端。第一物质组在移动方向上的宽度是第一物质组前端与尾端之间的距离。
取决于液体样品的流动方式或生物装置的表面状态，第一物质组可以是非均一的。第一物质组的尾端可能发生脱尾。如上所述将吸光度下降到0.3的点定义为尾端的原因是为了从扩散宽度B中除去脱尾部分，甚至是在脱尾发生时。
可以通过除光学方法之外的其它方法测定保存宽度A和扩散宽度B。例如，当包含在第一物质组中的指示剂物质具有电化学性质时，可以通过用电化学检测方法测定保存宽度A和扩散宽度B，代替使用反射吸光分光计。
根据本发明的另一个实施方案，生物装置包括样品施加部件52、指示剂物质保存部件51，以及测定部件54。样品施加部件52、指示剂物质保存部件51和测定部件54的位置使施加到样品施加部件52的液体样品经过指示剂物质保存部件51被转移到测定部件54。至少指示剂物质保存部件51与测定部件54包含在一个元件中。指示剂物质保存部件51具有含有与靶物质特异性反应的物质的第一物质组。以这种状态，该物质组可以被洗脱。测定部件54具有与靶物质特异性反应的第二物质组。第二物质组固定化于测定部件54。
指示剂物质保存部件51和测定部件54之间的面积在3mm2至150mm2的范围内。
用这种结构，从液体样品施加到样品施加部件52直至第一物质组通过测定部件54的时间可以得到控制。因此，扩散宽度B均一化。这样，可以获得与由上述实施方案中的生物装置提供的相同的效果。
在液体样品具有相对较高粘度的情况下，例如血液，液体样品的流动速度相对较低。因此，指示剂物质保存部件51和测定部件54之间的面积优选在3mm2至25mm2的范围内，从而缩短第一物质组通过测定部件54之前的时间。相反，在液体样品具有相对较低粘度的情况下，例如尿，液体样品的流动速度相对较高。因此，指示剂物质保存部件51和测定部件54之间的面积优选在25mm2至150mm2的范围内，从而延长第一物质组通过测定部件54之前的时间。
根据本发明，样品施加部件52、指示剂物质保存部件51和测定部件54在液体样品施加到样品施加部件52前优选处于干燥状态。在施加液体样品前，该生物装置可以为干燥装置，其更易操作并且适于作为可用于POCT的简单装置。
根据本发明的生物装置可以在例如，尿检验、妊娠试验、水质检测、粪便检验、土壤分析和食品分析的领域中使用。液体样品可以是水溶液或有机溶液。可以用作液体样品的溶液包括，例如体液、河水、海水、地下水和通过溶解土壤或食品获得的水溶液。体液包括，例如血、血浆、血清、尿、唾液、汗和眼泪。
本发明中的靶物质包括，例如细菌、红细胞、蛋白质和病毒。示例性的细菌包括结核分枝杆菌(tubercle bacillus)和肠杆菌(Enterobacteriaceae)。示例性蛋白质包括血红蛋白、血红蛋白Alc、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、C-活性蛋白(C-reactiveprotein，CRP)，清蛋白和甲胎蛋白。示例性病毒包括AIDS病毒和丙型肝炎病毒。
包含在第一物质组中的与靶物质特异性反应的物质优选用着色物质、荧光物质、磷光物质、发光物质、氧化还原剂、酶、核酸或内质网标记。示例性着色物质包括金胶体、银胶体、硒胶体、有色胶乳、菁蓝和偶氮。示例性荧光物质包括芳族化合物如芘，用官能团如丹磺酰基取代的芳族化合物、荧光素、若丹明和香豆素。示例性磷光物质包括二苯甲酮。示例性发光物质包括通过例如荧光素和ATP的发光反应的形式发光的物质。示例性氧化还原剂包括通过例如葡萄糖和葡萄糖氧化酶的氧化还原反应的形式产生电流的物质。示例性内质网包括微团和脂质体。在这些物质中，金胶体是最优选的。
根据本发明的与靶物质特异性反应的物质包括，例如抗原、抗体、核酸、酶和受体。优选第一物质组包含抗靶物质的第一抗体，且第二物质组包含抗靶物质的第二抗体。第一抗体和第二抗体可以各自是与靶物质特异性反应的任何抗体。可用作第一和第二抗体的示例性抗体包括抗细胞抗体、抗蛋白抗体、抗糖蛋白抗体、抗酶抗体、抗多糖抗体、抗细菌抗体和抗病毒抗体。单克隆抗体和多克隆抗体都可以使用。
由于第一和第二抗体与同一类型的靶物质特异性反应，因此可以使用识别靶物质的不同抗原决定簇(表位)的抗体的任何组合。
第一物质组可以包含抗靶物质的第一抗体和第二抗体，第二抗体可以用生物素标记，第二物质组可以包含与生物素特异性反应的抗生物素蛋白。由于这种结构，第一抗体和标记有生物素的第二抗体在形成复合物的同时经过靶物质在液体样品中流动。在测定部件54，复合物中的生物素和抗生物素蛋白特异性地相互反应，从而使靶物质在测定部件54被捕获。
第一物质组可以包含抗靶物质的第一抗体和第二抗体，第二抗体可以用磁性物质标记，且第二物质组可以包含以磁性捕获磁性物质的物质。由于这种结构，第一抗体和标记有磁性物质的第二抗体在形成复合物的同时经过靶物质在液体样品中流动。在测定部件54，复合物中的磁性物质以磁性被捕获，从而使靶物质在测定部件54被捕获。磁性物质是，例如磁粉如氧化铁或氧化铝。可以通过在测定部件54提供磁体而以磁性捕获磁性物质。
样品施加部件52、指示剂物质保存部件51和测定部件54可以由任何使液体样品通过毛细现象以适当的速度流动的材料形成。例如，样品施加部件52、指示剂物质保存部件51和测定部件54可以由多孔元件形成，例如硝酸纤维素基膜、醋酸纤维素膜和玻璃纤维。在这些元件中，最优选使用硝酸纤维素基膜。
样品施加部件52可以叠加在包括指示剂物质保存部件51和测定部件54的多孔元件上。由于这种结构，可以将足量的液体样品提供给包括指示剂物质保存部件51和测定部件54的多孔元件。样品施加部件52可以由例如由无纺布或类似的材料形成的吸水多孔元件形成。
该生物装置可以另外包括位于包括指示剂物质保存部件51和测定部件54的多孔元件上的吸水部件56，相对于测定部件54，吸水部件56位于指示剂物质保存部件51的对侧。由于这种结构，包括指示剂物质保存部件51和测定部件54的多孔元件上的过量液体样品可以被吸收。吸水部件56可以由，例如多孔部件如玻璃纤维滤器形成。
该生物装置优选容纳在中空容器中。中空容器由，例如塑料材料形成，并具有至少与测定部件54和样品施加部件52对应的开口。中空容器提供防止液体样品外漏的作用。
液体样品不能透过的元件优选附着于样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件的至少部分。例如，可以连接由液体样品不能透过的材料形成的胶带。这提供防止液体样品外漏的作用，还提供控制生物装置上液体样品的流速和使液体样品的流速均一化的作用。
根据本发明的定量测定装置用来测定包含在液体样品中的靶物质。该定量测定装置包括上述生物装置，以及用于定量测定在生物装置的测定部件54获得的物理或化学信号的测定装置。作为用于定量测定物理或化学信号的测定装置，可以使用任何可以将测定部件54的颜色强度的变化转化成数值的设备。例如，可以使用可以测定反射吸光度的设备。
根据本发明的定量测定方法用于用上述定量测定装置测定包含在液体样品中的靶物质。所述定量测定方法包括以下步骤将预定量的液体样品施加到样品施加部件52，以及通过定量测定装置的测定装置定量测定在测定部件54获得的物理或化学信号。在将预定量的液体样品施加到样品施加部件52的步骤中，用移液管等准确量取液体样品并转移到样品施加部件52。
在本发明的生物装置中，指示剂物质保存部件51和测定部件54包含在一个元件中。由于这种结构，当液体样品引入样品施加部件51时，被液体样品的作用洗脱的第一物质组开始以物质状态向测定部件54移动，同时在移动方向上扩散。然后，第一物质组在短时间内通过测定部件54。相反，在常规生物装置中，来自指示剂物质保存部件12的第一抗体(相应于第一物质组)随第一抗体不中断地逐渐流出而向测定部件16扩散。因此，与本发明的生物装置相比，常规生物装置需要更长时间才能使足量第一抗体到达测定部件16。本发明的生物装置与常规生物装置相比，在更短时间内引发在测定部件54的反应，从而缩短测定时间。例如通过免疫层析装置进行的大多数妊娠试验在取样后需要3至5分钟才能获得充分的测定结果。本发明的生物装置在少于3分钟的时间内获得可靠的测定结果。
在本发明的生物装置中，测定部件54的位置使A∶B在1∶0.25至1∶1的范围内；即B/A比在25％至100％的范围内。由于这种设置，可以在短时间内以更高的重现性实现比常规装置更精密的测定。
以下将参照附图，通过示例性但非限制性的实施例进一步说明本发明。
作为着色物质的金胶体颗粒如下制备。将1％的柠檬酸水溶液加入处于回流状态的温度为100℃的0.01％氯金酸水溶液中。溶液继续回流30分钟并且在室温下冷却。用0.2M碳化钾水溶液将得到的金胶体溶液调节到pH9。向所得的溶液中加入抗-hCG-α抗体并搅拌几分钟。接着，向其中加入pH9的10％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，加入的量使终浓度为1％。接着搅拌混合物。这样，获得了作为指示剂物质的抗体-金胶体复合物(标记的抗体或第一物质组)。标记的抗体溶液在4℃、20000 G离心50分钟，从而分离标记的抗体。将标记的抗体悬浮在洗涤缓冲液(1％BSA-磷酸盐缓冲液)中。接着，离心获得的物质以洗涤并分离标记的抗体。将标记的抗体悬浮在洗涤缓冲液中并通过0.8μm滤器过滤。将标记的抗体的量调节到金胶体溶液初始量的1/10，接着将标记的抗体在4℃贮存。
将标记的抗体溶液置于溶液注射装置中，并施加到硝酸纤维素膜43上并干燥。这样，制得具有在硝酸纤维素膜43上含有标记的抗体(第一物质组)的指示剂物质保存部件41的位置设置装置体40(反应层载体)。将位置设置装置体40在与指示剂物质保存部件41垂直的方向上切割成多个宽度为0.5cm的位置设置装置。(b)设置测定部件的位置将40μL量的尿样滴至所得的位置设置装置的样品施加部件42上。将位置设置装置置于反射吸光分光计的扫描部位。在施加液体样品后，标记抗体在位置设置装置上的流动方式用随时间测定反射吸光度而检测。更具体地说，使光线指向对于测定部件而言适当的位置设置装置的位置。在移动方向上的指示剂物质保存部件41的保存宽度A和扩散宽度B用上述方法测定。使光源指向同样适于测定部件的多个其它位置，测定保存宽度A和扩散宽度B。这样，获得了适于测定部件的各个位置和相应的扩散宽度B间的关系。(c)制备生物装置图5A和5B显示根据本发明的一个实施例的生物装置50。图5A是其平面图，图5B是其侧视图。生物装置50包括支撑体55；在支撑体55上的具有指示剂物质保存部件51和测定部件54的硝酸纤维素膜53；以及硝酸纤维素膜53上的样品施加部件52和吸水部件56。样品施加部件52位于硝酸纤维素膜53在指示剂物质保存部件51附近的部分上。上述部分不包含指示剂物质。相对于测定部件54，吸水部件56位于硝酸纤维素膜53与样品施加部件52相对的一侧。
生物装置50如下制备。
首先，提供测定部件54。制备具有用磷酸盐缓冲液稀释获得的适当浓度的抗-hCG-β抗体的水溶液。用溶液注射装置将抗体溶液施加到硝酸纤维素膜53上。这样，抗体固定化在硝酸纤维素膜53上作为测定部件54。将所得的带有测定部件54的硝酸纤维素53浸在含有1％脱脂乳的Tris-HCl缓冲液中并轻轻振摇30分钟。接着将硝酸纤维素膜53放入Tris-HCl缓冲液浴中并轻轻振摇10分钟。接着，将硝酸纤维素膜53在另一Tris-HCl缓冲液浴中再轻轻振摇10分钟。以这种方式洗涤两次后，将硝酸纤维素膜从浴中移出并在室温下干燥。
接下来，指示剂物质保存部件51如下提供。
作为着色物质的金胶体颗粒如下制备。将1％的柠檬酸水溶液加入处于回流状态的温度为100℃的0.01％氯金酸水溶液中。溶液继续回流30分钟并且在室温下冷却。用0.2M碳化钾水溶液将所得的金胶体溶液调节到pH9。向所得的溶液中加入抗-hCG-α抗体并搅拌几分钟。接着，向其中加入pH9的10％BSA(牛血清白蛋白)水溶液，加入量使终浓度为1％。接着，搅拌混合物。这样，获得作为指示剂物质的抗体-金胶体复合物(标记的抗体或第一物质组)。将标记的抗体溶液在4℃、20000 G离心50分钟，从而分离标记的抗体。将标记的抗体悬浮在洗涤缓冲液(1％BSA-磷酸盐缓冲液)中。接着，离心获得的物质以洗涤并分离标记的抗体。将标记的抗体悬浮在洗涤缓冲液中并通过0.8μm滤器过滤。将标记的抗体的量调节到金胶体溶液初始量的1/10，接着将标记的抗体溶液在4℃贮存。
将标记的抗体溶液置于溶液注射装置中，并施加到其上固定化有抗-hCG-β抗体(第二物质组)的作为测定部件54的硝酸纤维素膜53上。将标记的抗体溶液施加到远离测定部件54的硝酸纤维素膜53的位置。接着，干燥硝酸纤维素膜53。这样，制得具有指示剂物质保存部件51和测定部件54的反应层载体(硝酸纤维素膜53)。
将这样制得的具有指示剂物质保存部件51的反应层载体连接到支撑体55上。由无纺布形成的样品施加部件和由玻璃纤维滤器形成的吸水部件56位于反应层载体上。获得的设备除样品施加部件52的一部分外用透明带(Nitto Denko；没有显示)覆盖，并接着切割成多个宽度为0.5cm的生物装置。
用通过位置设置装置40获得的结果生产八种类型的生物装置，每种类型生产五个。更具体地说，八种类型的生物装置的A∶B分别为1∶0.05、1∶0.25、1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.05、1∶1.1和1∶1.2。换言之，八种类型的生物装置的B/A比分别为5％、25％、50％、75％、100％、105％、110％与120％。
这样制得的生物装置如下评价。(d)评价生物装置将约40μl含有1000 U/l hCG的尿样施加到各生物装置的样品施加部件52上。五分钟后，由抗原-抗体反应引起的测定部件54的颜色用反射吸光度测定。具体地说，在520nm处的吸光度用反射吸光分光计(CS9300，Shimadzu Corporation)测定。图6是说明所得的B/A比、吸光度和CV值之间的关系的图。各类型生物装置的CV值从五个生物装置的测定值获得。更具体地说，CV值如下计算测定值的标准偏差/测定值的平均值×100。
从图6可见，当B/A比在25％至100％的范围内时，CV值和吸光度都非常好。
接下来，B/A比为5％、50％和120％的三种类型的生物装置以相似的方式用含有0、100、1000和10000 U/L hCG的尿样进行测试。
如上所述，将40μL尿样施加到各生物装置的样品施加部件52上。五分钟后，各生物装置的测定部件54的颜色用反射吸光分光计测定，接着对所得的颜色进行算术运算。具体地说，测定在520nm处的吸光度，并且代入预先做好的说明hCG浓度和吸光度之间的关系的校正曲线中。图7是说明用B/A比为5％的生物装置获得的结果的图。图8是说明用B/A比为50％的生物装置获得的结果的图。图9是说明用B/A比为120％的生物装置获得的结果的图。在图7、8和9中，横轴代表施加入生物装置的尿样hCG浓度。纵轴代表基于在测定部件54的520nm处的吸光度，由以上算术运算获得的hCG浓度。
在理想条件下，当测定含有例如1000U/lhCG的尿样的吸光度，并将吸光度代入校正曲线时，hCG浓度应为1000U/l。实际上，hCG浓度值有偏差。偏差的数量级代表测定的准确度。
从B/A比为5％的生物装置的图7可见，含有100U/lhCG的尿样的吸光度无法测定。可能的原因是在包含在尿样中的hCG被固定化的抗-hCG-β抗体充分捕获前尿样就通过了测定部件54，在hCG的低浓度区，测定灵敏度过低。
从B/A比为120％的生物装置的图9可见，在hCG的高浓度区，测定准确度特别低。可能的原因是尿样通过测定部件54的时间过长，尿样的流动干扰、反应中的变化发生。
由图8可见，用B/A比为50％的生物装置获得准确而精密的定量测定结果。
图10是说明用指示剂物质保存部件51和测定部件54之间的面积为175mm2的生物装置获得的结果的图。图11是说明用指示剂物质保存部件51和测定部件54之间的面积为50mm2的生物装置获得的结果的图。图12是说明用指示剂物质保存部件51和测定部件54之间的面积为5mm2的生物装置获得的结果的图。在图10、11和12中，横轴代表施加入生物装置的尿样hCG浓度。纵轴代表基于在测定部件54的520nm处的吸光度，通过以上的算数运算获得的hCG浓度。
由图10可见，对于指示剂物质保存部件51和测定部件54之间的面积为175mm2的生物装置而言，代表施加入生物装置的尿样hCG浓度与在测定部件54的hCG浓度间关系的曲线在10000U/l的高浓度区不是线性的。另外，CV值显示10-100％的大偏差，表明这种生物装置不提供准确而精密的定量测定。
由图11和12可见，当用指示剂物质保存部件51和测定部件54之间的面积为50mm2或5mm2的生物装置时，代表施加入生物装置的尿样hCG浓度与在测定部件54的hCG浓度间关系的曲线在hCG高浓度区也是线性的。各类型的生物装置的CV值在3％至28％的范围内，意味着这些类型的生物装置提供准确而精密的定量测定。
本发明优化了指示剂物质保存部件和测定部件间的位置关系，由此提供了实现快速、高精密度和高重现性定性和定量测定液体样品中的靶物质的生物装置。本发明的生物装置适于POCT。
在不背离本发明的范围与实质的前体下，本领域技术人员将清楚各种其它修饰，并容易进行修饰。因此，本文的描述并不限制所附权利要求的范围，而对权利要求进行广泛解释。
权利要求
1.用于测定包含在液体样品中的靶物质的生物装置，所述生物装置包括样品施加部件；指示剂物质保存部件；以及测定部件，其中样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件的位置使施加到样品施加部件的液体样品经过指示剂物质保存部件被转移到测定部件，至少指示剂物质保存部件与测定部件包含在一个元件中，指示剂物质保存部件具有含有与靶物质特异性反应的物质的第一物质组，其中第一物质组以能被所施加的液体样品洗脱的状态存在，并且在第一物质组被施加到样品施加部件的液体样品洗脱后，第一物质组以在流动过程中具有前端与尾端的物质流动。
2.用于测定包含在液体样品中的靶物质的生物装置，所述装置包括样品施加部件；指示剂物质保存部件；以及测定部件，其中样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件的位置使施加到样品施加部件的液体样品经过指示剂物质保存部件被转移到测定部件，至少指示剂物质保存部件与测定部件包含在一个元件中，指示剂物质保存部件具有含有与靶物质特异性反应的物质的第一物质组，其中第一物质组以能被所施加的液体样品洗脱的状态存在，测定部件具有含有与靶物质特异性反应的物质的第二物质组，第二物质组处于固定化状态，并且在包含在指示剂物质保存部件中的第一物质组被施加到样品施加部件的液体样品的作用洗脱，并在在液体样品的移动方向上扩散的同时与液体样品一起到达测定部件的过程中，在施加样品前，在液体样品的移动方向上的指示剂物质保存部件的保存宽度A，和扩散宽度B的比A∶B为1∶0.25至1∶1，扩散宽度B是当第一物质组的尾端到达测定部件时，在液体样品的移动方向上，相对于保存宽度A而言，指示剂物质的宽度。
3.根据权利要求1的生物装置，其中在指示剂物质保存部件和测定部件之间的面积等于或大于3mm2，并且等于或小于150mm2。
4.根据权利要求1的生物装置，其中样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件在施加液体样品前处于干燥状态。
5.根据权利要求1的生物装置，其中液体样品是体液。
6.根据权利要求1的生物装置，其中包含在第一物质组中的与靶物质特异性反应的物质用着色物质、荧光物质、磷光物质、发光物质、氧化还原剂、酶、核酸或内质网标记。
7.根据权利要求6的生物装置，其中着色物质为金胶体颗粒。
8.根据权利要求2的生物装置，其中第一物质组包含抗靶物质的第一抗体，且第二物质组包含抗靶物质的第二抗体。
9.根据权利要求2的生物装置，其中第一物质组包含抗靶物质的第一抗体和第二抗体，第二抗体用生物素标记，且第二物质组包含与生物素特异性反应的抗生物素蛋白。
10.根据权利要求2的生物装置，其中第一物质组包含抗靶物质的第一抗体和第二抗体，第二抗体用磁性物质标记，且第二物质组包含以磁性捕获该磁性物质的物质。
11.根据权利要求1的生物装置，其中指示剂物质保存部件和测定部件包含在多孔元件中。
12.根据权利要求11的生物装置，其中多孔元件是硝酸纤维素基膜。
13.根据权利要求11的生物装置，其中样品施加部件叠加在包括指示剂物质保存部件和测定部件的多孔元件上。
14.根据权利要求11的生物装置，其另外包括位于包括指示剂物质保存部件和测定部件的多孔元件上的吸水部件，相对于测定部件而言，吸水部件在指示剂物质保存部件对面。
15.根据权利要求1的生物装置，其另外包括液体样品不能透过的元件，所述元件附着在样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件的至少一部分上。
16.用于测定包含在液体样品中的靶物质的定量测定装置，所述定量测定装置包括根据权利要求1的生物装置；以及用于定量测定在生物装置的测定部件获得的物理或化学信号的测定装置。
17.使用权利要求16的定量测定装置测定包含在液体样品中的靶物质的定量测定方法，所述定量测定方法包括以下步骤将预定量的液体样品施加到样品施加部件；以及通过定量测定装置的测定装置定量测定在测定部件获得的物理或化学信号。
全文摘要
本发明涉及生物装置,所述生物装置包括样品施加部件、指示剂物质保存部件,以及测定部件。样品施加部件、指示剂物质保存部件和测定部件的位置使施加到样品施加部件的液体样品经过指示剂物质保存部件被转移到测定部件。至少指示剂物质保存部件和测定部件包含在一个元件中。指示剂物质保存部件具有含有与靶物质特异性反应的物质的第一物质组,其中第一物质组以能被所施加的液体样品洗脱的状态存在。在第一物质组被施加到样品施加部件的液体样品洗脱后,第一物质组以在流动过程中具有前端和尾端的物质(mass)流动。
文档编号G01N33/53GK1384358SQ02118669
公开日2002年12月11日 申请日期2002年4月27日 优先权日2001年4月27日
发明者北胁文久, 重藤修行, 河村达朗, 滩冈正刚, 田中宏桥, 高桥三枝 申请人:松下电器产业株式会社