专利名称：生物测定设备和生物测定方法
技术领域：
本发明涉及生物测定设备和生物测定方法。更具体地，本发明涉及的生物测定设备和生物测定方法，它们被设计成防止由于干燥而导致驻留或保持在反应区的介质的浓度发生改变，该反应区为物质间的相互作用提供了场所。
背景技术：
近年来，通过微阵列技术将所需DNA显微排列而得到的集成化生物测定板，即通常称的“DNA芯片”或“DNA微阵列”(下文中统称“DNA芯片”)，越来越多地应用于基因突变分析、SNP(单核苷酸多态性)、基因表达频率分析等方面，并开始广泛应用于药物研发、临床诊断、药物基因组学(pharmacogenomics)、进化研究、法医学和其它领域。“DNA芯片”的特征在于可以综合分析杂交，这是因为大量种类不同的DNA寡核苷酸链或cDNA (互补DNA)被集成在玻璃基板或硅基板上。
除了上述DNA芯片之外，现已研制出多种传感器芯片，包括蛋白质芯片，其用于检测与蛋白质有关的相互作用。通常，在这种传感器芯片技术中，事先将反应区域设置在基板上，所述反应区域满足为生物分子等物质间的相互作用(例如，杂交)提供场所等条件，并且事先在每一反应区中固定探针物质，使所述探针物质与目标物质相互作用，用荧光信号检测、表面质子共振原理或石英晶体原理等测定原理检测所述探针物质与所述目标物质相互作用的有无或程度。
这种传感器芯片技术能处理极微量的介质(例如，溶液)。因此，在测定相互作用期间，使介质干燥导致介质中的物质发生浓度变化并析出，从而对测量精度造成不利影响。因此，当进行分析相互作用的测定时，有必要采取防止水分蒸发的对策，如设定具有适当湿度和温度的环境或使反应区域封闭。
例如，特开2002-36302号公报公开了一种技术，其为解决制作微阵列时(固定探针时)样品点样期间因样品溶液蒸发而导致的微阵列质量不稳定的问题，通过设定湿度水平，使样品溶液很难随着微阵列设备附设的蒸气发生装置的蒸气一起蒸发。
此外，特开2003-079377号公报公开了一种技术，其在凝胶中事先含有预定量以上的多元醇，以抑制该凝胶中水分蒸发、凝胶收缩、凝胶脱落。
为了减少反应区域中水的蒸发(速率)，仅有两种方法理论上可行(1)提高相对湿度，和(2)降低温度，使饱和蒸气压降低。
因此，可以考虑采用以下方法，即当允许在反应区域中进行测定步骤时，将整个气氛维持在高湿度环境中。然而，其效果很有限。该方法也带来一些问题，例如为维持高湿度和必要的维护措施而增加了机械设备成本。
用盖件等封闭装有样品溶液的反应区域是必要的。然而，将探针物质或目标物质供给到(例如，滴到)设置在基板上的大量反应区域的每一个区域中，需要花费较长时间。因此，在加盖子之前，每一反应区中的物质浓度随时间推移不断改变。
例如，图19显示，供给到指定反应区域R的预定量介质M1随时间推移变得干燥，其初始体积V1逐渐减小，变成体积为V2的介质M2(V2＜V1)。介质的这种体积变化引起以下问题反应区域R中的物质m(探针物质、目标物质等)的浓度改变，或者反应区域R中的物质m析出、固着。结果，各个反应区R之间的物质浓度出现变化，对检出精度造成不利影响。
因此，本发明的主要目的是，提供生物测定设备和生物测定方法，其可以防止因驻留或保持在提供物质间相互作用场所的反应区域中的介质发生干燥而引起的所含物质浓度改变或介质中物质的析出、固着，补充所述反应区域内介质所损失的水。
发明内容
本发明提供以下“生物测定设备”和“生物测定方法”。
根据本发明的“生物测定设备”至少包括介质供给装置以及补水装置，所述介质供给装置将介质供给到反应区，所述反应区提供物质间相互作用如杂交的场所，该介质含有在相互作用中涉及的物质，所述补水装置在需要时将水自动补充到反应区这种设备可以，例如，在适宜的时间内，将水补充到反应区域，其补充量与供给到所述反应区域的介质所损失的水量相同。这样可以将介质中物质的浓度维持在所需浓度，使多个反应区域中介质所含的物质的浓度一致，并有效防止因过度干燥而引起的物质的析出、固着。
所述生物测定设备还可以包括体积检测装置，其自动检测保持在所述反应区中的介质的体积，基于从所述体积检测装置获得的体积变化信息，将与因干燥而损失的水相同量的水通过补水装置补充到所述反应区域。虽然不是特别限定，但所述体积检测装置可以适当采用一种装置，例如，该装置从照相机图像输出装置提取保持在所述反应区域中的介质的外形，并从介质的弯月面外形的尺寸计算介质的体积。
其次，本发明的生物测定方法借助下述程序(1)或(2)、经不同路径，向提供物质间相互作用场所的反应区供给介质和水，所述介质含有在所述相互作用中涉及的所述物质(1)供给所述介质，并随后补充所述水，所述介质含有在所述相互作用中涉及的所述物质，以及(2)补充所述水，并随后供给所述介质，所述介质含有在所述相互作用中涉及的物质。
这种方法可以在供给含有探针物质或目标物质等物质的介质后补充由于干燥而损失的水(程序(1))，或者在补充水后供给含有探针物质或目标物质等物质的介质(程序(2))。特别是，程序(2)可以有效防止在边缘或边界区域的物质的析出、固着。
本发明中使用的主要技术术语定义如下。
术语“相互作用”广义上指物质间的非共价结合、共价结合和氢键结合等化学结合或解离，例如，该术语广义上包括，核酸(核苷酸链)间的互补结合即杂交，高分子-高分子、高分子-低分子或低分子-低分子间的结合、会合等。“杂交”指具有互补碱基序列结构的核苷酸链之间形成互补链(双链)的反应。
术语“反应区域”指可为杂交或其它相互作用提供反应场所的区域或空间。例如，可以是具有能使液相、凝胶等驻留的反应井形状的反应场所。在所述反应区域发生的相互作用不应当狭义限定，只要它是与本发明的目的和效果一致的相互作用即可。
术语“介质”指含水介质，其含有在相互作用中涉及的物质(探针物质或目标物质)以及用于检测所述相互作用的物质，如嵌入剂。
术语“核酸”指核苷磷酸酯与嘌呤或嘧啶碱基以及糖通过糖苷键结合在一起形成的聚合物(核苷酸链)，该术语广义上包括，探针DNA等寡核苷酸、多核苷酸、由嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸聚合形成的DNA(全长或其片段)、由逆转录获得的cDNA(互补探针DNA)、RNA、聚酰胺核苷酸衍生物(PNA)等。
根据本发明，在生物测定板上配设的每一反应区内，可以调整物质的浓度。因此，可进行高精度生物测定。此外，因无需维持恒湿度室的内部高湿度，可使设备小型化并缩减成本。使用可自动检测反应区域中溶液等介质的量的自动检测装置，可使物质浓度的调整更容易。
图1的横截面图显示，适用于本发明生物测定设备和方法的、带有反应区的基板中部件的构造。
图2的斜视图显示，上侧基板(下文中称为“盖子”)12如何放在下侧基板11之上。
图3的横截面图显示，将基板11和盖子12重叠而获得的基板1的层状结构。
图4显示下侧基板11在设备2中供给模块2a的位置接受处理的状态。
图5显示基板1在设备2中反应模块2b的位置接受处理的状态。
图6显示基板1在设备2中荧光测量模块2c的位置接受处理的状态。
图7为设备2的荧光测量模块2c中光学系统X的放大图。
图8的斜视图显示第一内顶盖(inline header)207和第二内顶盖208的一例布局结构。
图9是从上部观察的一例布局结构的平面图。
图10显示另一例中内顶盖207、208的布局结构。
图11说明一例供给(滴加)介质的操作顺序。
图12显示，在50-90％RH范围内每一环境湿度中，所滴加的溶液完全干燥所需的时间，横轴为滴加量，纵轴为干燥时间。
图13放大了图12中50％RH环境湿度、滴加量100pL附近的图。
图14说明向基板11滴加供水溶剂的供给程序。
图15说明另一滴加补水程序(该程序利用了照相机输出图像)。
图16说明该滴加程序中的一例操作顺序。
图17说明另一例操作顺序。
图18说明又一例操作顺序。
图19说明常规技术存在的问题。
具体实施例方式
下文中，本发明的优选实施例参照附图进行说明。需注意，附图中所示实施例仅举例说明本发明设备和方法的代表例，本发明的范围不限于这些举例。
首先，图1的横截面图显示，适用于本发明生物测定设备和方法的、带有反应区的基板中部件的构造。
基板1是用于生物测定的板，是由下侧基板11以及通过贴合等作用重叠在该下侧基板上的上侧基板(下文称“盖子”)12组成。下侧基板11具有层状结构，其中，下层基板111、透明电极层112、固定层113和带有反应区R(例如为反应井形式)的反应区域形成层114依次堆叠。
需注意，当在检测相互作用的生物测定过程中利用了某种电动力学作用时，可在下层基板111中用到透明电极层112，但该透明电极层不是本发明绝对必要的一层。
下层基板111由具有以下性质的材料(例如，合成树脂或玻璃)形成，所述性质例如是，能允许荧光检出时使用的激光束(荧光激发光、位置检测伺服光(servolight)等)和在反应区R产生的荧光透过。由于下层基板111具有透光性，可采用从基板11背侧进行光照射的光照射部件。
透明电极层112由透光的导体材料例如氧化铟锡(ITO)形成。该透明电极层112利用例如喷涂(sputter)技术在下层基板111上形成，并具有指定的膜厚度(例如200nm)。
固定层113由适于在其一端固定探针物质的材料形成，所述探针物质例如，探针DNA(例如寡核苷酸链)等核酸分子。例如，利用喷涂技术形成的、表面经硅烷修饰的SiO2，其具有指定的膜厚度(例如200nm)。
在固定层113的表层可以涂敷具有一种或多种诸如氨基、巯基或羧基、半胱胺、链霉亲和素之类的官能团(活性基团)的物质。例如，当用链霉亲和素处理表面时，固定层适于一端固定生物素化探针DNA之类的探针物质。而用巯基(SH)处理表面时，固定层适于用一端经二硫键(-S-S-键)连接巯基而修饰的探针物质进行固定。
反应区域形成层114是指大量上方开口的凹状反应区R在下侧基板11中形成的层。这种反应区域形成层114可以利用例如感光性聚酰亚胺经光刻而形成。每一个反应区R都可以形成例如直径100μm、深5μm的形状。在这种情况下，每一反应区域R的内部容积约为100pL。
图2的斜视图说明盖子(上侧基板)12如何重叠在具有相同直径的下侧基板11之上，图3的横截面图说明基板11和盖子12重叠而得的层状结构基板1。
当从上向下观察整个基板时，如图2所示，多个反应区R从下侧基板11的中心向外呈放射状排列。此外，反应区R的放射状排列处于沿半径方向按指定间隔设置的形式。
在由本发明人制作的一例下侧基板11中，总共50个反应区R在距基板中心25mm-35mm的半径范围内以0.2mm的间隔形成放射状的一列，这些放射状的列沿半径方向以0.2mm的斜度(pitch)总共形成785列。在该例中，基板上总共形成39,250个反应区R(50个反应区×785列)。
在基板1上形成了地址坑(address pit)、条形码等，它们可作为该基板的位置信息(地址信息)，但附图中并未明示。例如，在反应区域形成层114上，旋转方向时作为基准位置的地址坑通过与反应区R相同的过程形成。用指定的伺服光追踪这种地址坑，可获得基板上的位置信息。根据基板上的这种位置信息，可以具体确定正确的目标反应区域R。
盖子12主要是作为防止驻留或保持在反应区R中的介质干燥的部件。例如，如图3所示，盖子12放置后，将反应区域R封闭而保持不与外界空气连通。例如，盖子12可以由具有导电性的n-型Si制成。
接下来，根据图4-8说明本发明“生物测定设备”的具体构成。
由图4中数字2表示的“生物测定设备”等大体由以下构成供给模块2a，将介质供给到反应区R；反应模块2b，允许进行固定反应或相互作用；以及，荧光测量模块2c，测量反应区R的激发荧光。需注意，在设备2中，控制每一操作的驱动器(后文中描述)和施加电场的操作等通过计算机C控制。
图4显示下侧基板11在供给模块2a位置接受处理的状态，图5显示基板1在反应模块2b位置接受处理的状态，图6显示基板1在荧光测量模块2c位置接受处理的状态。
从上述可知，下侧基板11被构造成，在模块2a、2b、2c之间滑动式移动，并停止在模块2 a、2b、2c中的指定位置，以进行所需处理或反应。
具有上述结构的下侧基板11通过图4所示的夹紧机构201固定在转盘202上。转盘202被连接到主轴电动机203和旋转编码器204上。主轴电动机203与丝杠205啮合，使得通过由驱动器206a控制的主轴步进马达206，基板1可以被传送到供给模块2a、反应模块2b和荧光测量模块2c的相应模块。
如图8所示，在下侧基板11上方的区域内设有供给模块2a，它带有第一内顶盖207，在该内顶盖中，通过可拆卸的机构，沿每一放射线设置了与反应区R数量相同的50个喷嘴。该第一内顶盖207作为反应区R的介质供给装置。
基于该第一内顶盖207的构成，可根据需要，将填充有含探针物质的介质的供给喷嘴(未示出)，替换为填充有含目标物质的介质的供给喷嘴(未示出)，或反之亦然，从而将含有所需物质的介质供给到反应区R内。
除了上述第一内顶盖207用于供给含有探针物质等的介质之外，供给模块2a还有专为下侧基板11上的反应区R供水而设的必需量的第二内顶盖208，作为所述反应区域R的补水装置。
每一个第二内顶盖208设有与下侧基板11每一放射线上的一组反应区R数量相同的总共50个喷嘴。需注意，内顶盖207、208都与喷射驱动器209连接并受该喷射驱动器控制。
反应模块2b装有以下结构具有防止干燥等作用的导电性盖子12被重叠安装在设有反应区R的下侧基板11上。这种安装结构主要包括控制盖子12装卸的致动驱动器210a，由驱动器210a控制的致动器210b，检测盖子12的位置的位置传感器211，等。
这种反应模块2b装有通过电源212(如高频电源)对导电性盖子12施加电场(如高频交流电场)的接触电极213，用于加热基板1的加热器214，等。此外，数字215是设在加热器214上的温度传感器，数字216是响应温度传感器215传来的检测信号而控制加热器214温度的加热器驱动器。
下侧基板11和盖子12以及加热器214可以全部容纳在恒湿度室217内。该恒湿度室217在其一部分具有开口217a。由驱动器218控制致动器219，使快门220上下移动，从而开关所述开口217a。数字221是检测快门220位置的位置传感器。需注意，恒湿度室217保持关闭状态，只有当基板1(或下侧基板11)传送期间通过该位置时例外(例如，参见图4)。
荧光测量模块2c主要由测量控制设备225控制的光学系统X构成。如图7放大图4-图6的光学系统X所示，光学系统X装有荧光激发光学系统P1(荧光激发激光器LD1、平行透镜(collimator len)L1、物镜L3、分色镜(dichromic mirror)DM1)，其可激发下层基质11的反应区R中的荧光物质(例如目标物质上标记的荧光染料或荧光嵌入剂)发出荧光。
光学系统X也装有测量激发荧光的荧光光学系统P2(物镜L3、波长选择镜F、物镜L5、荧光检测器PMT、分色镜DM1、DM2)，还装有检测物镜L5的自动聚焦AF控制信号的AF检测光学系统P3(AF检测激光器LD2、平行透镜L2、分束器M3、散光镜(astigmatic len)L4、AF检测器PD)。
荧光激发激光器、AF检测激光器和荧光分别具有不同的波长，它们通过分色镜DM1、DM2进行组合/分离。
在供给模块2a和反应模块2b中，设置上述恒湿度室217(参见图4等)，通过图中未示出的恒湿控制器，将基板周围环境维持在恒定湿度，例如50％RH。结果，可将含探针物质的介质或含目标物质的介质在供给后的水损失(蒸发)控制到最小。
下文说明用具有上述构成的生物测定设备2进行探针物质的固定试验。下文中，将探针DNA作为探针物质的代表例进行说明。但以下说明不应被解释为将探针物质限定到探针DNA。
探针DNA为单链DNA(核苷酸链)，其具有与希望通过下述生物测定程序在作为目标物质的目标DNA(单链)中测定其有无的碱基序列互补的碱基序列。
通过将预定量的含探针DNA的介质，经由设置在第一内顶盖207上的喷嘴，供给(滴加)到反应区R，可将探针DNA供给到设置在下侧基板11的反应区R中供给模块2a的位置。
起供给喷嘴作用的那些喷嘴，包括用于含探针的介质的那些和用于补水溶剂的那些，以与下侧基板11每一放射线中的反应区R一样的斜度和数量进行设置，使得可从这些喷嘴分别滴加不同介质。
首先，下侧基板11(处于未盖上的状态)安装在荧光测量模块2c位置处的转盘202上。当基板11由夹紧机构201固定后，基板11由主轴步进马达206传送到主轴位置传感器222a检出的供给模块2a位置。传送后，基板11的状态如图4所示。
下侧基板11随后由驱动器203a所控制的主轴电动机203旋转，用磁盘基准位置传感器223检测下侧基板11在旋转方向的基准位置，根据磁盘基准位置传感器223的输出和旋转编码器204的输出，产生相应的反应区域R的信号(反应区域位置信号)。将该反应区域位置信号与相应的供给喷嘴的吐出位置信号同步，从而将含有所需探针DNA的介质供给到下侧基板11的指定反应区域R。
在图8和图9中，显示了内顶盖207、208的一例布局结构。图8为斜视图，而图9为从上部观看到的平面图。
在图8和图9描述的例子中，填充有含探针DNA的介质的喷嘴采用吐出速率为100pL、吐出频率为5kHz的喷嘴。例如，将与每一放射线上反应区R数目相同的50个喷嘴通过可拆机构设置在第一内顶盖207上。
补水喷嘴采用例如吐出速率为2pL、吐出频率为20kHz的喷嘴。例如，将与每一放射线上反应区R数目相同的50个喷嘴通过可拆机构设置在第二内顶盖208上。
在该实例中，设置了两个内顶盖208(参见图8和图9)。它们起不同作用，一个(208a)调整介质中的物质浓度，另一个(208b)防止物质析出。
需注意，在图10的修改例中，第二内顶盖208具有调节物质浓度和防止物质析出这两种功能，或者仅具有其中一种功能。
接下来基于图11说明供给(滴加)介质的操作顺序。
首先，旋转下侧基板11，将含探针DNA的介质滴加供给到基板11的反应区R。随后旋转基板11。当反应区R到达第二内顶盖208的补水位置时，参考存储在计算机C中的“干燥时间查表”计算溶剂滴加量，按所需滴加量滴加供给补水溶剂。
“干燥时间查表”事先通过在多种湿度条件下的实验制得。在“干燥时间查表”中，对应于反应区R的不同位置编号，记录了补水溶剂的滴加量。
图12和图13显示了由实验获得的数据。图12是在50-90％RH范围内不同环境湿度中，所滴加的溶液完全干燥所需的时间，横轴为滴加量，纵轴为干燥时间。图13放大了图12中50％RH环境湿度、滴加量100pL附近的图。
从该实验可看出，例如，当湿度为50％RH时，在最先滴加介质的反应区R(例如，第1列反应区域)中，含探针DNA的介质自滴加最后一个反应区R(例如，第785列反应区域)的0.16秒后，约11pL水因干燥而损失。
因此，如图14所示，通过计算并设定每一列反应区域的溶剂滴加量，可将每一反应区域R中探针DNA浓度因干燥而发生的变化控制到最小。
更具体地，对于基板11上呈放射状排列的反应区R，沿环形方向每一放射线配给一个列编号(参见字母N)。向列编号N所指明的区域中的每一反应区R供给所需滴加量的补水溶剂(参见图14)。需注意，在图14中，供给顺序越晚，滴加量越多。
接下来参照图15说明另一例补水实例。
在该例中，设定装有含探针DNA的介质的喷嘴吐出速率为100pL、吐出频率为5kHz。与每一放射线中的反应区R数目相同的喷嘴(例如，50)通过可拆机构安装到第一内顶盖207上。
在该例中，设定用于补水的溶剂供给喷嘴吐出速率为2pL、吐出频率为20kHz。与每一条放射线中的反应区R数目相同的喷嘴(50)通过可拆机构安装到第二内顶盖208上。
在该例中，用于自动测量每一反应区R中介质量的光学显微镜CCD照相机223设置在基板11上方(参见图4-图6)。需注意，图15中符号Y所指区域表示光学显微镜CCD照相机223的焦点范围。
每一反应区域R中的介质体积，可以通过提取从照相机输出图像溶液外形，基于介质的弯月面外形尺寸算出。
该实施例中的操作顺序的例子基于图16进行描述。
旋转下侧基板11，将含探针DNA的介质供给到(滴加)板11上的所有反应区R。在接下来的旋转中，用光学显微镜CCD照相机223测定每一反应区域R的介质量，随后算出溶液减少量。基于该计算，当特定反应区域R移动到第二内顶盖208的补水位置时，滴加所需量的补水溶剂。
由于这种构成，无需事先检测恒湿度室217(参见图4等)中的湿度，就可以将每一反应区域R中探针DNA的浓度因干燥而产生的变化控制到最小。
在另一例中，含探针DNA的介质用吐出速率为2pL、吐出频率为20kHz的喷嘴来供给。与每一放射线中的反应区R数目相同的喷嘴(例如，50个)通过可拆机构安装到第一内顶盖207上。
在该例中，补水(滴加溶剂)用吐出速率为100pL、吐出频率为5kHz的喷嘴。与每一放射线中的反应区R数目相同的喷嘴(例如，50个)通过可拆机构安装到第一内顶盖207上。
该实施例中供给操作的顺序基于图17进行说明。
首先，旋转基板11，并且先通过第二内顶盖208滴加供给补水溶剂。接下来，旋转基板11，通过排列在第一内顶盖207上的用于滴加供给含探针DNA的介质的喷嘴，将含探针DNA的介质滴加供给到反应区R。应当事先调节含探针DNA的介质的浓度，使得当与每一反应区域R中的100pL溶剂混合时达到指定浓度。
当进行上述测定时，在从滴加供给溶液直到安装防干燥盖子(上侧基板12)的短时间内不发生完全混合，从而可有效防止探针DNA在反应区R中析出、固着。
通过在反应区R中先滴加溶剂、随后滴加含探针DNA的介质，可以减小因探针物质在反应区R析出、固着所致的不规则，因此可以实现高精度生物测定。
在另一例中，第一内顶盖207采用吐出速率为2pL、吐出频率为20kHz的喷嘴。此外，第二内顶盖208(补水)采用吐出速率为100pL、吐出频率为5kHz的喷嘴。用光学显微镜CCD照相机223测量每一反应区域R中的介质量，通过从照相机输出图像提取溶液外形，从介质的弯月面外形尺寸计算出反应区域R中的介质量。
该实施例中供给操作的顺序基于图18进行说明。
首先，旋转基板11，将溶剂A滴加供给到反应区R。随后旋转基板11，当反应区R达到第一内顶盖207的位置时，将含探针DNA的介质滴加供给到反应区R中。上述供给操作在板的整个旋转面上进行，并且在接下来的旋转中，用光学显微镜CCD照相机223检出每一反应区域R中的介质保有量，并计算其减少量。基于计算结果，当特定反应区域R达到第二内顶盖208中用于滴加供给溶剂B的位置时，滴加所需量的溶剂B。
根据这种方法，无需事先检测恒湿度室217(参见图4等)中的湿度，可将因干燥而引起的每一反应区域R中探针DNA浓度的改变控制到最小。这也可有效防止探针DNA在反应区域R中析出、固着。
含探针DNA的介质用上述任一实施例所示方法滴加供给到基板11上之后，基板11被主轴步进马达206传送到主轴位置传感器222b所检测的反应模块2b位置(图5的状态)。随后，用盖子安装/拆除致动器210b和盖子位置传感器211，将盖子(上侧基板12)安装到基板11上(再次参见图5)。
随后，基板11在恒湿度室21 7内静置一段时间，以完成将探针DNA固定到反应区R的表面(该表面经过处理适于进行固定)的工作。
将完成了固定探针DNA的工作的基板11传送到主轴位置传感器222c检出的荧光测量模块2c位置。从转盘202上拆下基板11，将指定清洗液供给到反应区R并从反应区R排出，实施清洗处理，以消除反应区R中未固定状态的任何探针DNA。随后，将基板11存放在指定位置，以备生物测定。
以下说明固定后的生物测定过程。这种生物测定过程指一系列步骤滴加供给目标物质→相互作用(例如，杂交)→荧光测定。
首先，目标物质(其现在被定为“目标DNA”)是指，希望调查其是否含有与探针DNA互补的碱基序列的单链DNA(核苷酸链)，它是从生物体中提取并分离出的。
将固定了探针DNA的下侧基板11安装到转盘202上荧光测量模块2c的位置处，并由夹紧机构201固定。随后，主轴步进马达206将下侧基板11传送到主轴位置传感器222a检出的供给模块2a位置(参见图4的状态)。
喷嘴事先填充例如含有目标DNA和嵌入剂(后述)的介质(例如，溶液)。用主轴电动机203旋转下侧基板11，用磁盘基准位置传感器224检测下侧基板11在旋转方向的基准位置，根据磁盘基准位置传感器224的输出和旋转编码器204的输出，产生相应的反应区域R的信号。将相应反应区域R的位置信号与相应滴加喷嘴的吐出信号同步，从而将介质滴加供给到下侧基板11的指定反应区域R。此时，通过与上述图16同样顺序的过程可完成供给操作。在该例中，图16的“DNA溶液”指含目标DNA的溶液。
在目标DNA的供给工作中，也将补水溶剂滴加供给到反应区R。即，当所需的一列放射线上的反应区R到达第二内顶盖208的位置时，参照由上述实验事先获得的干燥时间查表，滴加所需量的溶剂。这样一来，可将因干燥引起的每一反应区域R中目标DNA浓度的变化控制到最小。
在目标DNA的供给工作中，也可使用测定反应区域R中介质量的光学显微镜CCD照相机223，从照相机输出图像中提取溶液外形，从介质的弯月面外形尺寸计算出反应区域R中的介质量。
上述情况中的操作顺序与上述图16相同。即，旋转基板11，将含目标DNA的介质(其相应于图16的DNA溶液)滴加供给到整个基板旋转面上。在接下来的旋转中，检出反应区域R中的介质量，计算出因干燥减少的介质量。当所选的反应区域R到达第二内顶盖208位置时，滴加供给所需量的溶剂。以这种方式，无需事先检出恒湿度室217的湿度，就可以将因干燥引起的各个反应区域R中目标DNA浓度的变化控制到最小。
供给目标DNA时也可采用图17所示的操作顺序。即，旋转基板11，并事先滴加溶剂。随后，当所需的一列放射线上的反应区R到达第一内顶盖207的位置时，滴加供给含目标DNA的介质。含目标DNA的介质浓度应当事先调节，使得当含目标DNA的介质与反应区域R中100pL溶剂混合时达到指定浓度。通过实施该方法，可有效防止目标DNA在反应区域R中析出、固着。
在目标DNA的供给工作中，也可从测量反应区域R中介质量的光学显微镜CCD照相机223获得照相机输出图像，从该图像提取溶液外形，从介质的弯月面外形尺寸计算出反应区域R中的介质量。
在这种情况下的操作顺序与上述图18的相同。即，旋转基板11以便首先将溶剂滴加供给到反应区R中。随后，旋转基板11，当所需的一列放射线上的反应区R到达第一内顶盖207的位置时，滴加供给含目标DNA的介质。上述供给操作在基板的整个旋转面上进行，并且在接下来的旋转中，通过光学显微镜CCD照相机223检测保持在每一反应区域R中的介质量，并计算其减少量。基于计算结果，当特定的反应区域R到达第二内顶盖208中滴加供给溶剂B的位置时，滴加所需量的溶剂B。
根据这种方法，无需事先检测恒湿度室217(参见图4等)的湿度，可将各个反应区域R中因干燥所致探针DNA浓度的变化控制到最小，也可有效防止探针在反应区域R中DNA析出、固着。
如上所述，当滴加供给含目标DNA的介质后，主轴步进马达206将基板11传送到主轴位置传感器222b检出的反应模块2b。随后，用盖子安装/拆除致动器210b和盖子位置传感器211，将防干燥盖子(上侧基板)12安装到基板11上(参见图5的状态)。
现在，将基板11在反应模块2b中放置一段时间。当目标DNA中包含与(经固定的)探针DNA互补的碱基序列时，两者杂交形成双链DNA。
该杂交是在安装盖子12、同时使基板11压接加热器214、在例如55℃加热的状态下完成。此外，例如，利用下侧基板11中的透明电极层112(参见图1)和作为相对电极的导电盖子(上侧基板)12，并将它们连接到高频电源212，可以向反应区R施加1MV/m、1MHz的高频交流电场。
向反应区R施加电场是为了使核酸分子在电动力学作用如介电电泳作用下伸展或移动。电场的应用使得可以避免对杂交造成空间位阻或增加探针DNA与目标DNA之间结合的概率。因此，可以迅速完成杂交。
当固定在反应区R中的探针DNA与目标DNA之间的杂交完成后，下侧基板11连带其上安装的盖子(上侧基板)12被传送到主轴位置传感器222c检出的荧光测量模块2c位置(参见图6的状态)。
需注意，供给到反应区R的嵌入剂是荧光物质，它经过修饰具有与双链DNA结合后发荧光的结构。因此，当目标DNA具有与探针DNA互补的碱基序列而形成双链DNA时，这种嵌入剂与该双链DNA结合，发出荧光。
因此，可通过测量嵌入剂的荧光强度，来确定目标DNA中有无特定碱基序列。对嵌入剂无特别限定，可采用例如商购的SYBER Green I等。
荧光测定可以采用与通常的光学磁盘系统同样的操作进行。具体地，用主轴电动机203使下侧基板11旋转，用AF检测光学系统P3和致动器控制物镜L3相对于基板面的位置(具体参见图7)。
随后，由荧光激发光学系统P1激发基板上反应区域R中的嵌入剂，并由荧光计量光学系统测量所述嵌入剂的荧光。此时，荧光激发激光器LD1采用波长为450nm的半导体激光器，其通过平行透镜L1被转化为平行光束，并被接下来的分色镜DM1偏转，之后经物镜L3聚焦到反应区域R的固定层113上，以激发与固定层113上形成的双链DNA结合的嵌入剂(参见图7)。
这种嵌入剂产生波长520nm附近的荧光。所述荧光穿过物镜L3和分色镜DM1、DM2，经波长选择镜F消除偏离光后，经物镜L5聚焦到荧光检测器PMT的光接收部分，从而测定荧光强度。
由于此时荧光微弱，希望采用光电倍增管作为荧光检测器PMT。此外，AF检测光学系统P3和透镜致动器A(参见图7)可采用光盘所用的结构和控制方法。
该实例采用如下构成AF检测激光器LD2利用780nm波长的半导体激光器，半导体激光经平行透镜L2被转化为平行光束，使该平行光束穿过分束器M3，由分色镜DM2偏转，并穿过分色镜DM1，经物镜L3聚焦到基板表面，再被该基板表面反射(参见图7)。
反射的激光光束经物镜L3和分色镜DM1、DM2前行，到达分束器M3。激光光束随后被偏转到聚焦误差检测光学系统，其包括散光镜L4和AF检测器PD，并采用了散光方法。
荧光控制系统首先利用AF检测光学系统P3检测指示基板最外周旋转方向基准位置的基准位置标记，储存从旋转编码器204(参见图4等)输出的基准位置信号，并计算每一反应区域R的位置。
随后，旋转基板1，通过致动器A对物镜L3的位置进行自动聚焦控制，以允许在每一反应区域R位置进行稳定的荧光测量。
通过分析上述测量获得的荧光强度，可以分析目标DNA中所含碱基序列的基因信息。以这种方式，可实现一系列的生物测定。上面通过参照喷墨系统的喷嘴作为介质供给喷嘴进行了说明。然而，任何喷嘴，只要是能够滴加或注入准确体积的介质的吐出装置，都可以采用。
工业实用性本发明可用作防止驻留或保持在提供物质间相互作用场所的反应区中的介质干燥而导致所含物质发生浓度变化，或防止介质中物质析出、固着的技术。本发明可以作为用于DNA芯片和蛋白质芯片等传感器芯片的生物测定技术。
权利要求
1.生物测定设备，至少包括介质供给装置，用于将介质供给到反应区，该反应区提供了物质间相互作用的场所，该介质含有在所述相互作用中涉及的物质，以及补水装置，需要时将水自动补充到所述反应区。
2.根据权利要求1的生物测定设备，还包括体积检测装置，其自动检测保持在所述反应区的所述介质的体积，使得基于从所述体积检测装置得到的体积变化信息，通过所述补水装置将因干燥而损失的水量补充到所述反应区域。
3.根据权利要求1的生物测定设备，其中所述相互作用为核酸分子间的杂交。
4.根据权利要求2的生物测定设备，其中所述体积检测装置从照相机输出图像中提取保持在所述反应区域的所述介质的外形，并从所述介质的弯月面外形的尺寸来计算所述介质的体积。
5.一种生物测定方法，其借助下述程序(1)或(2)、经不同路径，向提供物质间相互作用场所的反应区供给介质和水，所述介质含有在所述相互作用中涉及的所述物质(1)供给所述介质，并随后补充所述水，所述介质含有在所述相互作用中涉及的所述物质，以及(2)补充所述水，并随后供给所述介质，所述介质含有在所述相互作用中涉及的物质。
6.根据权利要求5的生物测定方法，其中，在所述相互作用中涉及的物质是，将要固定在所述反应区中的探针物质，或者是将要与所述探针物质相互作用的目标物质。
全文摘要
本发明涉及生物测定设备，其防止驻留或保持在提供物质间相互作用场所的反应区中的介质因干燥作用而发生浓度变化，或防止介质中物质的析出、固着。本发明还提供了生物测定设备2，其至少装有介质供给装置以及补水装置，所述介质供给装置将介质供给到反应区R，所述反应区提供物质间相互作用如杂交的场所，该介质含有在相互作用中涉及的物质，所述补水装置在需要时将水自动补充到反应区。装置2可以具有体积检测装置，其自动检测保持在所述反应区中的介质的体积。
文档编号G01N37/00GK101095052SQ200580045879
公开日2007年12月26日 申请日期2005年10月25日 优先权日2004年11月4日
发明者伊藤达巳, 武田实, 古木基裕, 山根良一, 中岛敏弘 申请人:索尼株式会社