一组生物标志物的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一组生物标志物的测定方法，包括以下步骤：（1）提取与净化；（2）标准工作溶液的配制；将空白样品按上述步骤（1）处理，用该空白样品基质溶液在 2～100 μg/L 范围内，配制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液；（3）液相色谱- 串联质谱法（LC-MS/MS）测定。本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS 应用于动物组织及尿液中生物标志物的含量的定性确证和定量检测，方法回收率在74.2%～106.2%之间，平均相对标准偏差（RSD）为6.4%～13.0%，检出限为20.0 μg/kg, 定量限为50.0 μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。
【专利说明】一组生物标志物的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一组生物标志物的测定方法，更具体地说是采用高效液相色谱-串联 质谱（LC-MS/MS)定性定量测定生物组织或尿液品中的生物标志物含量的方法，属于生物 标志物测定【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着溴氰菊酯使用范围的不断扩大，溴氰菊酯的毒理研究亦从单纯的选 择低等生物为实验对象研究神经毒性作用机制，扩展到对哺乳动物的三致作用、代谢过程 等多层次的研究。为评估其生态风险，需要发展用于生物亚致死效应的指示参数来更为准 确地评估和预测其对环境生物的毒害情况许多研究者首先从生物化学方面探索反应污染 物对生物早期的影响参数，其中生物标志物法因为测定指标全面、准确且系统，而得到普遍 认可。生物标志物通常分为三类：即暴露标志物、效应标志物和易感性标志物。在选择合适 的生物标志物时，有时需要综合分析，权衡利弊，采取一组综合的评价指标。
[0003] 溴氰菊酯，分子式C22H19Br2N03，分子量505. 20,结构式如下：
[0004]
【权利要求】
1. 一组生物标志物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取与净化 样品制备动物肉、动物肝样品经均质制样机充分粉碎，-20°c避光保存；动物尿样品冰 箱中-20°C避光保存，样品使用前避光解冻： a) 动物肉样品：称取样品2. 00±0.Olg，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移 至50mL聚丙烯离心管中，准确加入IOmL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋IOs后用细胞 破碎仪超声提取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中； 残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4°C10000r/min离心 5min，所得上清液于40°C下氮气吹至近干；用乙腈水（1:9)定容至lmL，定溶液涡旋后转移 至2mLEP管中，4°C12000r/min离心lOmin，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分 析； b) 肝脏样品：称取样品2. 00±0.Olg，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至 50mL聚丙烯离心管中，准确加入IOmL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋IOs后用细胞破碎 仪超声提取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加 入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4°ClOOOOr/min离心5min， 所得上清液于40°C下氮气浓缩至2mL左右，加入5X2mL乙腈饱和正己烷脱脂2次，离心，将 弃去正己烷后的提取液继续40°C下氮气浓缩至近干；用乙腈：水（1:9)定容至lmL，涡旋后 转移至2mLEP管中，4°C12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC-MS/ MS进样分析； c) 尿液样品：用移液枪取I.OmL动物尿样品于50mL聚丙烯离心管中，用甲酸铵缓冲 液调节至中性，加入10μL抗氧剂和ImL甲醇，润旋30s后8000r/min离心5min，转出上清 液，加5mL正己烷脱脂2次后，加载至事先用甲醇和水活化好的HLB小柱，接取流出样液， 4°C12000r/min离心IOmin,吸取上清液进棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分析； (2) 标准工作溶液的配制 将空白样品按上述步骤（1)处理，用该空白样品基质溶液在2?100μg/L范围内，配 制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液； ⑶液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS)测定 将步骤（2)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱 峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（1)中净化 后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中生物标志物的色谱峰面积，代入标准曲 线，得到样品液中生物标志物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中生 物标志物含量。
2. 根据权利要求1所述的一种样品中生物标志物含量的测定方法，其特征在于，步骤 (1)中基质分散固相萃取剂是十八烷基硅烷键合相（C18),每克样品中C18加入量为50mg。
3. 根据权利要求1或2所述的一种样品中生物标志物含量的测定方法，其特征在于，步 骤（1)中提取溶液为含易挥发有机酸的乙腈水溶液。
4. 根据权利要求1所述的一种样品中生物标志物含量的测定方法，其特征在于，步骤 (1)中抗氧剂是维生素C。
5. 根据权利要求1所述的一种生物标志物含量的测定方法，其特征在于，步骤（1)中样 品净化过程中氮吹至近干后，定容液乙腈-水的比例与初始流动相一致。
6. 据权利要求1所述的一种生物标志物含量的测定方法，其特征在于，步骤（3)中液相 色谱的流动相A为乙腈；流动相B为体积比是0. 1 %的甲酸水溶液。
7. 根据权利要求6所述的一种生物标志物含量的测定方法，其特征在于，步骤（3)中液 相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序是：
8. 根据权利要求1所述的一种生物标志物含量的测定方法，其特征在于，步骤（3)中液 相色谱的色谱柱填料为C18,粒径为3μπι;步骤（3)中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷 雾电压：+5500V&-4500V;电离方式：ESI+&ESI_;正负离子同时扫描；离子源温度：550°C;雾 化气压力：〇· 31MPa;气帘气压力：0· 207MPa;辅助气压力：0· 369MPa。
9. 根据权利要求1所述的一种生物标志物含量的测定方法，其特征在于，所述的生 物标志物是IR, 3R-二溴菊酸[lR-cis) _3_ (2, 2-dibromoethenyl) -2, 2-dimethylcyclo propanecarboxylicacid]、3_ 苯氧基苯甲酸（3-phenoxybenzoicacid，3_PBA)、8-轻 基脱氧鸟苷（8H3HdG)、6-甲氧基鸟噪呤（6_Methoxyguanine)、5-轻基色胺（Serotonin hydrochloride，5-HT)、5-羟吲哚乙酸（5-HYDR0XYIND0LE-3-ACETICACID，5-HIAA)、 3-硝基丙酸（3-NITR0PR0PI0NICACID，3-NPA)、多巴胺（3-Hydroxytyramine，DA)、肾上 腺素（L(-)-Epin印hrine，EP)、还原型谷胱甘肽（GSH)、氧化型谷胱甘肽（GSSG)、维生素 C(L(+)-Ascorbicacid,VC)〇
10. 根据权利要求9所述的一种生物标志物含量的测定方法，其特征在于，步骤（3)中 质谱检测使用多反应监测（MRM)扫描模式，各生物标志物的母、子离子及MRM监测条件为：
【文档编号】G01N30/88GK104458988SQ201410705215
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】曹文卿, 静平, 李建军, 林黎明, 杨桂朋, 封立平 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心