用于改进树中的树干材积生长和生物量生产的方法

用于改进树中的树干材积生长和生物量生产的方法
【专利摘要】本发明涉及遗传构建体，其包含可操作连接到启动子的编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶(IPT)的核酸序列，所述启动子允许所述核酸序列在形成层细胞中表达。本发明还涉及用于产生与野生型植物相比有增加的生物量生产和/或增加的树干积材生长的能力的转基因植物的方法，生物量以及用于改进树中的生物量的生产和/或增加的树干积材生长的方法，以及在形成层细胞中过表达编码IPT的内源性或外源性核酸序列的树，和从该转基因树可获得的木材产品。
【专利说明】
用于改进树中的树干材积生长和生物量生产的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及用于产生有增加的树干材积生长和/或生物量生产的能力的转基因植 物的方法以及还涉及用于改进树木中的树干材积生长和/或生物量生产的方法。本发明还 涉及经遗传修饰的树，来源于所述树的木材产品，遗传构建体和载体以及表达所述遗传构 建体和载体的树。
[0002] 发明背景
[0003] 维管形成层(木本植物物种的横向分生组织）的活动产生次生维管组织。形成层分 生组织沿着树干(或根或枝）形成薄圆柱体，并且它既向内又向外产生新的维管组织。这些 组织，次生木质部和韧皮部，形成植物器官中的横向生长的体积(bulk)。它们两者中的传导 维管细胞(conducting vascular cel Is)通过多步骤分化过程逐渐获得它们的最终功能形 式。发展中的木质部细胞将经历扩张，次生细胞壁形成，程序性细胞死亡和最终木质化。相 似地，功能性韧皮部细胞将通过连续的几个发育步骤形成，包括筛管成分和伴细胞的分化。 这些多步骤分化程序形成穿过形成层区域的两种相反导向的发育梯度;韧皮部或木质部细 胞与分生组织中间相距越远，它处于其分化过程中越晚。引人注目的是，形成层分生组织的 核心;活跃分裂的细胞，保留了它们的分生组织性质，并保持未分化为维管细胞的任一种形 式。平周细胞分裂既更新了分生组织细胞的群体，又提供了用于维管组织分化程序的新生 材料，而垂周分裂实现新的细胞队列的创建和形成层圈的扩张。
[0004] 次级发育（secondary development)的规模在树种中高度不同；它们在其长的寿 命期间表现出极度的和经济上高度有价值的木材生产能力。潜在地作为大规模次级生长的 适应，大多数树的木材也含有广泛的横向运输系统，维管福射状网络(ray network)。对于 多年生树种的形成层功能的其它新的挑战以每年的活动-休眠周期呈现。为了保证它们的 存活，树必须使它们的形成层活性适于冷和暖(或湿和干)季节的每年循环。它们必须能够 在春天中活化它们的形成层分生组织并在秋天期间使其失活为休眠静息阶段。
[0005] 如果能够改进树的生长，并且具体地如果能够增强树干积材(stem volume)，对于 木材生产的经济性将是高度有价值的。
[0006] 已经表明细胞分裂素信号传导（cytokinin signalling)对于形成层功能是需要 的。具有受损的细胞分裂素信号传导的转基因杨属树(Populus tree)表现出受损的径向生 长，其由维管形成层中细胞分裂的数量减少所导致(Nieminen et al. ,2008)。另外，编码细 胞分裂素受体的基因和细胞分裂素初级反应基因在杨属树干的形成层区域中是丰富的 (Nieminen et al·，2008)。
[0007] 虽然已知细胞分裂素信号传导与树的生物量生产相关，但该图景是复杂的，因为 存在至少大约100种形成层富集的和细胞分裂素调控的、具有几种功能的基因。不知道这些 基因中的哪些对于树干细胞的径向生长是需要的(Tuskan et al. ,2006)。
[0008] 为了进一步增加形成层的激素调节的复杂性，在其它组织中的研究已经揭示了细 胞分裂素和生长素信号传导之间的高度互联网络(El-Showk et al.，2013)。细胞分裂素能 够影响生长素的生物合成和运输两者。有趣的是，该调节似乎是高度复杂的，因为已经存在 有关于细胞分裂素对生长素生物合成的正面和负面影响的几项报道。关于细胞分裂素对生 长素运输的影响已经获得了相似的结果，其中已经报道了该激素既上调又下调生长素转运 蛋白水平。很可能这些分歧的结果反映了微调的（fine-tuned)调节模式;细胞分裂素可能 对不同的生长素生物合成酶和转运蛋白具有不同的影响，很可能以组织特异性的方式。最 重要的是，也已知生长素在调节细胞分裂素的生物合成和信号传导中具有相似的复杂角 色。
[0009]国际专利申请W0 2006/034286描述了组合物和方法，其采用参与调节植物发育的 异戊烯基转移酶（IPT)多肽和多核苷酸。在该方法中，描述的IPT的表达维持或改进了例如 植物的应激耐受性（stress tolerance)，维持或增加了植物的尺寸，维持了结种（seed set)，或增加了芽（shoot)生长。
[0010] 虽然现有技术中已经进行了一些尝试以改进植物生长，但仍需要能够用于改进树 木生长，特别是改进树干积材和生物量生产的方法和构建体。
[0011] 发明简述
[0012] 本发明的一个目的是提供现有技术中遇到的问题的解决方案。具体地，本发明旨 在提供如何改进树生长的解决方案。此外，本发明旨在增加树木中的树干积材生长和生物 量生产。
[0013] 具体地，本发明的一个目的是提供解决方案，其改进树中的径向生长。
[0014] 为了实现这些目标，本发明的特征在于独立权利要求中登记的特征。其它的权利 要求代表了本发明的优选实施方案。
[0015] 本发明基于以下发现，即有可能通过提高形成层细胞中的细胞分裂素信号传导增 强形成层细胞中的细胞分裂。更具体地，可能通过允许形成层细胞中特定基因的表达提高 形成层细胞中的细胞分裂，所述基因编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶。
[0016] 现在出人意料地发现了通过形成层细胞中的酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转 移酶的增强的表达导致了增强的树干积材生长和/或增加的生物量生产。
[0017]因此，在一个方面，本发明提供如权利要求1中所定义的遗传构建体，其包含与第 二核酸序列（启动子)可操作连接的编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的第一核 酸序列(效应器），所述第二核酸序列（启动子)允许所述第一核酸序列在形成层细胞中的表 达。
[0018] 另一个方面，本发明提供如权利要求7中所定义的包含所述遗传构建体的载体。
[0019] 因此，在第三个方面，本发明提供如权利要求8中所定义的树，其在形成层细胞中 过表达内源核酸序列，或表达外源核酸序列，所述内源核酸序列或外源核酸序列编码酶细 胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶。
[0020] 在第四个方面，本发明提供如权利要求16中所定义的从所述树可获得的木材产 品。
[0021] 在第五个方面，本发明提供如权利要求17中所定义的用于生产转基因植物的方 法，所述转基因植物与野生型植物相比有提高的生物量生产和/或增加的树干积材生长的 能力。
[0022] 在第六个方面，本发明提供如权利要求18中所定义的用于改进树中的生物量生产 和/或增加的树干积材生长的方法。
[0023] 附图简述
[0024] 图1.系统发生树，表明了多种IPT的平均距离，AtlPT5是AtlPT7的最接近的拟南芥 属直向同系物(ortholog)。
[0025] 图2 . IPT中的保守域：来自不同来源的域A、B和C和拟南芥（Arab idops i s thaliana)中的对应域A'、B'和C' a表示任意氨基酸，圆括号(x)中的x表示不需要的氨基 酸。方括号表示在方括号[]中的氨基酸残基的任一个。
[0026] 图3^七1?了7和4七1?了5直向同系物的氨基酸序列的比较和具有超过50%相似同一 性的共有序列(大写字母表示具有100%相同氨基酸的氨基酸，而小写字母表示比较的序列 的50-90%中相同的氨基酸）。
[0027] 图4.插入植物基因组的转化载体的部分(约8200bp)。该构建体图谱示出了不同的 位点，以及它们的来源，估计的大小和功能。
[0028] 图5A.三个月龄的WT和pLMX5-IPT7品系1和3的杨属树的表型。
[0029] 图5B.转基因 pLMX5-IPT7杨属树品系1和3相比于WT的树干材积。
[0030] 图5C.WT和pLMX5_IPT7品系的细胞分裂素反应性测定(responsiveness assay)。
[0031]图OT.WT和pLMX5-IPT7品系1树干中的细胞分裂素受体(PttHK3a)，细胞分裂素信 号传导初级反应基因(A型RR PttRR7)和生长素信号传导标志物基因（PttIAA3)的表达。 [0032]图6.WT(A)和转基因杨属pLMX5: :IPT7品系1树干(B)中形成层解剖学、激素含量和 激素信号概况。收集了四个部分(A-D)用于激素分析(Α、Β)。
[0033] 发明详述
[0034] 本发明提供转基因树，其具有增加的树干积材生长和/或生物量生产。描述了可用 于产生所述转基因树木的遗传构建体和载体以及用于产生这些树木的方法。
[0035] 本发明提供遗传构建体，其包含可操作地连接到第二核酸序列（启动子)的编码酶 细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的第一核酸序列（效应器），所述第二核酸序列（启动 子)允许所述第一核酸序列在形成层细胞中的表达。
[0036] "第一核酸序列"这里表示效应基因，其编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移 酶。所述第一核酸序列选自下组：
[0037] (a)包含SEQ ID NO: 1的核酸序列；
[0038] (b)编码SEQ ID N0:2的核酸序列；
[0039] (c)编码包含保守域区域A、B和/或C的氨基酸序列的核酸序列，所述保守域区域A、 B和/或C具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID N0:3、4和5;
[0040] (d)编码包含区域D的氨基酸序列的核酸序列，所述区域D与氨基酸序列SEQ ID N0:6(即SEQ ID N0:2的氨基酸40-141;见图3第三行）具有至少80%同一性，优选至少85% 同一性，更优选至少90 %同一性，还更优选至少95 %同一性；
[0041 ] (e)编码与SEQ ID N0:2显示至少80%同一性，优选85%同一性，更优选至少90% 同一性，还更优选至少95%同一性的氨基酸序列的核酸序列;和 [0042] (f)编码酶的核酸序列，所述酶属于酶类EC 2.5.1.27。
[0043]本发明还包括实施方案，其中所述第一核酸序列编码包含保守域区域A'、B'和/或 C'的氨基酸序列，所述保守域区域A'、B'和/或C'具有如图2中所显示的拟南芥的域A'、B' 和/或C'的氨基酸序列。
[0044]在被子植物和裸子植物两者中的几个植物属和种中发现了编码酶细胞分裂素生 物合成异戊烯基转移酶（IPT)的基因。当比较IPT的氨基酸序列时，在不同的植物属中发现 了特定结构域中的紧密同源性，见W0 2006/034286。因此，从不同的植物属和种中发现IPT 是可能的，其以与本文中描述的基因相似的方式发挥功能。
[0045] Kakimoto(2001)对拟南芥属IPT AtIPTl-9的序列分析，与来自根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens )，丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae)和成团泛菌 (Pantoeaagglomerans)的IPT比较，揭示了三个共有模式：域A(SEQ ID N0:3)，域B(SEQ ID N0:4)和域C(SEQ ID N0:5)。所述共有模式示于图2中，其中x表示任意氨基酸残基，（x)表示 不需要的氨基酸残基，方括号表示方括号□中的氨基酸残基的任一个。拟南芥的9种不同 IPT的对应域区域A'、B'和C'也示于图2中。
[0046] 相似的保守域（有阴影）也存在于从毛果杨（Populus trichocarpa) (PtIPT7a eugene3.00041149；PtIPT7b eugene3.00080280；PtIPT5a fgenesh4_pg.C_LG_X000229； PtIPT5b_fgenesh4_pg · C_LG_VI 11001825)和巨桉（Eucalyptus grandis) (Eucgr ·Β01146; Eucgr.G00473;Eucgr.G01887;Eucgr.H03602)基因组鉴定的最接近的AtIPT7直向同系物 中，如图3中所示。
[0047] 在进化平均距离树中，已经显示了AtIPT7和AtIPT5-起形成进化枝。AtIPT5似乎 是AtIPT7的最接近的拟南芥属直向同系物。在AtIPT7直向同系物之间，具有超过50%相似 同一性的共有序列，这里称为共有区域D，示于图3中（大写字母表示具有100%相同氨基酸 的氨基酸，而小写字母表示比较的序列的50-90 %中相同的氨基酸）。在拟南芥 (A.thaliana)中IPT7氨基酸40-141对应所述保守序列，图3中第三行(序列表中SEQ ID N0: 6)〇
[0048] 核酸氨基酸序列的比对方法对于本领域技术人员是公知的，例如Smith-Waterman 算法(经修改用于速度提升）以计算两个序列的局部比对。Blast是用于同一性确定的最有 用的工具:Basic Local Alignment Search Tool，或BLAST，是用于比较一级生物学信息的 算法，例如不同蛋白的氨基酸序列或DNA序列的核苷酸。BLAST搜索使得研究者能够将查询 序列与文库或数据库序列比较，并鉴定与查询序列相似得高于特定阈值的文库序列。根据 查询序列，不同类型的BLAST是可用的。BLAST程序由Stephen Altschul设计(Altschul， 1990)〇
[0049] 编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的基因可以选自编码不同IPT的基 因，优选选自编码IPT的基因的组，其属于酶类EC 2.5.1.27。
[0050] 更优选的是，编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的基因包含一个或多个 保守域区域A、B和/或C，所述保守域区域A、B和/或C具优选自SEQ ID N0:3、4和5的一个或多 个氨基酸序列。
[0051] 还更优选的是，编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的基因包含一个或多 个保守域区域A'、B'和/或C'，所述保守域区域A'、B'和/或C'具有拟南芥的9种IPT的在图2 中所示的相应域区域A'、B'和/或C'的一个或多个氨基酸序列。
[0052] 仍然进一步优选的是，编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的基因包含区 域D，其具有与氨基酸序列SEQ ID N0:6(即SEQ ID N0:2中的对应区域）具有至少80%同一 性，优选至少85 %同一性，更优选至少90 %同一性，还更优选至少95 %同一性，更更优选至 少98 %同一性，还更优选至少99 %同一性，最优选100 %同一性。
[0053] 编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的基因的其它区域可以以比编码保 守域区域A、B和/或C或A'、B'和/或C'和/或区域D在更广泛的范围内变化。这些区域中的同 一性％可以低于80%，低于75%，低于70%，低于60%，或甚至低于50%。
[0054] 在本发明优选的实施方案中，编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的基因 编码与SEQ ID N0:2显示至少80 %同一性，优选至少85 %同一性，更优选至少90 %同一性， 还更优选至少95 %同一性，更更优选至少98 %同一性，还更优选至少99 %同一性，最优选 100%同一性的氨基酸序列。
[0055] 编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的基因可以选自编码不同IPT的基 因，优选编码IPT 7或IPT 5的基因，更优选IPT 7的基因。
[0056] 编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的基因可以来源于任意植物属或种， 其表达酶功能性细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶。典型地，植物是被子植物，优选拟南 芥属，桦木属(Betula)、杨属，或桉属(Eucalyptus)植物。
[0057] 效应基因 AT3G23630,拟南芥异戊烯基转移酶7(AtIPT7)来自拟南芥属，高度直向 同源的拟南芥属IPT，AtIPT4蛋白的基因序列功能分析已经由Kakimoto 2001发表。
[0058]本发明通过使用拟南芥属细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶IPT7编码基因（基 因 AT3G23630)SEQ ID N0:1示例。所述基因编码氨基酸序列SEQ ID N0:2。当氨基酸序列SEQ ID NO: 2与来自其它来源的IPT比较时，发现在域区域A、域区域B，和/或域区域C中或拟南芥 中的不同IPT之间可以发现紧密同源性，发现在域区域A'、域区域B'，和/或域区域C'中可以 发现紧密同源性(见图2和2)。来自不同来源的氨基酸序列之间的这些区域的同一性％为至 少80 %，优选至少85 %同一性，更优选至少90 %同一性，还更优选至少95 %同一性，甚至优 选至少97 %同一性，越来越优选至少98 %同一性，还更优选至少99 %同一性，最优选100 % 同一,性。
[0059] 因此，在本发明中，可能使用与来自拟南芥属的IPT7基因相似的方式发挥功能的 基因，来自几种其它的植物属和种和/或来自不同的IPT。还可能使用与SEQ ID NO: 1相比包 含取代，插入，缺失或其它修饰的核酸序列，只要该核酸序列编码酶细胞分裂素生物合成异 戊烯基转移酶，优选属于酶类EC2.5.1.27。更优选地，所述酶属于IPT7。
[0060] 编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶且用于如本文中所述的遗传构建体 中的核酸序列典型地是从它们的来源分离的序列，例如，拟南芥IPT7用于遗传构建体中，所 述遗传构建体导入杨属细胞以培养转基因杨属树。然而，也可能增强编码IPT的内源性核酸 序列的表达。
[0061] 根据本公开的遗传构建体包含第二核酸序列，其为允许植物的分生组织细胞中的 酶分裂素生物合成异戊烯基转移酶表达的启动子。优选的是，所述启动子允许形成层细胞 和顶端细胞中，更优选特别在形成层细胞中的表达。
[0062]通过"启动子"表示的是结合RNA聚合酶并将酶指引到特定多核苷酸序列的适当转 录起始位点的DNA区域。启动子可以另外包含其它识别序列，称为上游启动子元件，其影响 转录起始速率。
[0063]允许在形成层中的分生组织细胞中和顶端细胞中表达的启动子的例子是桦木分 生组织启动子pBpCREl。该启动子优选由SEQ ID N0:7(GenBank EU583454，Nieminen et al.2008)限定。
[0064] 允许在分生组织细胞中表达的启动子的另一个例子是允许特异性在形成层细胞 中表达的启动子。此类特异性在形成层细胞中表达的启动子是杨属形成层特异性启动子 pLM5,优选由SEQ ID N0:8(pLM5启动子也描述于W02004097024A1，作为SEQIDN04 LMX5 A055P19U)限定。
[0065] 在该遗传构建体中，第一核酸序列（效应器)可操作地连接到第二核酸序列（启动 子）。通过"可操作连接"表示的是两个遗传元件通过功能性联系连接，例如效应基因可操作 连接到允许所述效应基因表达的启动子。
[0066] 遗传构建体也可以含有选择标志物，用于选择包含引入的遗传构建体的细胞。选 择标志物例如是抗生素抗性氨苄青霉素、羧苄青霉素和潮霉素 B抗性。
[0067] 在本公开中，启动子和效应器的连接通过启动子pLMX5示例，其已经可操作连接到 效应基因，通过将其插入到Gateway 2nd盒克隆位点中的该效应基因的紧密临近中（图4)。 [0068] 已经使用了以下Gateway克隆引物：
[0069] IPT7_Fwd GW引物：
[0070] ACAAAAAAGCAGGCTTAATGAAGTTCTCAATCTCA(SEQ ID NO:9)
[0071] IPT7_REV GW引物：
[0072] TACAAGAAAGCTGGGTATCATATCATATTGTGGG(SEQ ID NO:10)
[0073] 当已经将LMX5::AtIPT7构建体（SEQIDN0:ll)引入树中时，具有LMX5::AtIPT7构 建体的转基因树表现出拟南芥腺苷磷酸-异戊烯基转移酶7(IPT;EC 2.5.1.27)的异位过表 达，通过LMX5启动子在形成层带(cambial zone)中表达(描述于Love et al.2009)。在该转 基因树中，通过增加形成层带中细胞分裂素植物激素的量，刺激细胞分裂素信号传导。来自 拟南芥的腺苷磷酸-异戊烯基转移酶7(AtIPT7)酶催化异戊二烯细胞分裂素的生物合成途 径中的第一(限速)反应。AtIPT7在拟南芥属的维管组织中表达(Sakakibara，2006)。
[0074] 在图4中呈现了以下区域：
[0075] -LB左边界:根癌土壤杆菌;25bp;用于Ti-质粒(Ti-plasmidin)中的毒力基因的识 别位点;插入的起始(转移到植物基因组中的质粒的部分）。起始位置lstbp.ColEl(复制子）： 大肠杆菌PBR322质粒的部分;615bp;细菌培养物的扩增(不在转基因植物中表达）；
[0076] -β_内酰胺酶(bla)_基因：大肠杆菌pBR322质粒的部分;861bp:基因给予细菌培养 物中的氨苄青霉素/羧苄青霉素抗性(不在转基因植物中表达）；
[0077] -pLMX5:杂交白杨（Populustremula XP. tremuloides); 1807bp;用于过表达腺苷 磷酸-异戊烯基转移酶7(AtIPT7)酶基因的启动子。起始位置第3000bp。
[0078] -attBl:合成的（Invitrogen公司）；19bp;Gateway技术中的重组位点；
[0079]-编码腺苷磷酸-异戊烯基转移酶7(AtIPT7)酶的基因；拟南芥;990bp。起始位置第 4845bp〇
[0080] -attB:合成的（Invitrogen公司）；17bp;Gateway技术中的重组位点；
[0081] _pAn〇S(胭脂氨酸合酶基因的非编码3'区）：根癌土壤杆菌；约200bp(1);多聚腺苷 酸化信号（用于转录终止的信号）用于ERF基因；
[0082] -pnos，根癌土壤杆菌；约200bp(1);用于潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因表达的启动 子；
[0083] _hpt;大肠杆菌；1000bp(1);基因给予针对用于选择的潮霉素財允性；
[0084] -pAg4(TL-DNA:n基因 4):根癌土壤杆菌;约200bp(1);用于hpt基因的多聚腺甘酸化 信号
[0085] -RB('右边界'）：根癌土壤杆菌；25bp:Ti_质粒中的毒力基因的识别区；植物基因 组插入物的末端。⑴在原始参考文献(Walden et al.，1990;Koncz et al.，1994)中该位点 的大小没有限定，且其不能从其它来源推导。
[0086] -与土壤杆菌属二元缺口修复载体(binary gap repair vector)pGAP_Hyg(完全 序列：Sequence ID: gb IEU933993 · 1长度：7942)和与pBR322相似的主链载体。
[0087] 为了将该遗传构建体引入植物中通常需要载体。适合的载体为例如细菌根癌土壤 杆菌。
[0088] 也存在可用于将遗传材料引入植物的可用的其它系统。此类系统不必需要载体。 例如通过树之间的有性繁殖和通过颗粒轰击(将由经DNA覆盖的金射入细胞中）将遗传材料 引入被子植物和裸子植物物种是可能的。
[0089] 本发明提供树，其过表达编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的内源性核 酸序列，或表达编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的外源性核酸序列。
[0090] 如本文所述，效应基因需要在形成层细胞中表达。这通过使用一般允许在分生组 织细胞中表达的启动子是可能的。然而，如果在任意分生组织细胞中增强细胞分裂是不利 的。例如，如果树的树叶生长得非常大或紧密可能是不利的，虽然树干积材同时增加。根据 本公开，优选使用允许在形成层细胞和顶端细胞中表达的启动子，因为树的总体生长不会 太大，仅树干积材生长和高度的生长。最优选的是使用允许在形成层细胞中特异性表达的 启动子。在这种情况下，树干积材生长增加，但树的总体生长或树木的高度不增加。意图与 相同物种，龄和生长条件的野生型树进行所有的比较。
[0091] 可以通过使用如本文所述的遗传构建体将效应基因引入树中。或者，可以改进树 内源的效应基因的表达。例如在杨属中，可以改进杨属IPT7的表达。
[0092] 可以通过异位过表达，通过就像通过备选启动子一样驱动内源性基因，驱动比内 源性启动子更高的表达水平增强基因的表达。这可以通过将在选择的启动子下的内源性基 因的新拷贝导入基因组中完成。或者，可以通过激活标记(activation tagging)增强内源 性基因的表达，其中增强子元件引入植物基因组中，在那里它们能够增强它们临近处中的 基因的转录。在将来，还可以通过基因编辑获得内源性基因的增强的表达，例如，使用工程 化的核酸酶，其可以用于删除抑制期望基因的表达的沉默子元件(silencor element)。
[0093] 与WT树木相比，如本文所述产生的转基因树在形成层发育期间在形成层细胞中表 达高至少40%，优选至少44%，更优选至少46%，仍然更优选至少50%，越来越优选至少 60 %水平的细胞分裂素信号传导。
[0094] 此外，与野生型(WT)树木相比，在如本文所述产生的转基因树中，在所述树中的树 干积材生长高至少35%，优选至少38%，更优选至少40%，仍然更优选至少45%，越来越优 选至少50 %。
[0095]在本发明的一个方面，优选地，在形成层细胞中表达效应基因的树属于被子植物。 该树是一年生树或多年生树，优选多年生树。该树属于桦木属、杨属或桉属。优选地，该树木 属于杨属。该杨属选自杨属品种P. tremula，银白杨(P.alba)，美洲山杨(P. tremuloides)， P· canescens，美洲黑杨（P · deltoids)，P · fremontii，小黑杨（P ·nigra)，P · Canadensis， P. inopina，和欧洲山杨(Populustremula)x美洲山杨（tremuloides)的组。
[0096] 在本发明的第二个方面，在形成层细胞中表达效应基因的树属于裸子植物。该树 优选是云杉(spruce)或松树(pine)。
[0097] 本发明还包含从本发明的转基因树可获得的多种木材产品。此类木材产品是例如 树干、树枝、树根和种子。
[0098] 本发明还提供用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物与野生型植物相比有 增加的生物量生产和/或增加的树干积材生长的能力。所述方法包括以下步骤
[0099] -向树细胞导入可操作地连接到允许在形成层细胞中表达的启动子的编码酶细胞 分裂素生物合成异戊烯基转移酶的核酸序列，
[0100] -培养所述细胞以形成细胞培养物，
[0101] -将所述细胞培养物再生为植物，其中所述编码酶细胞分裂素生物合成
[0102] 异戊烯基转移酶的核酸序列在形成层发育期间在形成层细胞中表达。
[0103] 用于被子树木的基于土壤杆菌属的转化方法已经由例如Hiiggmanet al.2003， Seppiinenet al.2004和Nilsson et al.1992发表。一般来说，该方法包括植物外植体 (explant)(叶盘、茎段等)在土壤杆菌属培养物中孵育，其后将它们与土壤杆菌属细菌在固 体培养基上共培养。为了结束该共培养，通过洗涤去除土壤杆菌属细菌。植物外植体在愈伤 组织生产培养基上培养，所述培养基通过抗生素补充以将愈伤组织生产限制为携带抗生素 抗性基因的转基因细胞。将形成中的愈伤组织转移到再生培养基上用于芽产生。将再生的 芽转移到根诱导培养基上。在根形成后，该小植株可以在土壤中生长。
[0104] 本发明还提供用于改进树中生物量生产和/或增加的树干积材生长的方法。所述 方法包括以下步骤
[0105] -向树细胞引入可操作地连接到允许在形成层细胞中表达的启动子的编码酶细胞 分裂素生物合成异戊烯基转移酶的核酸序列，
[0106] -培养所述细胞以形成细胞培养物，
[0107] -将所述细胞培养物再生为植物，其中所述编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基 转移酶的基因在形成层发育期间在形成层细胞中表达，
[0108] -允许所述植物生长为成年树木，其具有与野生型树相比增强的径向生长。
[0109] 在土壤杆菌属介导的转化中，植物外植体与含有期望转基因的土壤杆菌属细菌共 培养。土壤杆菌属细菌通过将转基因 DNA整合到植物基因组中转化外植体中的植物细胞。放 置到可选择的生根和生芽培养基上，将从转化的细胞再生转基因植物。
[0110]在颗粒(微粒)轰击方法中，用DNA包被金或钨颗粒并射击到植物细胞中。插入的 DNA将整合到植物基因组中。
[0111] 在电穿孔方法中，使用电击(electric shock)在植物原生质膜中形成瞬时的孔； 这允许转基因 DNA进入植物原生质。
[0112] 在病毒转化(转导)方法中，期望的转基因包装到适合的植物病毒中，且通过该病 毒感染植物。转基因材料将整合到植物基因组中。
[0113] 通过"增加的生物量生产"这里表示与相同年的野生型树相比转基因树的生物量 (树干干重质量)的额外量。
[0114] 在本说明书中，WT树的树干干质量在16周龄测量（3棵树的平均值）且为35±2 (STDEV)g，而 pLMX5-IPT7 树(3 棵树木)的树干为 51±8g。
[0115] 通过"增加的树干积材生长"这里表示与相同龄的野生型树相比转基因树中树干 积材的额外量。
[0116] 在本说明书中，每周一次测量树干积材，3个测量点（土壤水平以上10cm，树中间， 顶点以下2cm)，通过fructa公式计算积材(底部到中间和中间到顶点的总和）。
[0117]
[0118] 具中v =体枳
[0119] h =高度 [0120] r =上部的半径
[0121] R =下部的半径
[0122] http://www.mathwords.com/f/frustum.htm
[0123] 与野生型树相比，转基因 IPT7过表达的树具有更多的树干积材(图5)。转基因树中 的树干积材生长平均高53%，并且高至少38% (如果考虑标准误差的话）。
[0124] 与WT树相比，转基因树在形成层发育期间在形成层细胞中表达平均高83%和高至 少44% (如果考虑标准误差的话)的水平的细胞分裂素信号传导。
[0125] 本发明还包括应用，其中该转基因树是没有花、花粉或种子发育的能力的不育树。 用于产生不育树的方法对于本领域的技术人员是已知的。
[0126] 可以选择具有不同染色体数量的两种相关物种之间的杂交体(例如四倍体与二倍 体杂交以制成不育的三倍体）的不育克隆用于转化。转基因树可以无性繁殖并测试它们的 不育性(用于消除的，败育的或不育的花，花粉或种子发育）。
[0127] 为了示例本发明，本文描述了表现出升高的细胞分裂素信号传导水平的转基因树 的工程化。在这些树中，分析了生长素和细胞分裂素分布和信号传导的状态和模式。
[0128] 表征了杨属树干中穿过形成层分生组织的生长素和细胞分裂素概况的浓度。此 外，为了将细胞分裂素激素概况分析(prifiling)与细胞分裂素信号传导相关联，进行了对 穿过杨属形成层带的细胞分裂素生物合成和信号传导基因的表达概况的广泛分析。
[0129] 为了更好理解在形成层细胞分裂的调节中两种主要的激素途径，细胞分裂素和生 长素之间的相互作用，分析了穿过毛果杨(Populustrichocarpa)树干的形成层带的它们的 浓度水平。分析了代表韧皮部，引导韧皮部，发育韧皮部，形成层，发育木质部和木质部组织 的树干冷冻切片（图6)。
[0130] 为了验证分析的冷冻切片的组织身份，在分析中包括了多种组织类型的标志物基 因。PtSUC用作韧皮部细胞标志物，PtANT，作为分裂的形成层细胞的标志物，和PtC0MT2用于 韧皮部纤维和木质部细胞。标志物与产生冷冻切片期间通过显微术确定的组织身份很好地 相关。
[0131] 本发明基于对细胞分裂素在树干的形成层发育的调节中的功能的详细分析。以与 生长素相似的方式，细胞分裂素激素也具有穿过形成层带的浓度梯度。细胞分裂素浓度峰 值与该激素的生物合成和信号传导基因的的高表达域相一致。
[0132] 除了 PtCKIl基因外，检测到了杨属形成层中细胞分裂素生物合成和信号转导途径 的所有组分的表达。CKI1基因的有效表达水平非常低，在表达分析的检测极限以下，或者它 们对于杨属树的活跃生长期间形成层发育不是需要的。
[0133] 细胞分裂素信号传导的所有组分的表达确认了该激素信号传导途径对于维管形 成层的活动的重要性。
[0134] 有趣的是，细胞分裂素的形成层分布概况与生长素的浓度概况不同，但部分重叠。 高生长素浓度被限制在活跃分裂的，未分化的形成层细胞区域;而高的细胞分裂素浓度具 有较大的区域，从未分化的形成层延伸到发育的韧皮部。
[0135] 在本公开中，已经示出了通过刺激转基因杨属树中的细胞分裂素信号传导可以提 高树干中的生物量积累。这些树表现出增强的细胞分裂素反应性以及升高水平的细胞分裂 素信号传导。与WT树木相比，转基因树的形成层细胞分裂活性增加，并分别地，树干的径向 生长加速。由于这些树为WT高度的，细胞分裂素对径向生长的刺激效果不依赖于顶端生长 速率。此外，细胞分裂素的该刺激作用似乎通过CK和生长素之间的串扰发生:升高的CK浓度 和信号传导增加形成层区中的生长素浓度和信号传导的水平并加宽其区域。潜在地，生长 素和细胞分裂素作用的部分重叠的区域在调节不同的发育过程中具有特定的功能，所述发 育过程发生于形成层带间。在形成层中间的生长素和细胞分裂素之间的串扰可能限定用于 维持活跃分化的细胞合并物的干细胞小生境(niche)。分别地，可能地，在形成层带的韧皮 部侧的高细胞分裂素与生长素比率有助于确定发育的维管细胞的韧皮部身份。
[0136] 通过以下非限制性实施例说明本发明。本发明适用于与实施例中阐明的基因，遗 传构建体和植物不同的基因，遗传构建体和植物。然而，应当理解，以上说明书中和实施例 中给出的实施方案仅用于说明的目的，且各种改变和修饰可能在本发明的范围内。 实施例
[0137] 实施例1
[0138] 具有刺激的形成层细胞分裂素信号传导的转基因杨属树的工程化
[0139] 为了研究细胞分裂素信号传导对树干生长的影响，转基因杨属（P.tremula X tremuloides)树经工程化以表现出形成层发育期间升高的细胞分裂素信号传导。为了刺激 生物合成，使用了来自拟南芥属的编码细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶的AtIPT7基 因。该AtIPT7基因在形成层特异性的PttLMX5启动子(Love et al.2009)下表达，其在形成 层和发育的木质部细胞中表现出高表达。
[0140] 获得了具有LMX5: :IPT7构建体的几种单独的转基因品系，显示可检测的AtIPT7表 达。在未转化的品系中没有检测到AtIPT7表达。选择了具有高转基因表达水平的两个品系 (AtIPT7 1和3)用于进一步分析。
[0141] 实施例2
[0142] 转基因品系中加速的树干径向生长
[0143] 为了评价AtIPT7活性对树发育的影响，在温室条件下研究了转基因树的生长动力 学（图5六）。？11?5::4??17品系的顶端生长速率与野生型植物相似;该转基因植物具有与相 同龄的对照相同的高度(图5A)。相反，与WT树相比，转基因树中树干的直径增加。分别地，树 干积材(其计算为没有树叶的节间的附加体积(additive volume of internodes))比WT树 的树干积材更大（图5B)。
[0144] 图5A示出了三个月龄的WT和pLMX5-IPT7品系1和3杨属树的表型。所有的树具有相 似的高度。
[0145] 图5B示出了与WT相比，转基因 pLMX5-IPT7杨属品系1和3的树干体积（trunk volume)。与WT相比，转基因品系的总树干体积增加。数值从每个品系的五个单独的树取平 均值（土 SD)。
[0146] 实施例3
[0147] 转基因品系的增强的细胞分裂素反应性
[0148] 为了评价形成层AtIPT7表达对于细胞分裂素信号传导的影响，测试了转基因树的 细胞分裂素反应性。在经典的细胞分裂素反应性测定(Skoog&Mi 1 ler 1957)中，低的细胞分 裂素比生长素比率诱导从植物段的根再生，而高的细胞分裂素比生长素比率转而促进芽再 生。在该测定中，从温室种植的转基因和WT品系切下芽段，然后在具有不同浓度的反式玉米 素 (trans-zeatin)(tZ)的培养基上在体外条件下培养。
[0149] 在该测定中，大多数来自IPT7品系的茎段即使在0.5mg/l tZ浓度中也产生芽，而 只有很少的WT样品能够这样(图5C)。该结果表明转基因品系表现出细胞分裂素信号传导的 升高的基础水平，因为即使是中等浓度的应用的细胞分裂素能诱导芽产生;一种典型的细 胞分裂素反应表型。另外，该转基因品系在具有〇mg/l tZ的培养基上产生根。由于生长素， 与细胞分裂素一起，促进根的形成，该结果表明这些品系可能比对照树具有更多的细胞分 裂素和生长素两者。
[0150]图5C描绘了 WT和pLMX5-IPT7品系的细胞分裂素反应性测定。茎段在具有0.5mg/L 生长素（IAA)和0，0.5或1.5mg/L的细胞分裂素 t-玉米素的培养基上生长。在低细胞分裂素 浓度下(〇.5mg/L)，转基因品系已经再生芽，而WT要求更高（1.5mg)浓度的该激素。
[0151] 实施例4
[0152] 转基因树中增强的形成层细胞分裂素信号水平传导
[0153] 研究了转基因树中形成层细胞分裂素信号传导的状态。分析了两种细胞分裂素标 志物基因的表达水平。两种标志物基因用于评价细胞分裂素信号传导水平:细胞分裂素受 体PttHK3a和A型反应调节子PttRR7。通过生长素信号传导标志物基因（PttIAA3)研究了生 长素信号传导的水平。PttRR7代表了细胞分裂素磷酸接力(phosphorelay)的初级反应基 因：A型反应调苄基因的表达由细胞分裂素信号传导上调：该基因的表达水平反映了分析的 树中发生的细胞分裂素反应的水平。在IPT7品系中，细胞分裂素受体PttHK3a的表达与WT树 中基本相同，而PttRR7和PttIAA3的表达水平升高（图OT)。
[0154] 图?描绘了WT和pLMX5-IPT7品系1树干中细胞分裂素受体(PttHK3a)，细胞分裂素 信号初级反应基因(A型RR PttRR7)和生长素信号标志物基因（PttIAA3)的表达。与WT相比， PttRR7和PttIAA3的表达水平上升，而PttHK3a的表达不受影响。通过qRT-PCR分析了每个品 系两个独立的树木(误差线=SD)。
[0155] 该结果表明通过升高的CK浓度，细胞分裂素和生长素信号的水平成功地提高，而 细胞分裂素感知的能力没有改变。
[0156] 实施例5
[0157] 转基因树中增加的形成层细胞分裂数量
[0158] 为了研究升高的细胞分裂素信号传导对维管结构的影响，分析了转基因树的形成 层解剖结构。在横截面中限定了分生组织的未分化的形成层细胞为小的且扁平的薄壁细 胞，定位于分化中的木质部和韧皮部细胞之间的形成层细胞队列中。首先分化的木质部和 韧皮部细胞定义为具有较大和较圆的大小。在IPT7树中，维管形成层在形成层细胞队列中 比WT树含有更多的分生组织细胞(24对15)(图6A-B)。基于增加的细胞数量，可以得出结论 与WT相比形成层细胞队列经历了额外的细胞分裂。
[0159] 此外，研究了是否除了刺激细胞分裂速率之外，升高的细胞分裂素信号传导也影 响产生的木质部细胞的形态学。要了解这一点，在浸渍的树干样品中分析了木质部细胞、维 管和纤维的尺寸。与WT树相比，IPT7树中的木质部细胞的长度和宽度没有显著差异。
[0160] 实施例6
[0161]升高的细胞分裂素信号传导影响形成层生长素信号传导域
[0162] 接下来，研究了形成层分生组织的激素调节如何对升高的细胞分裂素浓度反应。 为了研究这个，通过激素浓度和标志物基因表达研究对形成层激素信号传导动力学进行概 况分析。在转基因树中，生物活性的iP和tZ的浓度高几乎30%，而IAA和cZOG浓度翻倍。值得 注意的是，在WT和转基因品系之间，细胞分裂素分布概况大体相似，而生长素分布的形状不 同。转基因树具有较宽范围的高生长素浓度:IAA水平在发育的木质部和木质部细胞中比在 WT中高。
[0163] 为了将激素概况与信号传导模式相连，表征了整个形成层区间的生长素和细胞分 裂素信号传导标志物基因的表达模式。使用PttRR7作为细胞分裂素的标志物，并且使用 PttIAA3作为生长素信号传导的标志物。与激素浓度研究相似，分析了代表韧皮部，发育韧 皮部，形成层，发育木质部和木质部的冷冻切片。PttSUC2和PttCOMT分别用作韧皮部和韧皮 部纤维以及木质部细胞的标志物基因，以确定切片的身份。分析了两棵野生型树和两棵 IPT7树。在转基因和WT树两者中，RR7表达在发育的韧皮部组织中达到峰值，在那里韧皮部 标志物PtSUC2也具有高表达（图6)。形成层，其中韧皮部和木质部标志物具有低表达水平， 表现出高IAA3和上升的RR7表达水平。发育的木质部组织具有高IAA3和上升的C0MT表达，而 在成熟的木质部中仅木质部标志物的表达较高。
[0164] 当将WT和转基因树比较时，可以看到IPT7树具有较宽区域的高生长素信号传导。 与WT树相比，形成层(其是高IAA3和RR7表达的区域），以及发育的木质部(高IAA3和中等RR7 表达的区域)组织在转基因品系中更大（图6)。生长素信号传导的扩宽区域与分生组织细胞 数量的增加一致。
[0165] 图6中示出了WT(A)和转基因杨属品系pLMX5: : IPT7品系1树干(B)的形成层解剖结 构，激素含量和激素信号传导概况。在IPT7树中，维管形成层在形成层细胞队列中含有比WT 树中更多的分生组织细胞(24对15)。收集了四个部分(A-D)用于激素分析。在WT中，第4个部 分代表完全发育的木质部细胞，而在PLMX5: : IPT7中，其仍然含有发育中的木质部细胞，表 明形成层分生组织区在PLMX5: : IPT7树干中比在WT中更宽。
[0166] 在四个形成层部分(A-D)中分析了生长素（IAA)和生物活性细胞分裂素（iP和tZ) 连同细胞分裂素贮存形式(cZOG)的激素概况。在转基因树中生物活性的细胞分裂素 iP和tZ 的浓度高几乎30%，而IAA和cZOG浓度翻倍。值得注意的是，在WT和转基因品系之间，细胞分 裂素分布概况大体相似，而生长素分布的形状不同。转基因树具有高生长素浓度的较宽区 域(通过灰色阴影突出显示）。
[0167]为了将激素概况和信号传导区域相关，通过在来自韧皮部（1)到木质部（14)组织 的14个冷冻切片中的qRT-PCR分析了标志物基因的表达模式。图下方的字母表示了四个激 素分析部分(A-D)的位置用作韧皮部标志物，细胞分裂素初级反应基因 PttRR7作 为CK信号传导标志物，PttIAA3作为生长素信号传导标志物，和PttC0MT2作为韧皮部纤维和 木质部身份标志物。基于PttRR7表达，细胞分裂素信号传导水平在pLMX5: :IPT7树中升高。 取而代之，高细胞分裂素浓度区域(WT和pLMX5: :ΙΡΤ7两者中部分3-7)的宽度没有被影响。 相反，具有高生长素标志物基因表达和降低的细胞分裂素标志物基因表达的形成层区域 (WT部分5-7对pLMX5: :ΙΡΤ7部分5-11)在转基因品系中比WT树木中更宽（3对7个部分）。在WT 中转基因 AtIPT7表达的水平在检测极限以下，而在pLMX5: :ΙΡΤ7树的形成层带处具有高表 达。
[0168] 参考文献
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【主权项】
1. 一种遗传构建体，其包含与第二核酸序列（启动子)可操作连接的编码酶细胞分裂素 生物合成异戊烯基转移酶的第一核酸序列（效应器），所述第二核酸序列允许所述第一核酸 序列在形成层细胞中表达，所述第一核酸序列为选自下组： a) 包含SEQ ID NO: 1的核酸序列； b) 编码SEQ ID NO:2的核酸序列； c) 编码包含保守域区域A、B和/或C的氨基酸序列的核酸序列，所述保守域区域A、B和/ 或C具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID N0:3、4和5; d) 编码包含区域D的氨基酸序列的核酸序列，所述区域D与氨基酸序列SEQ ID N0:6具 有至少80 %同一性； e) 编码与SEQ ID N0:2显示至少80%同一性的氨基酸序列的核酸序列;和 f) 编码酶的核酸序列，所述酶属于酶类EC 2.5.1.27。2. 根据权利要求1的遗传构建体，其中所述第一核酸序列编码腺苷磷酸-异戊烯基转移 酶7，IPT7。3. 根据权利要求1或2的遗传构建体，其中所述第一核酸序列来源于拟南芥属 (Arabidopsis)04. 根据权利要求1-3中任一项的遗传构建体，其中所述第二核酸序列是桦树分生组织 启动子pBpCREl，优选通过SEQIDN0 :7限定。5. 根据权利要求1至4中任一项的遗传构建体，其中所述第二核酸序列是形成层特异性 启动子。6. 根据权利要求5的遗传构建体，其中所述启动子是杨属(Populus)形成层特异性启动 子PLM5,优选通过SEQ ID NO:8限定。7. -种载体，其包含根据权利要求1至6中任一项的遗传构建体。8. -种树，其特征在于它在形成层细胞中 (a) 过表达内源性核酸序列，或 (b) 表达外源性核酸序列， 所述内源性核酸序列和外源性核酸序列编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移酶。9. 根据权利要求8的树，其中所述树表达根据权利要求1至6中任一项的遗传构建体或 权利要求7的载体。10. 根据权利要求8或9的树，其中与WT树相比，所述树在形成层发育期间在形成层细胞 中表达高至少40%，优选至少50%水平的细胞分裂素信号传导。11. 根据权利要求8至10中任一项的树，其中与WT树相比，所述树中的树干积材生长高 至少35%，优选高至少40%。12. 根据权利要求8至11中任一项的树，其中所述树属于被子植物。13. 根据权利要求12的树，其中所述树选自下组:桦木属，杨属，和桉属，优选杨属。14. 根据权利要求8至13中任一项的树，其中所述树属于裸子植物。15. 根据权利要求14的树，其中所述树选自下组:云杉和松树。16. 从如权利要求8至15中任一项限定的树可获得的木材产品。17. -种用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物与野生型植物相比有增加的生 物量生产和/或增加的树干积材生长的能力，所述方法包括以下步骤 -向树细胞导入可操作地连接到允许在形成层细胞中表达的启动子的编码酶细胞分裂 素生物合成异戊烯基转移酶的核酸序列， -培养所述细胞以形成细胞培养物， -将所述细胞培养物再生为植物，其中所述编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移 酶的核酸序列在形成层发育期间在形成层细胞中表达。18.-种用于改进树中生物量生产和/或增加的树干积材生长的方法，其包括以下步骤 -向树细胞导入可操作地连接到允许在形成层细胞中表达的启动子的编码酶细胞分裂 素生物合成异戊烯基转移酶的核酸序列， -培养所述细胞以形成细胞培养物， -将所述细胞培养物再生为植物，其中所述编码酶细胞分裂素生物合成异戊烯基转移 酶的基因在形成层发育期间在形成层细胞中表达， -允许所述植物生长为成年树，其具有与野生型树相比增强的径向生长。
【文档编号】A01H7/00GK105916988SQ201480071586
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年12月29日
【发明人】J.伊曼嫩, Y.赫拉里乌塔, K.尼米嫩
【申请人】斯道拉恩索公司