一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，包括以下步骤：S01，富集：采用孔径小于单细胞微囊藻直径的浮游植物网过滤定量水体，得总藻液；S02，总微囊藻样品的制备：取定量的所述总藻液，超声；S03，单细胞微囊藻样品的制备：另取定量的所述总藻液，过孔径大于所述单细胞微囊藻直径且小于10μm滤网；S04，检测：分别取所述总微囊藻样品和单细胞微囊藻样品，通过流式细胞仪；S05，群体微囊藻生物量C3的计算。本发明提供的一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，能够富集水体中单细胞和群体形态的微囊藻，通过流式细胞仪快速鉴别微囊藻，能够反应水体微囊藻生物量的动态变化及其存在的形态。
【专利说明】
一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，属于资源环境技术领域。【背景技术】
[0002]在湖泊水库中，蓝藻水华主要以微囊藻水华为主。微囊藻单细胞会在生长过程中形成群体。夏秋季生物量达到足够浓度，并且微囊藻群体克服扰动上升至水面，就会形成肉眼可见的水华现象。冬季微囊藻群体分散成单细胞和小群体形态，存活的单细胞和小群体形态的藻类则作为来年微囊藻水华的种源。为预测、了解和防治微囊藻水华现象，必须对全年微囊藻的生物量及在水体赋存形态进行监测。
[0003]通常，生物量的富集多采用64WI1浮游植物网富集水体中的藻类，这样会漏去单细胞及小群体形态的微囊藻。而通过过滤湖水富集藻细胞提取色素表征生物量的方法，会因不同环境下藻色素相对浓度不同，测量结果存在差异。因此，现有的检索结果中不含单细胞及小群体形态的微囊藻的生物量，故检测结果偏低，不能真实反应水体中的微囊藻的生物量及其在水体中的赋存形态。所以目前缺少富集单细胞微囊藻的方法，而且目前在富集浮游藻类时会带入泥沙颗粒，造成显微镜下计数和识别单细胞藻类比较困难。因而研发相应的浮游植物网富集微囊藻细胞并建立测定其单细胞和群体生物量方法就显得迫切需要。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够富集单细胞微囊藻，并且可快速获得单细胞微囊藻生物量和群体微囊藻生物量的方法，该法步骤简单，操作简便，检测成本低，检测结果准确;进一步地，本发明提供一种单细胞微囊藻分散效果好的富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:
[0006]—种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0007]S01，富集:采用孔径小于单细胞微囊藻直径的浮游植物网过滤定量水体，得总藻液；
[0008]S02,总微囊藻样品的制备:取定量的所述总藻液，超声，得总微囊藻样品；
[0009]S03,单细胞微囊藻样品的制备:另取定量的所述总藻液，过孔径大于所述单细胞微囊藻直径且小于10M1滤网，滤液即为单细胞微囊藻样品；
[0010]S04,检测:分别取所述总微囊藻样品和单细胞微囊藻样品，通过流式细胞仪，检测，得总微囊藻生物量&和单细胞微囊藻生物量C2 ;[0011 ]S05，群体微囊藻生物量C3的计算:C3 = CrC2。
[0012]所述浮游植物网的孔径为3mi;所述浮游植物网的材质为尼龙滤布。
[0013]所述浮游植物网的制作方法为:将正方形的所述尼龙滤布相邻两边折叠至少2次后缝合制成漏斗状，顶端用钢圈固定，下部装配收集器。
[0014]富集过程中，需反复冲洗所述浮游植物网的网衣外侧，所述网衣内部为所述总藻液。
[0015]富集得到的所述总藻液，储存在-4°C黑暗下，在24h内通过所述流式细胞仪测定Ci 和C2〇
[0016] 超声条件为:在35HZ，45W条件下超声0 ? 5?1 ? 5min。
[0017]所述超声条件为:在35HZ，45W条件下超声lmin。
[0018]所述滤网的孔径为10M1;所述滤网的材质为纱絹。
[0019]收集器为一个收集管，浮游植物网的底端设置有出液孔，出液孔与收集管的内壁紧密相连，收集管是来收集藻液的，收集管上设置有开关，打开收集管的开关，藻液会流出来，然后装到样品管里。钢圈是起支撑作用，支撑网衣不会发生变形。
[0020]本发明的有益效果为:本发明能够富集水体中单细胞和群体形态的微囊藻，获得足够藻浓度，并且经过简单的预处理，通过流式细胞仪快速鉴别微囊藻，对单细胞微囊藻和群体微囊藻生物量准确计数，能够反应水体微囊藻生物量的动态变化及其存在的形态。【附图说明】
[0021]图1为本发明的富集及检测流程图；
[0022]图2为本发明超声条件的优化图；[〇〇23]图3为本发明的检测结果图。【具体实施方式】[〇〇24]下面结合附图对本发明作更进一步的说明。[〇〇25] 实施例1:
[0026]如图1?图3所示，一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，包括下列步骤:[〇〇27] 1.浮游植物网的制作及采样:
[0028]由于单细胞微囊藻粒径在3?5mi，因此本实施例采用3mi的尼龙滤布，考虑到尼龙滤布网孔较细，尽量少剪裁，因此将滤布裁剪成正方形，将正方形相邻两边折叠至少2次后用细布包裹缝制成漏斗状，顶端用钢圈固定，下部配收集器。制好的浮游植物网应注意缝隙处不出现漏藻。[〇〇29] 2.浮游藻类的富集、转移和保存:[〇〇3〇]在水体中应用浮游植物网富集藻类时，应根据水体藻类丰度水平，用有机玻璃采水器定量采取水样富集藻液，本实施例于2016年2月25日在太湖梅梁湾区域采集5L湖水进行富集，初始富集时，在水压的作用下，湖水快速透过浮游植物网。随着压力的减小和颗粒浓度增加，过滤状态达到饱和，之后对浮游植物网外侧进行冲洗，当过滤状态再次达到饱和时，收集富集的藻液。样品应储存在_4°C，黑暗下，生物量和生理特征的分析应在24h内完成测定。[0031 ] 3.样品的预处理及微囊藻单细胞和群体生物量的测定:[〇〇32]采用35Hz，45W超声功率，配置三组不同浓度的太湖微囊藻群体做超声时间梯度试验l、2、3min，以确定水体微囊藻群体的最佳超声时间。如图2所示，Omin是用水浴振荡器在100°C下以120rad/min震荡5min处理后镜检计数，l、2、3min是经超声处理后的样品进行镜检计数。结果显示，在35Hz，45W，超声lmin，不同浓度的藻群体分散成单细胞效果最佳。 [〇〇33]流式细胞仪只能通过小于10M的颗粒。需要将富集的藻样取10mL经超声处理，将群体微囊藻分散成单细胞形态，获得总微囊藻生物量。另取10mL藻样过lOwii纱絹，获得单细胞藻类。由总微囊藻生物量减去单细胞微囊藻生物量可以得到群体微囊藻生物量。[0〇34]流式细胞仪分析:采用美国贝克曼公司的cytoflex型号的流式细胞仪。依据叶绿素FL3(690/50nm)和藻蓝素FL4(660/20nm)荧光通道鉴别微囊藻。样品检测时间范围3-7min〇
[0035]如图3所示，流式细胞仪根据藻蓝素和叶绿素的荧光差异区分不同藻类并计数，而微囊藻的藻蓝素荧光信号要高于其他细胞群，易于识别。[〇〇36] 实施例2:
[0037]如图1?图3所示，一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，包括下列步骤:[〇〇38]1.浮游植物网的制作及采样:
[0039]由于单细胞微囊藻粒径在3?5mi，因此本实施例采用2.5wii的尼龙滤布，考虑到尼龙滤布网孔较细，尽量少剪裁，因此将滤布裁剪成正方形，将正方形相邻两边折叠2次后用细布包裹缝制成漏斗状，顶端用钢圈固定，下部配收集器。制好的浮游植物网应注意缝隙处不出现漏藻。
[0040]2.浮游藻类的富集、转移和保存:
[0041]在水体中应用浮游植物网富集藻类时，应根据水体藻类丰度水平，用有机玻璃采水器定量采取水样富集藻液，本实施例于2016年2月25日在太湖梅梁湾区域采集5L湖水进行富集，初始富集时，在水压的作用下，湖水快速透过浮游植物网。随着压力的减小和颗粒浓度增加，过滤状态达到饱和，之后对浮游植物网外侧进行冲洗，当过滤状态再次达到饱和时，再次对浮游植物网外侧进行冲洗，当滤状态第三次达到饱和时，收集富集的藻液，得总藻液。总藻液样品应储存在_4°C，黑暗下，生物量和生理特征的分析应在24h内完成测定。 [〇〇42]3.样品的预处理及微囊藻单细胞和群体生物量的测定:[〇〇43] 流式细胞仪只能通过小于10M1的颗粒。需要将富集的总藻液取10mL经超声处理， 超声条件为采用35Hz，45W超声功率，超声0.5min，将群体微囊藻分散成单细胞形态，获得总微囊藻生物量。另取10mL总藻液过lOym纱絹，获得单细胞微囊藻类。由总微囊藻生物量减去单细胞微囊藻生物量可以得到群体微囊藻生物量。
[0044]流式细胞仪分析:采用美国贝克曼公司的cytoflex型号的流式细胞仪。依据叶绿素FL3(690/50nm)和藻蓝素FL4(660/20nm)荧光通道鉴别微囊藻。样品检测时间范围3-7min〇
[0045]如图3所示，流式细胞仪根据藻蓝素和叶绿素的荧光差异区分不同藻类并计数，而微囊藻的藻蓝素荧光信号要高于其他细胞群，易于识别。[〇〇46] 实施例3:
[0047]如图1?图3所示，一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，包括下列步骤:[〇〇48]1.浮游植物网的制作及采样:
[0049]由于单细胞微囊藻粒径在3?5μπι，因此本实施例采用2.Ομπι的尼龙滤布，考虑到尼龙滤布网孔较细，尽量少剪裁，因此将滤布裁剪成正方形，将正方形相邻两边折叠2次后用细布包裹缝制成漏斗状，顶端用钢圈固定，下部配收集器。制好的浮游植物网应注意缝隙处不出现漏藻。
[0050]2.浮游藻类的富集、转移和保存:
[0051]在水体中应用浮游植物网富集藻类时，应根据水体藻类丰度水平，用有机玻璃采水器定量采取水样富集藻液，本实施例于2016年2月25日在太湖梅梁湾区域采集5L湖水进行富集，初始富集时，在水压的作用下，湖水快速透过浮游植物网。随着压力的减小和颗粒浓度增加，过滤状态达到饱和，之后对浮游植物网外侧进行冲洗，当过滤状态再次达到饱和时，收集富集的藻液，得总藻液。总藻液样品应储存在-4°C，黑暗下，生物量和生理特征的分析应在24h内完成测定。
[0052]3.样品的预处理及微囊藻单细胞和群体生物量的测定:
[0053]流式细胞仪只能通过小于ΙΟμπι的颗粒。需要将富集的总藻液取1mL经超声处理，超声条件为采用35Hz，45W超声功率，超声1.5min，将群体微囊藻分散成单细胞形态，获得总微囊藻生物量。另取1mL总藻液过1ym纱絹，获得单细胞微囊藻类。由总微囊藻生物量减去单细胞微囊藻生物量可以得到群体微囊藻生物量。
[0054]流式细胞仪分析:采用美国贝克曼公司的cytoflex型号的流式细胞仪。依据叶绿素FL3(690/50nm)和藻蓝素FL4(660/20nm)荧光通道鉴别微囊藻。样品检测时间范围3-7min0
[0055]如图3所示，流式细胞仪根据藻蓝素和叶绿素的荧光差异区分不同藻类并计数，而微囊藻的藻蓝素荧光信号要高于其他细胞群，易于识别。
[0056]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，其特征在于，包括以下步骤:so 1，富集:采用孔径小于单细胞微囊藻直径的浮游植物网过滤定量水体，得总藻液；S02，总微囊藻样品的制备:取定量的所述总藻液，超声，得总微囊藻样品；S03,单细胞微囊藻样品的制备:另取定量的所述总藻液，过孔径大于所述单细胞微囊 藻直径且小于10M1滤网，滤液即为单细胞微囊藻样品；S04，检测:分别取所述总微囊藻样品和单细胞微囊藻样品，通过流式细胞仪，检测，得 总微囊藻生物量Ci和单细胞微囊藻生物量C2;S05，群体微囊藻生物量C3的计算:C3 = &-C2。2.根据权利要求1所述的一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，其特征 在于:所述浮游植物网的孔径为3mi ;所述浮游植物网的材质为尼龙滤布。3.根据权利要求2所述的一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，其特征 在于:所述浮游植物网的制作方法为:将正方形的所述尼龙滤布相邻两边折叠至少2次后缝 合制成漏斗状，顶端用钢圈固定，下部装配收集器。4.根据权利要求1所述的一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，其特征 在于:富集过程中，需反复冲洗所述浮游植物网的网衣外侧，所述网衣内部为所述总藻液。5.根据权利要求1所述的一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，其特征 在于:富集得到的所述总藻液，储存在-4°C黑暗下，在24h内通过所述流式细胞仪测定(^和 C2〇6.根据权利要求1所述的一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，其特征 在于:超声条件为:在35HZ，45W条件下超声0.5?1.5min。7.根据权利要求1所述的一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，其特征 在于:所述超声条件为:在35HZ，45W条件下超声lmin。8.根据权利要求1所述的一种富集及检测微囊藻单细胞和群体生物量的方法，其特征 在于:所述滤网的孔径为10M1;所述滤网的材质为纱絹。
【文档编号】G01N15/14GK106018245SQ201610338453
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】朱伟, 周小华, 陈怀民, 吴思麟, 赵鸿茹, 徐锋, 陈程, 谭啸
【申请人】河海大学