一种柳枝稷SBP-box类转录因子在增加植物生物量和可发酵糖产量方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及柳枝稷SBP-box类转录调控因子PvSPLl和2及其编码基因的改造，提高柳枝稷生物量及其可发酵糖产量。
【背景技术】
[0002]化石能源的过度消耗使得新能源开发成为必要。其中，生物质能具有资源丰富、环保清洁且可再生等特点。目前的研究多集中于生物柴油和生物乙醇两大类，其中，生物乙醇的开发利用已逐步实现商业化。柳枝稷(Panicum virgatum L.)属多年生C4高大草本植物，主要用作能源草和牧草，是重要的纤维生物质资源。增加柳枝稷生物量和可发酵糖产量是提高其生物质能开发利用的重要手段。柳枝稷全基因组测序的完成和表达芯片数据库的公布，为功能基因的挖掘和验证提供了资源保证。
[0003]SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-1ike(SPL)转录因子含有一个保守的SBP-box核心结构域，是一类植物特异的转录调控因子家族。另外，超过1/2的SBP-box家族基因含有miR156的靶位点，在转录后水平上受到miR156的严格调控。因此超表达miR156之后，含miR156靶位点的SPL基因表达量会显著降低。目前的研究表明，SPL基因功能广泛，参与植物生长发育的各个阶段以及生理生化反应的多个途径，主要涉及植物花期调控、分蘖发生、株型建成和生物/非生物胁迫响应等过程。植物中最早鉴定出的SPL基因是从金鱼草中分离出的SBPl和SBP2基因(Klein et al, A new family of DNA-binding proteins includesputative transcript1nal regulators of the Antirrhinum majus floral meristemidentity gene SQUAMOSA.1996，Molecular and General Genetics, 259: 7_16)D拟南芥和水稻中分别含有17和19个SPL基因，其中含miR156靶位点的均有11个基因。目前研究较为深入的是SPL基因调控开花时间，影响植物由营养生长时期向生殖生长时期的过渡。而对于株型建成和分蘖发生方面的研究还尚未有系统研究，AtSPL9和AtSPL15被报道与拟南芥的莲座叶增多相关(Schwarz et al，The microRNA regulated SBP-box genes SPL9 andSPL15 control shoot maturat1n in Arabidopsis.2008， Plant Molecular B1logy,67: 183-195)，0sSPL14参与水稻分蘖发生(Luo et al, Control of tiller growth ofrice by 0sSPL14 and strigolactones，which work in two independent pathways.Plant and Cell Phys1logy, 2012，53: 1793-1801)。而柳枝稷中过量表达miR156之后，分蘖数目增多、生物量和可发酵糖产量增加(Fu et al，Overexpress1n of miR156 inswitchgrass (Panicum virgatum L.) results in var1us morphologicala Iterat1ns and leads to improved b1mass product1n.2012，PlantB1technology Journal， 10: 443-452)0
[0004]通过植物基因工程改良植物生物量的研究相对较少，过量表达miR156增加植物分枝或分蘖数目是当前研究的一个热点。SPL基因作为miRNA156的直接靶基因，其调控植物分枝或分蘖的机制尚不清楚。本发明主要针对柳枝稷的PvSPLl和2基因，通过嵌合抑制子沉默技术将PvSPLl和2转变成高效的负调控子，最终实现对柳枝稷分蘖发生的调控，获得生物量和可发酵糖产量增加的转基因柳枝稷植株，这对于柳枝稷和其他禾本科植物的遗传育种和定向分子设计具有重要的指导意义。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的是提供一种柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPLl和2的编码基因；其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID N0.1、2和SEQ ID N0.3、4所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述核苷酸序列进行同义突变，也属于本发明的保护范围内。
[0006]本发明的第二个目的是提供一种针对柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPLl和2的SRDX融合片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0.5和6所示。利用此融合片段能够显著增加柳枝稷分蘖数目，以增加其生物量。
[0007]本发明的第三个目的是提供一种柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPLl和2的嵌合抑制子沉默表达载体，该表达载体克隆上述如SEQ ID N0.5和6的融合片段。
[0008]本发明的第四个目的是提供柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPLl和2在调控柳枝稷分蘖发生方面的应用。
[0009]本发明的第五个目的是提供所述的针对柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPLl和2的SRDX融合片段在增加柳枝稷生物量及可发酵糖产量方面的应用。
[0010]所述柳枝稷PvSPLl和2的SRDX融合片段，基于Gatewiy技术重组整合入超表达载体PANIC 6B中；采用农杆菌AGLl介导的遗传转化方法，将超表达载体导入柳枝稷胚性愈伤细胞中，通过潮霉素抗性筛选，获得抗性再生植株，并通过PCR分析最终确定阳性转基因植株；分蘖数目统计、生物量及可发酵糖产量测定结果表明，PvSPLl和2能够显著增加柳枝稷分蘖数目、生物量和可发酵糖产量。
[0011]本发明的核心特点和发明理念包括:
1、通过嵌合抑制子沉默技术实现对柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPLl和2的改造，使其成为高效的负调控子，能够克服由于柳枝稷中功能冗余基因的存在而造成的抑制效果不显著问题；
2、本发明针对柳枝稷分蘖数目这一影响生物量高低的主要性状，通过先进的基因工程技术对其进行调控，能够在短期内获得显著效果。
[0012]本发明的有益效果如下:
1、本发明中获得的柳枝稷SBP-box类基因PvSPLI和2，是调控柳枝稷分蘖的关键基因，这对于通过分子定向设计获得理想能源植物株型具有重要贡献；
2、本发明中对PvSPLl和2进行分子调控，能够显著增加柳枝稷的生物量和可发酵糖产量，对于能源植物和禾本科牧草的生物量和可发酵糖产量的遗传改良具有重要的参考意义；
3、本发明中所产生的遗传改良植物能够整合到常规育种项目，从而为能源植物和禾本科牧草作物的品种培育提供新的种质资源。
【附图说明】
[0013]图1柳枝稷pANIC6B-PvSPL2_SRDX融合片段的过表达载体简图；
图2转PvSPL2-SRDX基因植株的PCR鉴定。M表示DNA Marker，1-16表示转pANIC6B_PvSPL2-SRDX的柳枝稷植株，WT-表示未转基因的野生型柳枝稷植株。hph为PvSPL2-SRDX载体上携带的植物抗性筛选标记基因。
[0014]图3转PvSPL2_SRDX基因植株的qRT-PCR分析。CtrlP表示转pANIC6B空载体植株，TSPL2-1 /-2/-3分别表示三个独立的阳性转基因株系。
[0015]图4转基因阳性植株的表型(A)和分蘖数目(B)XtrlP表示转pANIC6B空载体植株，TSPL2-1 /-2/-3分别表示三个独立的阳性转基因株系。
[0016]图5转基因植株的干物质生物量测定。CtrlP表示转pANIC6B空载体植株，TSPL2-1/-2/-3分别表示三个独立的阳性转基因株系。
[0017]图6转基因植株的可发酵糖产量测定。(:壮让表示转?4犯068空载体植株33?1^2-1/-2/-3分别表示三个独立的阳性转基因株系。
【具体实施方式】
[0018]下面以针对PvSPL2的嵌合抑制子沉默增加柳枝稷分蘖数目、生物量和可发酵糖产量为实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂、双元载体和农杆菌等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购到，所述的MS基本培养基购自PhytoTechnology Laboratories(货号M519)。
[0019]实施例l:PvSPL2基因的克隆与序列测定
取低地型柳枝稷AIamo的嫩莖部位，用TriZoI Reagent( Invitrogen公司，货号15596026)提取嫩茎总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的含量和纯度，取2.0 yg总RNA做逆转录反应，所采用的逆转录酶为M-MLV(Promega公司，货号M1701)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录反应合成的第一链cDNA为模板，使用引物:
5’- ATGGGTTCATTTGGGATGGAC-3’
5，- AAGCGTCAGTGCATCAGGTCATAG-3，
进行常规 PCR 扩增；PCR 反应体系为:2 yL cDNA，5 yL 10 X Buffer，4 yL dNTP(2.5mM)，正/反向引物(10 μΜ)各I yL，0.5