一种植物多基因遗传转化的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物生物工程技术领域，具体地涉及一种植物多基因遗传转化的方法，特别是涉及一种植物多基因遗传转化的方法。
【背景技术】
[0002]以柳枝稷和芒草为代表的能源草属于C4多年生高大草本能源植物，富含木质纤维素类生物质，产量大、适应性强且不占用耕地，符合生物质能发展“不与民争粮，不与粮争地”的基本国策。当前主要能源草品种无论在种植和农田管理方面，还是在育种和遗传改良领域，都积累了大量的数据和丰富的经验。同时，能源草的适应性强，地理分布范围广。此夕卜，柳枝稷和芒草的全基因组序列已基本测定完毕，其含有的丰富基因资源亟待开发。然而面对海量的序列信息，如何通过高通量的遗传转化体系筛选获得具有潜在应用价值的基因资源，仍然是当前所面临的一个巨大挑战，因此能源草的遗传改良研究受到了世界各国科研工作者的广泛关注。然而由于能源草属于单子叶禾本科植物，像该科的大部分植物一样，能源草的遗传转化效率低且稳定性差。
[0003]与其他能源草相比较，柳枝稷既是重要的能源植物，也是传统的禾本科牧草，因此柳枝稷的遗传转化起步相对较早，研究经验相对丰富。当前建立的柳枝稷遗传转化系统的外植体主要使用幼穗、未成熟的颖果或成熟种子诱导的胚性愈伤组织。与前两者相比，柳枝稷成熟种子来源丰富，取材不受植物发育时期和生长环境的影响，而且使用成熟种子诱导的愈伤组织建立的遗传转化体系，其效率普遍高于未成熟颖果和幼穗体系。另外，先前报道的转基因柳枝稷植物大部分使用潮霉素筛选获得，少数通过双丙氨膦筛选产生，但同时使用潮霉素和双丙氨膦双抗筛选的多基因转化技术尚未建立。当前单抗筛选能够转入柳枝稷的最多外源基因的数目为3个，因此如果能够建立柳枝稷双抗筛选体系，则至少可以将外源基因的转入数目加倍，从而能够实现对柳枝稷多个重要农艺性状的综合调控和分子设计。像大多数单子植物一样，柳枝稷难于进行遗传转化。目前报道的大部分柳枝稷遗传转化体系的效率低于10%。虽有极少数柳枝稷的遗传转化体系效率超过10%，但其重复性和稳定性不强，且材料来源的遗传背景混杂。这主要是因为柳枝稷为自交不亲和植物，每一粒种子都代表一个不同的基因型，因此使用混合种子的愈伤组织，势必造成愈伤组织质量良莠不齐，不但影响遗传转化效率的稳定性，而且获得的转基因植物具有不同的基因背景，潜在影响其后续分析和应用。
[0004]迄今为止，已有28个国家在1.8亿公顷的土地上种植了不同类型的转基因作物，比1996年转基因植物首次种植时的面积增加了 100倍。过去近20年的大量研究和综合分析数据证实，转基因技术使化学农药的用量减少了 37%，作物产量增加了 22%，农民利润增加了 68%，因此转基因技术的研发和使用对粮食安全、可持续性发展和环境/气候变化做出了贡献。然而，转基因植物的商业化研发首先需要产生成千上万棵独立的转基因植株，然后对上述群体中进行千里挑一或万里挑一的筛选工作。另外，为了满足商业化生产的目的，需要对植物的多个不同性状进行综合改良和分子设计，因此为了达到转基因柳枝稷植物商业化生产和应用的目的，亟需发展高效的多基因遗传转化体系对柳枝稷多个重要农艺性状进行综合改良，从而定向培育出专用纤维生物质资源新品种，为纤维生物质液体燃料生产提供充足稳定且可高效转化的优质原料。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是提供一种植物多基因遗传转化方法，提供一种高效多基因遗传转化体系，用于植物重要经济性状的遗传改良和分子设计。
[0006]本发明是通过如下技术方案来实现的:
[0007]—种植物多基因遗传转化的方法，它的内容包括:
[0008]单一基因型尚质量尚农杆菌侵染率的胚性愈伤系的建立；
[0009]含有不同双元载体的农杆菌侵染上述愈伤系，并通过双抗筛选获得含有多个不同外源基因的转基因植物阳性植株。
[0010]进一步，所述的单一基因型高质量胚性愈伤系的外部特征为淡黄色、结构疏松且具有温润的光泽，其建立的方法包括:植物成熟种子的单一基因型愈伤系建立，高质量胚性愈伤系通过目视法筛选和愈伤系再生率评价法获得，最终获得的所有单一基因型高质量胚性愈伤系的再生率均大于90%。
[0011]进一步，所述的用于农杆菌侵染效率评价的植物愈伤组织来自上述筛选所获得多个单一基因型的高质量胚性愈伤系，其中，来自每个愈伤系中的所有细胞均具有相同的基因背景，具体方法为将含有pANIC6A双元载体农杆菌菌液与单一基因型高质量胚性愈伤系进行共孵育，选择侵染效率大于30%的愈伤系即为单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤系，然后进行继代扩繁，并用于后续的植物高效遗传转化方法的建立。
[0012]在上述技术方案的基础上，所述的农杆菌菌株为EHA105或AGLl。
[0013]进一步，所述的用于植物高效多基因遗传转化的双元载体分别含有潮霉素和双丙氨膦抗性基因，除了含有上述筛选标记基因外，适合本发明使用的质粒还含有一个或一个以上的不同目的基因。
[0014]本发明可用于在植物中过表达或RNAi抑制任何基因。目的基因可以是耐除草剂基因、细胞壁调控基因、分蘖数目决定基因、茎杆粗细控制基因、开花基因或逆境抗性基因。
[0015]本发明中所述的植物为单子叶禾本科自交不亲和植物，包括柳枝稷和芒草等能源草和禾本科牧草植物。
[0016]本发明中所述的抗性筛选试剂为潮霉素和双丙胺磷。
[0017]—种植物多基因遗传转化的方法，它具体包括植物成熟种子愈伤组织诱导、单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤组织系的获得以及农杆菌介导的多基因遗传转化步骤。
[0018]所述的植物成熟种子愈伤组织诱导，把植物的成熟种子消毒清洗后接种于愈伤组织诱导培养基上，培养箱温度25 ± 2 °C，暗培养6-7周，获得愈伤组织。
[0019]所述的单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤组织系的获得，把所获得的愈伤组织采用目视法进行筛选，选择其中淡黄色、结构疏松且具有温润的光泽的胚性愈伤组织为高质量胚性愈伤组织，将获得的高质量胚性愈伤组织分出一半愈伤组织接种到愈伤组织再生培养基培养基上，组培室温度25±2°C，光照时间每天16h光/8h暗，培养4-5周，获得再生芽，并进行再生效率的评估，然后选择再生率大于90%的愈伤系进行继代，培养箱温度25±2°C，暗培养3-4个周，然后用于农杆菌侵染效率的评估，最后选择农杆菌侵染效率大于30%的愈伤系即为单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤组织系，然后进行扩繁，培养箱温度25±2°C，暗培养，每3-4周继代一次。
[0020]所述的农杆菌介导的多基因遗传转化，把所述的扩繁的单一基因型高质量高农杆菌侵染率的胚性愈伤组织系中的愈伤组织分成小块，然后置于三通干燥皿中抽真空，使用含有不同双元载体的农杆菌菌液对所述的柳枝稷单一基因型高质量胚性愈伤组织进行共孵育，然后去除残留的农杆菌菌液，25±2°C，黑暗中共培养3天，将共培养后的愈伤组织转接于抗性愈伤组织筛选培养基MSD3HB进行筛选，培养箱温度25 ± 2°C，暗培养，每3个周转接一次，直到抗性愈伤组织长出，将获得的抗性愈伤组织转接到抗性愈伤组织筛选培养基MSK2HB上，组培室温度25±2°C，光照时间每天16h光/8h暗，每4个周转接一次，直到抗性芽长出；获得的抗性再生芽转接至生根培养基MSRHB上，组培室温度25±2°C，光照时间每天16h光/Sh暗；获得的再生苗按照常规方法移栽到土中，2周后再生苗成活。
[0021]进一步，所述的抗性愈伤组织筛选培养基MSD3HB(pH = 5.8)为MS基本培养基添加30g/L蔗糖、3mg/L2，4_D、30mg/L潮霉素、2.4mg/L双丙胺磷、400mg/L头孢塞肟钠和