7.5g/L琼脂，高压灭菌15min。
[0022]进一步，所述的抗性芽再生培养基MSK2HB (pH = 5.8)为MS基本培养基添加30g/L蔗糖、2mg/L激动素、10mg/L潮霉素、1.2mg/L双丙胺磷、400mg/L头孢塞肟钠和7.5g/L琼月旨，高压灭菌15min。
[0023]进一步，所述的抗性芽生根培养基MSRHB (pH = 5.8)为1/2MS基本培养基添加15g/L蔗糖、10mg/L潮霉素、1.2mg/L双丙胺磷、400mg/L头孢塞肟钠和7.5g/L琼脂，高压灭菌 15min。
[0024]本发明中所述的所有单一基因型高质量高农杆菌侵染率愈伤系的遗传转化效率均大于30%，其中最高的转化效率可达到60%，能够一次转入至少6个不同的外源基因，产生大于3000棵含有多个外源基因的独立的阳性转基因植株。
[0025]本发明中的基因克隆、载体构建和农杆菌侵染均可使用标准方法实现。
[0026]本发明的核心特点和发明理念包括:
[0027]I)通过单一基因型高质量胚性愈伤系的筛选和建立，富集对农杆菌侵染敏感的愈伤组织，从而克服先前使用混合种子愈伤体系所造成的大量农杆菌侵染不敏感组织对农杆菌介导的遗传转化的干扰。
[0028]2)通过简单高效的农杆菌侵染方法、抗性愈伤组织和抗性芽的双抗筛选系统，显著提高植物遗传转化效率和转基因的数量。
[0029]本发明与现有技术相比的有益效果:
[0030]I)筛选迅速:本发明中高质量胚性愈伤组织诱导于植物成熟种子，其来源丰富，能够通过目视法高通量地筛选出高质量胚性愈伤系，筛选周期为3-4个月。
[0031]2)外植体充足:本发明中筛选获得的高质量胚性愈伤系可通过继代扩繁持续保存，不受植物发育时期的影响，不但能够保证用于遗传转化的外植体材料的持续充足供应，而其极大缩短转化的周期。
[0032]3)基因型均一:使用的每一个高质量胚性愈伤系均产生于相对应的一粒种子，因此每个愈伤系中的愈伤细胞具有相同的基因型，从而保证所产生的转基因植物具有相同的基因背景，利于转基因植物的后续研发。
[0033]4)转化效率高:本发明通过首先对单一基因型高质量高农杆菌侵染率愈伤系进行筛选，筛选出的单一基因型高质量高农杆菌侵染率愈伤系进行后续的遗传转化，产生阳性转基因植物的遗传转化效率大于30 %，其中转化率最高的能够达到60 %，而从愈伤组织的农杆菌侵染到转基因植物温室移栽仅需要4-5个月，从而能够实现每人每年转化200个基因载体，产生大于3000棵含有多个不同外源基因的独立的阳性转基因植株。
[0034]5)可转化基因数量多:本发明的方法首次使用潮霉素和双丙胺磷双抗筛选，能够在现有基因转化的数量上迅速实现基因数目的加倍，实现至少6个不同外源基因的一次性转化，因此本发明不仅可以对植物的多个重要性状实现综合改良，还可以对某一特定代谢途径的多个关键基因同时进行分子调控，从而获得先前难以得到的新性状和新品质。
【附图说明】
[0035]图1:实施例1中柳枝稷成熟种子诱导的单一基因型高质量胚性愈伤系外部形态特征。
[0036]图2:实施例1和2中用于柳枝稷农杆菌侵染效率评估和多基因遗传转化的双元载体T-DNA简图。A.pANIC6A双元载体含有红色荧光蛋白基因(RFP)，可用于显微镜观察评估柳枝稷单一基因型高质量胚性愈伤系的农杆菌侵染效率pANDA-PvCOMTRi双元载体含有潮霉素抗性基因(hph) ;C.pANIC6E-0smiR1560E双元载体含有除草剂双丙胺磷抗性基因(bar) ;B.和C.双元载体分别携带不同的植物抗性筛选基因，可用于柳枝稷多基因遗传转化体系的建立；
[0037]图3:实施例2中农杆菌介导的柳枝稷遗传转化过程。A.源自柳枝稷成熟种子的单一基因型高质量高农杆菌侵染效率胚性愈伤组织；B.农杆菌侵染后的愈伤组织共培养；C.抗性愈伤组织生长在潮霉素和双丙胺磷筛选培养基上；D.潮霉素和双丙胺磷筛选的抗性芽；E.生根培养基上生长的抗性苗；F.温室生长的转基因柳枝稷植物；G.阳性转基因柳枝稷植物叶片和茎段的⑶S染色鉴定。
[0038]图4:实施例2中含有多个外源基因的转基因柳枝稷植物的PCR鉴定。A:PCR鉴定双转化的转基因柳枝稷植株中hph、COMT-RNAi和nptll基因的存在；B:A:PCR鉴定双转化的转基因柳枝稷植株中bar、gus-plus和0SmiR156基因的存在；M:DNA Marker ；1-10:双转化的柳枝稷植株；Ck-:未转基因的野生型柳枝稷植物；CK+:pANDA-PvCOMTRi和pANIC6E-0smiR1560E 双元载体。
【具体实施方式】
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[0039]下面以柳枝稷单一基因型高质量高农杆菌侵染效率胚性愈伤系的建立为实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂、双元载体和农杆菌等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购到，所述的MS基本培养基购自PhytoTechnology Laboratories (货号:M519)。
[0040]实施例1:柳枝稷单一基因型高质量高农杆菌侵染效率胚性愈伤系的建立，其包括以下步骤:
[0041]I)将柳枝稷的成熟种子用3% (W/V)次氯酸钙消毒2小时后，使用无菌蒸馏水清洗3次(每次5分钟)，然后置于4°C冰箱过夜，次日继续使用5% (W/V)次氯酸钙消毒1.5小时，然后使用无菌蒸馏水清洗3次(每次5分钟)，接种于愈伤组织诱导培养基(MSD5)上，并对每一颗种子进行编号，培养箱温度25 ± 2 °C，暗培养6-7周，获得愈伤组织。
[0042]2)将步骤(I)所获得的愈伤组织采用目视法进行筛选，根据愈伤组织的形态和软硬程度进行分类，并选择其中淡黄色、结构疏松且具有温润的光泽的胚性愈伤组织(图1)，进行后续步骤的筛选；
[0043]3)将步骤(2)所获得的高质量胚性愈伤组织(编号与相对应的种子编号一致)分出一半愈伤组织接种到MSK2培养基上，组培室温度25±2°C，光照时间每天16h光/8h暗，培养4-5周，获得再生芽(编号与相对应的种子编号一致)，并进行再生效率的评估，最终选择再生率在90%以上的胚性愈伤系进行后续步骤的筛选；
[0044]4)对步骤(3)所获得的高质量高再生率(>90% )的胚性愈伤组织系进行扩繁，每个独立的愈伤系扩繁10盘，培养箱温度25±2°C，暗培养，每3-4周继代一次；
[0045]5)将-80°C下保存的含有pANIC6A双元载体(图2A)的根癌农杆菌AGLl划线接种于LB添加50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的固体培养基上，28°C过夜培养，然后挑取单菌落接种于LB添加50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的液体培养基中，28°C摇床(200rpm)过夜培养至0D_达到0.6，然后添加乙酰丁香酮至终浓度为200 ymol/L，继续培养2h至OD6。。达到0.8-1.0，3500rpm，20°C离心15min收集农杆菌菌体沉淀，并使用MSD3液体培养基重悬菌体，调整OD6。。至0.3。
[0046]6)使用步骤(5)中制备的农杆菌菌液对步骤⑷中所获得的柳枝稷单一基因型高质量胚性愈伤系进行共孵育lOmin，其中愈伤组织先于农杆菌孵育前用灭菌的镊子均匀分成l-2cm的小块，然后置于三通干燥皿中抽真空10分钟，接着共孵育10分钟，然后使用无菌滤纸去除残留的农杆菌菌液，25±2°C，黑暗中共培养3天。
[0047]7)对步骤￠)中共培养3天后的愈伤组织，通过荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(RFP)信号的有无统计侵染效率，选择效率大于