一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，属于分子标记技术领域。
【背景技术】
[0002] 克氏原螯奸(Procambarus clarkii)，在民间俗称小龙奸，也叫淡水小龙奸或者红 螯虾，属于十足目、鳌虾科、原螯虾属，是生活于淡水中一种像龙虾的背上长有坚硬的外壳 的动物，生存能力非常顽强，原产于南美洲和墨西哥北部，现在克氏原螯虾已成为我国重要 的淡水经济养殖动物，在野外主要分布在小河、湖泊和小沟渠内。
[0003] 亲子鉴定技术是指在医学上或者在生产中利用原理和技术进行区分父子之间是 否有争议和亲缘关系远近的判定。亲子鉴定在水产动物的科学研究和生产中应用越来越广 泛，如斑节对虾、大菱鲆、太平洋牡蛎、大西洋鲑。但是目前还没有鉴定克氏原鳌虾亲子关系 的有效方法。传统的亲子关系鉴别方法是家系之间分开饲养或者在眼柄上做上标记，这两 种方法不但费钱费力而且在眼柄上做标记会直接影响到克氏原鳌虾的生长。正因为没有快 速有效的鉴别克氏原鳌虾亲子关系的方法，随着养殖业的快速发展，集约化程度也随着提 高，就会产生近亲繁殖和回交的现象，近几年克氏原鳌虾的品质出现了严重退化的现象，因 此建立一种克氏原鳌虾的亲子关系判定方法具有极其重要的理论和生产意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，有助于快速准确的鉴 别不同家系的克氏原螯虾，有效防止近亲繁殖，在克氏原螯虾的选育和遗传保护方面提供 极大的理论依据。
[0005] 技术方案：
[0006] -种鉴别克氏原螯虾不同家系所用的扩增引物，该引物包括10对特异的微卫星引 物，具体序列表如下：
[0007]
[0008] 0 [0009] 一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，包括以下步骤：
[0010 ] (1)从待测的克氏原螯虾个体尾部肌肉中提取DNA;
[0011] (2)以步骤(1)得到的DNA为模板，分别用权利要求1所述的10对引物进行PCR扩增， 得到扩增产物；
[0012] (3)对步骤(2)得到的扩增产物使用聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染；
[0013] (4)对步骤(3)的银染结果通过遗传分析软件进行分析，测量每个个体之间的遗传 距离，根据遗传距离绘制UPGMA聚类分析图，根据聚类结果区分不同氏原螯虾家系的个体。
[0014] 所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，步骤（2)中PCR扩增的反应体系可以为 15ul :Mg离子 1 · 5ul、bufferl · 5ul、4xdNTP 0 · 5ul、一对引物各0 · 5ul、Taq酶0 · 2ul、DNA2ul、 超纯水8.3ul。
[0015] 所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，步骤(2)中PCR扩增反应程序可以为:第 一个程序为95摄氏度预变性2分钟，第二个程序循环35次，程序为95摄氏度变性30秒，退火 温度30秒，72摄氏度延伸1分钟，第三个程序为72摄氏度延伸10分钟，第四个程序为4摄氏度 保存。
[0016] 所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，步骤(3)中PCR产物可以用12%的聚丙烯 酰胺胶进行电泳和银染。
[0017] 所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，步骤(4)中所述的遗传分析软件可以为 population 软件。
[0018] 有益效果：
[0019] 运用本技术，可以有效地将混杂的不同家系的克氏原螯虾的个体区别开来，有助 于防止近亲繁殖和选育。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例1中根据个体之间的遗传距离画出的UPGMA聚类分析图。
【具体实施方式】：
[0021 ] 实施例1
[0022] (1)克氏原螯虾的繁育
[0023] 从江苏省无锡市水产市场随机选取三只抱卵的雌奸，分别为一号奸，二号奸，三号 虾，人工建立三个家系:从一号虾子代中取14个仔虾，从二号虾子代中取14个仔虾，从三号 虾子代中取15个仔虾，形成三个半同胞家系，共46个个体，1为一号虾，2到15为一号虾的子 代，16为二号虾，17到30为二号虾的子代，31为三号虾，32到46为三号虾的子代。
[0024] (2)克氏原螯虾亲本和仔虾DNA的提取：
[0025] 1.从克丝原螯虾尾部肌肉取0.2g肌肉，放入1.5ml离心管中，加入470ul SET。肌肉 要用研磨棒捣碎。
[0026] 2.加入25ul 20%SDS(终浓度为0.5%)，然后加入5ul 20mg/ml蛋白酶K(终浓度 200ug/ml)。
[0027] 3.放入55摄氏度水浴锅水浴5小时看到溶液澄清。期间需要每一小时摇晃一下。
[0028] 4.加入lu RNAse 37摄氏度水浴一小时。
[0029] 5.加入500毫升的饱和酚，上下颠倒半小时，颠倒过程中不能破坏DNA。
[0030] 6. lOOOOrpm离心 10分钟。
[0031] 7.用枪头吸出上清液，放入另一个干净的离心管，枪头的尖端要被减除，防止破坏 DNA。同时不要吸到下层的浑浊液体。
[0032] 8.重复5-7步骤。
[0033] 9.加入酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，上下颠倒半小时，颠倒过程中不能破坏DNA。在 离心机上lOOOOrpm离心10分钟。用枪头吸出上清液，放入另一个干净的离心管，枪头的尖端 要被减除，防止破坏DNA。同时不要吸到下层的浑浊液体。
[0034] 10.加入氯仿:异戊醇（24:1 )，上下颠倒半小时，颠倒过程中不能破坏DNA。在离心 机上lOOOOrpm离心10分钟。用枪头吸出上清液，放入另一个干净的离心管，枪头的尖端要被 减除，防止破坏DNA。同时不要吸到下层的浑浊液体。
[0035] 11.在上清液中加入lml的预冷的无水乙醇，用力快速旋转，直至析出白色沉淀，或 者在零下20摄氏度冰箱中过夜。
[0036] 12.在离心机lOOOOrpm旋转3分钟，弃上清液，剩下固体，加入lml的70 %的乙醇洗 涤沉淀。
[0037] 13.在离心机上lOOOOrpm旋转三分钟，弃掉上清液，此时DNA沉淀与壁粘附不牢，容 易随乙醇滑出。回收DNA用70 %乙醇洗去DNA沉淀中的盐。
[0038] 14. 40-50摄氏度烘干，加入适量的超纯水。
[0039] (3)克氏原螯虾PCR产物扩增反应和电泳检测
[0040]本实验所选用的10对微卫星引物及条件如表1所示，分别对以上得到的DNA进行 PCR反应，其中PCR反应体系为 15ul :Mg离子 1.5ul、buff er缓冲液 1.5ul、4 X dNTP 0.5ul、一 对引物各〇. 5ul、Taq酶0.2ul、DNA2ul、超纯水8.3ul。反应程序为:第一个程序为95摄氏度预 变性2分钟，第二个程序循环35次，程序为95摄氏度变性30秒，退火温度30秒，72摄氏度延伸 1分钟，第三个程序为72摄氏度延伸10分钟，第四个程序为4摄氏度保存。
[0041] PCR产物用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染后拍照。
[0042]表1克氏原螯虾10对微卫星引物的基本信息
[0043] Tab.1 The basic information of the selected lOprimer pairs of Procambrus clarkii
[0045]
[0046] (4)遗传结构分析
[0047]将步骤（3)得到的10对微卫星清晰的电泳图像进行数字化处理，通过软件 population软件分析计算每个个体之间的遗传距离，并构建UPGMA聚类分析图，结果如图1 所示，三个半同胞家系聚类成3个大的分支，同一个家系的亲本和子代聚类在同一个大的分 支上，可以确定他们的亲子关系，这与前提条件完全相同。不同家系的亲本和子代聚类在不 同的分支上，说明它们不具有亲子关系，也和前提条件完全相同。根据聚类图表现出的亲子 关系，可以区分3个家系，从而验证了这个方法的真是可靠性。
【主权项】
1. 一种鉴别克氏原螯虾不同家系所用的扩增引物，其特征在于，该引物包括10对特异 的微卫星引物，具体序列表如下：2. -种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 从待测的克氏原螯虾个体尾部肌肉中提取DNA; (2) 以步骤（1)得到的DNA为模板，分别用权利要求1所述的10对引物进行PCR扩增，得到 扩增产物； (3) 对步骤(2)得到的扩增产物使用聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染； (4) 对步骤（3)的银染结果通过遗传分析软件进行分析，测量每个个体之间的遗传距 离，根据遗传距离绘制UPGMA聚类分析图，根据聚类结果区分不同氏原螯虾家系的个体。3. 根据权利要求2所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR 扩增的反应体系为 15ul :Mg离子 1 · 5ul、bufferl · 5ul、4xdNTP 0 · 5ul、一对引物各0 · 5ul、Taq 酶0 · 2ul、DNA2ul、超纯水8 · 3ul。4. 根据权利要求2所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR 扩增反应程序为:第一个程序为95摄氏度预变性2分钟，第二个程序循环35次，程序为95摄 氏度变性30秒，退火温度30秒，72摄氏度延伸1分钟，第三个程序为72摄氏度延伸10分钟，第 四个程序为4摄氏度保存。5. 根据权利要求2所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR 产物用12%的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染。6. 根据权利要求2所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，步骤(4)中所 述的遗传分析软件为population软件。
【专利摘要】本发明公布了一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，包括以下步骤：人工建立半同胞家系；从克氏原螯虾尾部肌肉提取DNA；用筛选出来的10对微卫星引物对提取的DNA进行PCR扩增；对PCR产物进行电泳，然后进行银染；对银染结果进行数字化分析，用遗传软件测量个体之间的遗传距离，根据遗传距离绘制UPGMA聚类分析图，根据聚类分析结果区分不同家系的个体。本发明可以快速准确的对克氏原螯虾的家系进行区分，有效防止近亲繁殖，在克氏原螯虾家系选育中有很大的应用价值。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105602946
【申请号】CN201510751050
【发明人】沈怀舜, 胡亚成, 马源潮
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年11月6日