克氏原螯虾眼柄多肽激素的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从克氏原螯虾眼柄组织中提取多肽激素的方法，具体涉及超声波结合反相高效液相色谱法提取眼柄多肽激素的方法。本发明为激素的理化性质及功能研究提供技术基础。
【背景技术】
[0002]虾蟹类眼柄内分泌系统主要由类似于脊椎动物的下丘脑神经垂体系统的X-器官窦腺复合体(X-organ sinus gland complex)组成。X器官位于视端髓的外缘，窦腺位于视内髓与视端髓交处的背方，由窦腺壁与中央血窦腔组成，窦腺壁由X-器神经分泌细胞轴突的末梢及神经胶质细胞交织而成。窦腺不具分泌功能，由X-器官神经分泌细胞分泌的激素经轴突神经束，运送至窦腺暂时储存，后进入血液循环。迄今已从虾蟹类动物的眼柄中分离纯化出六种激素，均为肽类激素，根据肽链的长短和分子量的不同可将其分为两类，一类为促色素细胞激素(Chromatophorotropins)，分子量较小，约8_20个氨基酸残基，包括色素集中激素(Pigment concentrating hormone,PCH)和色素分散激素(Pigment dispersinghormone, PDH);另一类的肽链约由70-80个氨基酸残基组成，包括蜕皮抑制素(Moltinhibiting hormone，MIH)、甲壳动物高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone,CHH)、性腺抑制激素(Gonad inhibiting hormone，GIH)、大颚器抑制激素(Mandibularorgan inhibiting hormone，Μ0ΙΗ)。
[0003]从虾蟹类眼柄组织中提取多肽激素的方法很多，如硫酸铵法、超临界萃取法等，但均存在诸多问题，而不尽人意。
【发明内容】
[0004]本发明克服了现有技术的不足，提供一种超声波结合反相高效液相色谱法提取克氏原螯虾眼柄多肽激素的方法。
[0005]—种克氏原螯虾眼柄多肽激素的提取方法，所述的方法包括以下步骤:
[0006]1.眼柄分离
[0007]选取健康活性好的克氏原螯虾，不分性别，保持体表清洁，将其眼柄从基部剪断，在预冷的含0.7% NaCl的Tris-HCl缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)中解剖出视上神经节(包含窦腺)，在体视显微镜下剥离去除结缔组织后置于1.5mL的离心管中，每lmL缓冲液放入50个视上神经节。
[0008]2.超声波破碎
[0009]将步骤1的缓冲液搅拌均匀，静置，放置于超声波细胞粉碎仪中，超声波输出功率为150W-300W，超声处理温度45°C _65°C，超声处理时间为工作5s-间隔5s，循环30次。将破碎后的匀浆液离心15min (4°C，12000rpm)，取上清液。
[0010]3.受热粗分离
[0011]将步骤2中上清液在80-85°C下水浴5min，使其中的非耐热蛋白受热变性而沉淀下来。所得上清液再次离心，重复热水浴两次。得到的上清液即为河蟹视上神经节内多肽激素的粗提液。
[0012]4.反相高效液相色谱
[0013]将步骤3的粗提液经过Sep-Pak小柱，收集后合并其馏分作为供试液经过反相高效液相色谱柱。色谱条件为:色谱柱L Bondapak C18, ID 4mm*250mm，10 μm ;预柱为ID4mm*30mm ;柱温40°C;流动相为乙腈-甲醇-0.6%乙酸(体积比为5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脱；收集时间为洗脱开始的2-65min，检测波长280nm。收集流出组分即为克氏原螯虾眼柄多肽激素的混合提取物。
[0014]进一步的技术方案在于:步骤2中的超声波破碎处理时间为工作5s-间隔5s，循环30次。
[0015]进一步的技术方案在于:步骤2中的超声波破碎处理温度为45°C _65°C，无需保持冰浴低温状态。
[0016]进一步的技术方案在于:步骤3中，对上清液80-85°C下水浴5min，重复两次，以便沉淀非耐热性多肽。
[0017]进一步的技术方案在于:步骤4中的洗脱液为酸性环境的乙腈。
[0018]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0019]1甲壳动物的CHH家族为一类具有酸性等电点的热稳定性神经多肽，提取粗提液时采取热水浴的方法可以有效的去除一部分杂蛋白的干扰，为接下来的层析分离奠定了基础。
[0020]2粗提液经过Sep-Pak小柱可以消除混合液中的盐离子，保证供试液的最佳酸碱环境。
[0021]2根据目的多肽的性质，采用酸性环境、连续浓度梯度的乙腈作为洗脱液，280nm检测，通过蛋白液相色谱仪的反相柱对眼柄激素蛋白粗提液进行进一步的分离，具有明显的分离效果。
【附图说明】
[0022]图1多肽激素提取物的SDS-PAGE电泳
[0023]1为提取的多肽激素混合物2，3为洗脱开始前后流出液Μ为蛋白Marker
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明作进一步阐述。
[0025]实施例1
[0026]按下述步骤进行:选取健康活性好的克氏原螯虾25只，不分性别，将其眼柄从基部剪断，在预冷的含0.7% NaCl的Tris-HCl缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)中解剖出视上神经节(包含窦腺)，在体视显微镜下剥离去除结缔组织后置于1.5mL的离心管中，每lmL缓冲液放入50个视上神经节。将缓冲液放置于超声波细胞粉碎仪中，超声波输出功率为150W-300W，超声处理温度50°C，超声处理时间为工作5s-间隔5s，循环30次。将破碎后的勾楽液离心15min(4°C，12000rpm)，取上清液在80°C下水浴5min，离心并重复热水浴一次。经过Sep-Pak小柱，收集后合并其馈分经过反相高效液相色谱柱L Bondapak C18，ID4mm*250mm，10 μ m ;预柱为ID 4mm*30mm ;柱温40°C;流动相为乙腈-甲醇_0.6%乙酸(体积比为5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脱；检测波长280nm，测吸光度，计算多肽激素混合物的蛋白浓度。
[0027]在本说明书中所谈到的“一个实施例”，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。进一步来说，结合任一个实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种克氏原螯虾眼柄多肽激素的提取方法，所述的方法包括以下步骤: (1)眼柄分呙 选取健康活性好的克氏原螯虾，不分性别，保持体表清洁，将其眼柄从基部剪断，在预冷的含0.7% NaCl的Tris-HCl缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)中解剖出视上神经节(包含窦腺)，在体视显微镜下剥离去除结缔组织后置于1.5mL的离心管中，每lmL缓冲液放入50个视上神经节。 (2)超声波破碎 将步骤(1)的缓冲液搅拌均匀，静置，放置于超声波细胞粉碎仪中，超声波输出功率为150W-300W，超声处理温度45°C _65°C，超声处理时间为工作5s_间隔5s，循环30次。将破碎后的匀浆液离心15min (4°C，12000rpm)，取上清液。 (3)受热粗分离 将步骤(2)中上清液在80°C _85°C下水浴5min，使其中的非耐热蛋白受热变性而沉淀下来。所得上清液再次离心，重复热水浴两次。得到的上清液即为河蟹视上神经节内多肽激素的粗提液。 (4)反相高效液相色谱 将步骤(3)的粗提液经过Sep-Pak小柱，收集后合并其馏分作为供试液经过反相高效液相色谱柱。色谱条件为:色谱柱L Bondapak C18，ID 4mm*250mm，10 μm ;预柱为ID4mm*30mm ;柱温40°C;流动相为乙腈-甲醇-0.6%乙酸(体积比为5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脱；收集时间为洗脱开始的2-65min，检测波长280nm。收集流出组分即为克氏原螯虾眼柄多肽激素的混合提取物。2.进一步的技术方案在于:步骤2中的超声波破碎处理时间为工作5s-间隔5s，循环30次。3.进一步的技术方案在于:步骤2中的超声波破碎处理温度为45°C -65°C，无需保持冰浴低温状态。4.进一步的技术方案在于:步骤3中，对上清液80-85°C下水浴5min，重复两次，以便沉淀非耐热性多肽，此步骤不可省略。5.进一步的技术方案在于:步骤4中的洗脱液为酸性环境的乙腈。
【专利摘要】本发明公开了一种克氏原螯虾眼柄多肽激素的提取方法，所述的方法包括以下步骤：1.眼柄分离将眼柄从基部剪断，在预冷的含0.7％NaCl的Tris-HCl缓冲液中解剖出视上神经节(包含窦腺)，每1mL缓冲液放入50个视上神经节。2.超声波破碎超声波输出功率为150-300W，超声处理温度45-65℃，超声处理时间为工作5s-间隔5s，循环30次。3.受热粗分离上清液在80-85℃下水浴5min并离心，重复热水浴两次。4.反相高效液相色谱先经过Sep-Pak小柱，再经过反相高效液相色谱柱，柱温40℃；流动相为乙腈-甲醇-0.6％乙酸(体积比为5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脱；收集时间为洗脱开始的2-65min，检测波长280nm。本发明用避免低温的超声破碎结合反相高效液相色谱，提取效率高，纯度好，提取的眼柄多肽激素混合液可以用于实验室功能研究。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/88
【公开号】CN105353055
【申请号】CN201510761171
【发明人】水燕, 徐增洪, 沈怀舜, 周鑫
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月10日