一种愈伤灵胶囊的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物质量控制技术领域，特别涉及一种愈伤灵胶囊的指纹图谱检测方 法，并由此得到其标准指纹图谱。
【背景技术】
[0002] 愈伤灵胶囊由土鳖虫、红花、自然铜(煅)、黄瓜子(炒)、冰片、续断、三七、当归、落 新妇提取物九味药材组成。该方具有活血散瘀，消肿止痛之功效，主要用于治疗跌打挫伤、 筋骨瘀血肿痛。愈伤灵处方来源于《部颁标准》中药成方制剂第八册。
[0003] 愈伤灵胶囊作为中成药，其药效是多种活性成分共同作用的结果。但目前愈伤 灵胶囊的现行质量标准仅有鉴别项，无含量测定项，无法对其质量进行有效监控。针对 愈伤灵胶囊的质量检测方法的公开专利只有一个，中国专利200710176059.6 (公开号 CN101153864A)，仅采用HPLC法控制其岩白菜素的含量。针对愈伤灵胶囊的质量检测方法 如下，《中国医药》2012年5月第7卷增刊《高效液相色谱法测定愈伤灵胶囊中三七皂苷R1、 人参皂苷Rgl和人参皂苷Rbl含量》、《中成药》2006年2月第28卷第2期《愈伤灵胶囊质 量标准研究》、《医药导报》2006年10月第25卷第10期《愈伤灵胶囊的质量控制》等文章 中记载了一种测定愈伤灵胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rgl或人参皂苷Rbl的含量的HPLC 方法；《安徽医药》2009年《HPLC法测定愈伤灵胶囊中岩白菜素的含量》记载了一种测定愈 伤灵胶囊中岩白菜素含量的HPLC方法；《中华中医药学会第七次中药分析学术交流会论文 集》收录的《愈伤灵胶囊的特征图谱研究及多指标成分的含量测定》中记载了一种愈伤灵胶 囊的特征图谱及多指标成分测定方法。现有技术中，仅有一篇文献报道了愈伤灵胶囊的指 纹图谱方法，其监控了红花、三七、当归、续断、落新妇五味药材，本方法则监控了土鳖虫、红 花、三七、当归、续断、落新妇六味药材，较其多监控了一味药材(土鳖虫)，且土鳖虫具有破 血逐瘀、续筋接骨之功效，主要用于跌打损伤、筋伤骨折、血瘀经闭、产后瘀阻腹痛、瘾瘕痞 块等症的治疗，是愈伤灵胶囊发挥其功效的关键药材，故控制其质量有较大意义。此外，文 献中采用的方法为UPLC法，本专利方法为HPLC法，后者适用范围更广，更有利于企业对愈 伤灵胶囊的质量进行全面控制并节约企业的检测成本。因此，建立愈伤灵胶囊的指纹图谱 检测方法和标准指纹图谱具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对愈伤灵胶囊的质量控制现状，提供一种基于高效液相色谱法 的愈伤灵胶囊的指纹图谱检测方法及根据该方法建立得到的愈伤灵胶囊的高效液相色谱 指纹图谱，有利于对其原料药材、中间体及其终产品质量的有效控制以保证其临床疗效。
[0005] 本发明的愈伤灵胶囊的指纹图谱检测方法，包括如下步骤： (1)对照品洛液的制备： 称取人参皂苷Rgl对照品，置于20~50ml容量瓶中，加50%~100%甲醇溶解并定容至刻 度，摇匀，制成对照品溶液； (2) 供试品溶液的制备： 取愈伤灵胶囊内容物，加80%~100%甲醇50~100ml，称重，回流提取2~4h，放冷，再称定 重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液； (3) 色谱条件： 色谱柱为C1S反相色谱柱；采用梯度洗脱，流动相为流动相A与流动相B组成的梯度洗 脱液，流动相A为乙腈，流动相B为0. 1~0. 2%磷酸溶液；检测波长初始为244nm，18min时切 换波长为 200nm ;柱温 25°C ~30°C ;流速 0· 8ml/min~l. 2ml/min ;分析时间 65min ; (4) 测定： 精密吸取对照品溶液与供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得 到指纹图谱。
[0006] 本发明中，所述的愈伤灵中药方为现有中药方，其包括土鳖虫、红花、自然铜(煅)、 黄瓜子(炒)、冰片、续断、三七、当归、落新妇提取物九味药材，各药材的重量份数比一般为： 60:120:30:120:120:60:180:90:50. 4。上述愈伤灵胶囊可由下述方法制得：以上九味，除冰 片、落新妇提取物外，其余红花等七味粉碎成细粉，按现有常规方法制成胶囊剂。
[0007] 本发明中，所述的供试品制备方法中，供试品的称样量为0. 5~2g，回流提取时间为 2~4h，优选的提取时间为3h。
[0008] 本发明中，所述的流动相B为0. 1~0. 2%磷酸溶液，优选的为0. 1%磷酸溶液，洗脱 梯度如表1所示。
[0010] 本发明中，所述的检测波长初始为244nm，18min时切换波长为200nm。
[0011] 本发明中，所述的总流速为0· 8~L 2ml/min，优选的为1.0ml/min。
[0012] 本发明中，所述的柱温为25°C ~35°C。
[0013] 本发明中，精密吸取注入高效液相色谱仪的供试品溶液的进样量为10 μ 1。
[0014] 本发明中，依据所得的10批愈伤灵胶囊的指纹图谱，制定标准指纹图谱；其中所 述标准指纹图谱具有15个共有峰，其中4号峰为绿原酸，5号峰为羟基红花黄色素Α，7号峰 为人参皂苷Rgl，9号峰为人参皂苷Rbl，10号峰为藁本内酯。
[0015] 本发明中，所述的愈伤灵胶囊指纹图谱与制定的标准指纹图谱进行比对，其相似 度为0. 891~1. 000,共有峰有15个，共有峰峰面积总和占总峰面积的90%以上，以7号峰人 参皂苷Rgl为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，各峰的相对保留时间分别为：（1) 0· 118~0· 125、（2) 0· 241~0· 250、（3) 0· 257~0· 293、（4) 0· 345~0· 380、（5) 0· 431~0· 462、 (6)0. 481~0· 524、（S) 1· 000、（8) 1· 100~1· 214、（9) 1· 022~1· 150、（10) 1· 302~1· 508、（11) 1· 402~1· 589、（12)1· 501~1· 708、（13)1· 587~1· 724、（14)1· 714~1· 901、（15)2· 001~2· 189 ; 各峰的相对峰面积分别为：（1) 0· 231~0· 501、（2) 0· 168~0· 455、（3) 0· 722~1· 121、（4) 0· 042~0· 230、（5) 0· 260~0· 507、（6) 0· 093~0· 192、（S) 1· 000、（8) 0· 479~0· 711、（9) 0· 527~0· 580、（10)0· 255~0· 569、（11)1· 081~3· 705、（12)0· 625~2· 705、（13)0· 107~0· 557、 (14) 2· 719~7· 105、（15) 0· 481~0· 861。
[0016] 优选的各峰的相对保留时间分别为：（1)0. 121~0· 123、（2)0·245~0·248、（3) 0· 282~0· 290、（4) 0· 359~0· 369、（5) 0· 444~0· 458、（6) 0· 493~0· 504、（S) 1· 000、（8) 1· 118~1· 185、（9) 1· 098~1· 140、（10) 1· 382~1· 480、（11) 1· 496~1· 506、（12) 1· 602~1· 661、 (13) L 664~L 687、（ 14) L 825~L 868、（ 15) 2· 094~2· 107 ;优选的各峰的相对峰面积 分别为：（1) 0. 243~0· 585、（2)0. 184~0· 268、（3) 0. 837~1· 032、（4)0. 102~0· 197、（5) 0· 321~0· 477、（6) 0· 128~0· 171、（S) 1· 000、（8) 0· 509~0· 647、（9) 0· 559~0· 578、（ 10) 0· 341~0· 500、（11)1· 274~2· 005、（12)0· 713~2· 121、（13)0· 217~0· 439、（14)2· 936~6· 003、 (15) 0· 519~0· 830。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： (1) 本发明愈伤灵胶囊的指纹图谱检测方法中，制备供试品溶液的方法前较为简单，特 征性成分能较为完整的保留下来，且供试品溶液稳定性良好； (2) 该高效液相色谱方法的专属性、重现性好，分析时间较短。所得指纹图谱中各特征 成分分离效果较好； (3) 本发明所建立的标准指纹图谱有15个共有峰，其中9个峰明确归属于6味药材，信 息量较大，且明确了 5个指标成份，较完整的保留了供试液中的化学成分； (4) 本发明中指认了 5个特征峰，经比较采用保留时间适中，分离度较好，峰面积较大 的人参皂苷Rgl对照品作为参照峰；