一种用三维指纹图谱鉴别特定产地特定品种葡萄酒的方法与流程

本发明属于酒类检测领域，具体涉及一种用三维指纹图谱(高效液相色谱法、气相色谱法和紫外可见分光光度法)鉴别特定产地特定品种葡萄酒的方法。

背景技术：

葡萄酒是世界上最早的饮料酒之一，在世界各类酒中占据着十分显赫的位置，其产量在世界饮料酒中列第二位。葡萄酒酒精含量低、营养价值高，是最健康、最卫生的饮料，所以它一直是饮料酒中优先发展的品种之一。葡萄酒(特指红葡萄酒)不仅具有饮料酒的饮用、滋补功能，而且适量饮用葡萄酒还有保健功能。

葡萄酒跟人们的生活息息相关，因此，其质量的好坏直接关系到人民的身体健康。葡萄酒是以新鲜葡萄或葡萄汁经酵母部分或完全发酵酿制而成的，其酒精体积分数通常为8～16％。

但近年来，部分商家在商业利益的驱使下，制售假葡萄酒，给消费者的身心健康带来了威胁。一种制假方式是用一种或多种低端葡萄酒混合后贴高端产品的标签以次充好，另外一种是用水、色素、酒精、香精来调制所谓的葡萄酒，生产原料中唯独没有造葡萄酒必备的葡萄原汁。无论是哪种制假方法，都对消费者的消费权益和身心健康造成侵害。

葡萄酒成分多，具有类似中草药的复杂体系，但葡萄酒因其葡萄品种固定、种植技术稳定和生产工艺的一致，葡萄酒的质量还是具有均一性和稳定性的。因此借鉴中药研究方法，把建立指纹图谱方法引入葡萄酒的检测体系中。葡萄酒指纹图谱的建立，不需要对葡萄酒各组分物质的定性分析，只需对葡萄酒中主要化学成分的组成和含量利用现代分析技术如色谱分析技术反映出来，再从宏观上进行分析确定各组分间的差异。

葡萄酒成分大致可分为挥发性成分和不挥发性成分两大类，挥发性成分包括醇类、酯类、有机酸类、挥发性酚类、硫醇类、萜烯醇类等；不挥发性成分包括黄酮类、氨基酸、糖类、色素、维生素、微量金属等。由于葡萄酒成分十分复杂，很难通过单一的检测方法进行产地的溯源和质量鉴定，目前，毛细管柱—气相色谱分析葡萄酒中挥发性成分是葡萄酒分类鉴定、质量控制以及了解葡萄酒香气特点的重要手段。而葡萄酒中不挥发性成分可通过液相色谱分析进行鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用三维指纹图谱(高效液相色谱法、气相色谱法和紫外可见分光光度法)鉴别特定产地特定品种葡萄酒的方法，该方法通过对多批次特定产地特定品种的葡萄酒样品进行数据收集，利用HPLC和UV建立该产地该品种葡萄酒中提取物的特征指纹图谱，利用GC法建立该产地该品种葡萄酒二氯甲烷提取物的特征指纹图谱，最终建立该葡萄酒的共有模式图谱；将待测葡萄酒样品的指纹图谱与该共有模式图谱进行比较，即可鉴别真假。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用三维指纹图谱鉴别特定产地特定品种葡萄酒的方法，包括以下步骤：

(1)收集多批次的相同品牌或不同品牌的特定产地特定品种葡萄酒，分别用高效液相色谱法、气相色谱法、紫外可见分光光度法提取各批次该葡萄酒的液相图谱、气相图谱和紫外-可见光吸收光谱；

(2)建立该葡萄酒的共有模式图谱；

2-1：气相部分

提取各批次该葡萄酒气相色谱中的共有峰，以所有共有峰峰面积之和为分母，每个成分的峰面积做分子，处理后为归一化面积；归一化面积大于1％为筛选条件，得到若干个指纹特征峰，为该葡萄酒气相部分的共有模式图谱；

2-2：液相部分

提取各批次该葡萄酒液相色谱中的共有峰，以所有共有峰峰面积之和为分母，每个成分的峰面积做分子，处理后为归一化面积；归一化面积大于0.7％为筛选条件，得到若干个指纹特征峰，为该葡萄酒液相部分的共有模式图谱；

2-3：紫外-可见光吸收光谱部分

取各批次吸收光谱中各波长吸光值的平均值，建立紫外-可见光吸收光谱的共有模式图谱；

(3)待测的声称是相同产地相同品种的葡萄酒，分别用高效液相色谱法、气相色谱法、紫外可见分光光度法提取其液相图谱、气相图谱和紫外-可见光吸收光谱，与步骤(2)得到的共有模式图谱进行比对，依据以下标准判断其真伪：

3-1：气相部分

待测葡萄酒的气相图谱应含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对含量计算各个指纹特征峰的相似度，差值法应全部大于0.9；

3-2：液相部分

待测葡萄酒的液相图谱应含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对峰面积计算各个指纹特征峰的相似度，差值法应全部大于0.9；

3-3：紫外-可见光吸收光谱部分

待测葡萄酒的紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱进行比较，差值法应全部大于0.9；

若待测葡萄酒的气相图谱、液相图谱和紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱比对都全部合格，则可以判定待测葡萄酒的确是相同产地相同品种的葡萄酒。

步骤(1)所述的多批次至少需要9个批次；

步骤(1)所述的特定产地是指葡萄酒的主产区，诸如河北秦皇岛、山东烟台、法国波尔多等等；

步骤(1)所述的特定品种是指赤霞珠葡萄酒、梅洛葡萄酒、西拉葡萄酒等等；

步骤(1)和(3)中，葡萄酒样品做气相色谱时，样品的处理步骤如下：

向玻璃离心管加入3mL样品、7mL二级水和60μL 0.02％(v/v)的内标溶液4-甲基-2-戊醇，然后加入4.5g优级纯硫酸铵以提高萃取效率和消除乳化现象，然后加入0.5mL二氯甲烷，于涡旋震荡仪1100r/min涡旋10min后放入离心机以2500r/min离心10min，取下层二氯甲烷层至300μL微量进样瓶中用于气相分析；

气相色谱标准品溶液的制备：

1、2％(V/V)单标母液的配制：各精密吸取表1中的标准物质(纯度为99％左右)2mL于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容；

2、0.02％(V/V)内标溶液的配制：精密吸取1.00mL 2％(V/V)4-甲基-2-戊醇于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容；

3、混合标液的配制：按表1中各标准物质质量浓度配制，最终混合标液中含12％乙醇，并用酒石酸和0.2M NaOH调节pH值至3.2；

表1：混合标液中各标准物质质量浓度

气相色谱条件是：40℃保持5min后以3℃/min升温至190℃，保持10min；载气为高纯氮气，流速1.5mL/min；进样量0.5μL；进样口200℃；分流模式：不分流进样；

步骤(1)和(3)中，葡萄酒样品做高效液相色谱时，样品的处理步骤如下：

将葡萄酒样品用磷酸调节pH值至2.3，采用SDB-L固相萃取小柱，上样10ml，不吹干；用磷酸盐缓冲溶液(pH值2.3)5ml清洗，清洗2次，吹干；用甲醇洗脱三次，每次1ml，吹干；收集洗脱液在55℃条件下，吹至1ml；

液相色谱条件是：

流动相组成：甲醇-磷酸盐缓冲液(0.2％H₃PO₄+0.05M NaH₂PO₄，用磷酸调节pH值2.3)；洗脱梯度为：在保留时间为0min、80min、90min、100min、120min时，磷酸盐缓冲液和甲醇的比例分别为98：2，42：58，10：90，98：2，98：2；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长：300nm；柱温：25℃；

步骤(1)和(3)中，葡萄酒样品做紫外-可见光吸收光谱时，样品的处理步骤如下：

取2ml葡萄酒样品于50ml容量瓶中，加入0.4M磷酸1.7ml，用pH值2.0的磷酸二氢钠-磷酸缓冲液定容；

紫外-可见光吸收光谱的检测方法是：

先用空白对照溶液在波长200-800nm下进行基线校正，然后再将处理后的样品在波长200-800nm下进行扫描，扫描步长为1nm；

步骤(3)所述的差值法，其计算公式如下：

其中，n为特征峰数目或步长，A和B为比较对象；

当本发明方法用于鉴别秦皇岛产赤霞珠葡萄酒时，步骤(3)中，气相部分差值法应全部大于0.9670，液相部分差值法应全部大于0.9380，紫外-可见光吸收光谱部分差值法应全部大于0.9650。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明通过利用HPLC和UV法建立葡萄酒不挥发类物质成分的指纹图谱，利用GC法建立葡萄酒香气等挥发性成分的指纹图谱。通过对两种类型(挥发性成分指纹图谱和非挥发性物质指纹图谱)指纹图谱数据进行分析和拟合，建立一种三维指纹图谱技术鉴别特定产地特定品种葡萄酒的方法。本发明具有灵敏、准确、稳定、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒9个批次的气相色谱。

图2是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒9个批次的液相色谱。

图3是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒9个批次的紫外-可见光吸收光谱。

图4是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒气相部分的共有模式图谱。

图5是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒液相部分的共有模式图谱。

图6是××品牌批次20120527葡萄酒的液相图谱。

图7是××品牌批次20120527葡萄酒的气相图谱。

图8是××品牌批次20120527葡萄酒的紫外-可见光吸收光谱。

图9是××品牌批次20111211葡萄酒的液相图谱。

图10是××品牌批次20111211葡萄酒的气相图谱。

图11是××品牌批次20111211葡萄酒的紫外-可见光吸收光谱。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种用三维指纹图谱鉴别秦皇岛产赤霞珠葡萄酒的方法，包括以下步骤：

(1)收集9个批次的不同品牌秦皇岛产赤霞珠葡萄酒，分别用高效液相色谱法、气相色谱法、紫外可见分光光度法提取各批次该葡萄酒的液相图谱、气相图谱和紫外-可见光吸收光谱；

气相色谱的样品处理步骤如下：

向玻璃离心管加入3mL样品、7mL二级水和60μL 0.02％(v/v)的内标溶液4-甲基-2-戊醇，然后加入4.5g优级纯硫酸铵以提高萃取效率和消除乳化现象，然后加入0.5mL二氯甲烷，于涡旋震荡仪1100r/min涡旋10min后放入离心机以2500r/min离心10min，取下层二氯甲烷层至300μL微量进样瓶中用于气相分析；

气相色谱标准品溶液的制备：

1、2％(V/V)单标母液的配制：各精密吸取表1中的标准物质(纯度为99％左右)2mL于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容；

2、0.02％(V/V)内标溶液的配制：精密吸取1.00mL 2％(V/V)4-甲基-2-戊醇于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容；

3、混合标液的配制：按表1中各标准物质质量浓度配制，最终混合标液中含12％乙醇，并用酒石酸和0.2M NaOH调节pH值至3.2；

表1：混合标液中各标准物质质量浓度

气相色谱条件是：40℃保持5min后以3℃/min升温至190℃，保持10min；载气为高纯氮气，流速1.5mL/min；进样量0.5μL；进样口200℃；分流模式：不分流进样；气相色谱仪(美国PerkinElmer公司，带PSS分流进样口、衬管2mm内径和FID检测器)；TotalChrom色谱工作站(美国PerkinElmer公司)；ZB-WAX毛细柱30m×0.25mm×0.25μm(美国)。

高效液相色谱的样品处理步骤如下：

将葡萄酒样品用磷酸调节pH值至2.3，采用SDB-L固相萃取小柱，上样10ml，不吹干；用磷酸盐缓冲溶液(pH值2.3)5ml清洗，清洗2次，吹干；用甲醇洗脱三次，每次1ml，吹干；收集洗脱液在55℃条件下，吹至1ml；

液相色谱条件是：

流动相组成：甲醇-磷酸盐缓冲液(0.2％H₃PO₄+0.05M NaH₂PO₄，用磷酸调节pH值2.3)；洗脱梯度为：在保留时间为0min、80min、90min、100min、120min时，磷酸盐缓冲液和甲醇的比例分别为98：2，42：58，10：90，98：2，98：2；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长：300nm；柱温：25℃；色谱柱：Phenomenex Gemini 5 C18

紫外-可见光吸收光谱的样品处理步骤如下：

取2ml葡萄酒样品于50ml容量瓶中，加入0.4M磷酸1.7ml，用pH值2.0的磷酸二氢钠-磷酸缓冲液定容；pH值2.0的磷酸二氢钠-磷酸缓冲液的配制方法如下：分别配制0.2M磷酸二氢钠溶液和0.4M磷酸溶液，按78：122ml比例混合，测缓冲液实际pH值，若pH值有偏差再调至2.0。

此外，空白对照溶液是：取2mL 10％乙醇溶液于50ml容量瓶中，用pH值2.0的磷酸二氢钠-磷酸缓冲液定容。

紫外-可见光吸收光谱的检测方法是：

先用空白对照溶液在波长200-800nm下进行基线校正，然后再将处理后的样品在波长200-800nm下进行扫描，扫描步长为1nm。

9个批次葡萄酒的气相色谱图如图1所示；

9个批次葡萄酒的液相色谱图如图2所示；

9个批次葡萄酒的紫外-可见光吸收光谱如图3所示；

(2)建立该葡萄酒的共有模式图谱；

2-1：气相部分

提取各批次该葡萄酒气相色谱中的共有峰(共有69个)，以所有共有峰峰面积之和为分母，每个成分的峰面积做分子，处理后为归一化面积；归一化面积大于1％为筛选条件，得到9个指纹特征峰，为该葡萄酒气相部分的共有模式图谱(图4)；

9个指纹特征峰及其归一化面积分别是：1号峰1-丙醇1.1％，2号峰异丁醇6.0％，3号峰为内标(4-甲基-2-戊醇)，4号峰异戊醇40.5％，5号峰乳酸乙酯14.8％，6号峰1.0％，7号峰r-丁内酯1.6％，8号峰琥珀酸二乙酯2.6％，9号峰苯乙醇12.7％，10号峰13.4％(6号、10号为未知峰，未做定性试验，不影响指纹图谱建立)；

2-2：液相部分

提取各批次该葡萄酒液相色谱中的共有峰，以所有共有峰峰面积之和为分母，每个成分的峰面积做分子，处理后为归一化面积；归一化面积大于0.7％为筛选条件，得到24个指纹特征峰，为该葡萄酒液相部分的共有模式图谱(图5)；

24个特征峰及其归一化面积分别为：1号峰1.4％，2号峰9.1％，3号峰1.3％，4号峰9.3％，5号峰2.6％，6号峰4.8％，7号峰9.8％，8号峰2.9％，9号峰3.9％，10号峰4.7％，11号峰0.9％，12号峰10.8％，13号峰2.2％，14号峰3.3％，15号峰0.8％，16号峰2.9％，17号峰1.4％，18号峰3.9％，19号峰2.6％，20号峰1.1％，21号峰1.6％，22号峰2.1％，23号峰1.1％，24号峰1.9％；

2-3：紫外-可见光吸收光谱部分

取各批次吸收光谱中各波长吸光值的平均值，建立紫外-可见光吸收光谱的共有模式图谱(图3中的R即为共有模式图谱)；

(3)待测的××品牌声称是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒(批次：20120527)，分别用高效液相色谱法、气相色谱法、紫外可见分光光度法提取其液相图谱(图6)、气相图谱(图7)和紫外-可见光吸收光谱(图8)，将它们与步骤(2)得到的共有模式图谱进行比对：

3-1：气相部分

待测葡萄酒的气相图谱含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对含量计算相似度，差值法为0.9889，大于0.9670，符合要求；

3-2：液相部分

待测葡萄酒的液相图谱含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对峰面积计算相似度，差值法为0.9884，大于0.9380，符合要求；

3-3：紫外-可见光吸收光谱部分

待测葡萄酒的紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱进行比较，差值法为0.9717，大于0.9650，符合要求；

待测葡萄酒的气相图谱、液相图谱和紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱比对都全部合格，可以判定待测葡萄酒的确是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒。

实施例2

一种用三维指纹图谱鉴别秦皇岛产赤霞珠葡萄酒的方法，包括以下步骤：

秦皇岛产赤霞珠葡萄酒的共有模式图谱见实施例1；

(3)待测的××品牌声称是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒(批次：20111211)，分别用高效液相色谱法、气相色谱法、紫外可见分光光度法提取其液相图谱(图9)、气相图谱(图10)和紫外-可见光吸收光谱(图11)，与共有模式图谱进行比对：

3-1：气相部分

待测葡萄酒的气相图谱含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对含量计算相似度，差值法为0.9959，大于0.9670，符合要求；

3-2：液相部分

待测葡萄酒的液相图谱含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对峰面积计算相似度，差值法为0.9485，大于0.9380，符合要求；

3-3：紫外-可见光吸收光谱部分

待测葡萄酒的紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱进行比较，差值法为0.9689，大于0.9650，符合要求；

待测葡萄酒的气相图谱、液相图谱和紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱比对都全部合格，可以判定待测葡萄酒的确是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒。

实施例3

一种用三维指纹图谱鉴别秦皇岛产赤霞珠葡萄酒的方法，包括以下步骤：

秦皇岛产赤霞珠葡萄酒的共有模式图谱见实施例1；

(3)待测的××品牌声称是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒，分别用高效液相色谱法、气相色谱法、紫外可见分光光度法提取其液相图谱、气相图谱和紫外-可见光吸收光谱，与共有模式图谱进行比对：

3-1：气相部分

待测葡萄酒的气相图谱含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对含量计算相似度，差值法为0.8550，小于0.9670，不符合要求；

3-2：液相部分

待测葡萄酒的液相图谱含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对峰面积计算相似度，差值法为0.7600，小于0.9380，不符合要求；

3-3：紫外-可见光吸收光谱部分

待测葡萄酒的紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱进行比较，差值法为0.8744，小于0.9650，不符合要求；

待测葡萄酒的气相图谱、液相图谱和紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱比对都全部不合格，可以判定待测葡萄酒非秦皇岛产赤霞珠葡萄酒。

实施例4

一种用三维指纹图谱鉴别秦皇岛产赤霞珠葡萄酒的方法，包括以下步骤：

秦皇岛产赤霞珠葡萄酒的共有模式图谱见实施例1；

(3)待测的××品牌声称是秦皇岛产赤霞珠葡萄酒，分别用高效液相色谱法、气相色谱法、紫外可见分光光度法提取其液相图谱、气相图谱和紫外-可见光吸收光谱，与共有模式图谱进行比对：

3-1：气相部分

待测葡萄酒的气相图谱含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对含量计算相似度，差值法为0.3988，小于0.9670，不符合要求；

3-2：液相部分

待测葡萄酒的液相图谱含有共有模式图谱的全部指纹特征峰，同时以相对峰面积计算相似度，差值法为0.4180，小于0.9380，不符合要求；

3-3：紫外-可见光吸收光谱部分

待测葡萄酒的紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱进行比较，差值法为0.7826，小于0.9650，不符合要求；

待测葡萄酒的气相图谱、液相图谱和紫外-可见光吸收光谱与共有模式图谱比对都全部不合格，可以判定待测葡萄酒非秦皇岛产赤霞珠葡萄酒。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。