一种金圣卷烟天然添加剂指纹图谱及其建立方法与流程

本发明涉及指纹图谱技术领域，尤其涉及一种金圣卷烟天然添加剂指纹图谱的建立方法，以及利用上述方法建立的金圣卷烟天然添加剂指纹图谱。

背景技术：

指纹图谱是指某些复杂物质，比如天然本草、某种生物体或某种组织或细胞的蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。

中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPLC)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点，天然本草成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且已积累较丰富的应用经验，因此高效液相色谱法已成为天然本草指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC-MS和GC-MS等联用技术的应用，天然本草指纹图谱技术更趋完善。

金圣香的中药配方中突出了“补肾阳，益肺气”的作用，从《本草纲目》和《中国药典》的收载的100余种中药中筛选出补益肺肾、清咽利嗓的中药。针对吸烟对人体的危害，主攻方向为抑菌、消炎、止咳、祛痰，通过补肺达到益肾的目的。从对烟气的药理、药效、毒理试验及化学成分分析和人群试验证明，金圣香的配方是经过中医药理论论证和现代科学实验验证的科学组方。金圣香卷烟天然添加剂由大黄等药材配伍而成。大黄性苦、寒、无毒,有泻热通肠、调中化食、凉血解毒、逐瘀通径、安和五脏的作用；复配一些具有止咳平喘、生津回甜的天然辅料，金圣香温肾助阳，凉血解毒，泻热通肠。用于阳痿肾虚，筋骨痿软、目赤咽肿，小便赤热属上述证候者。现代研究表明金圣香具有增强机体细胞抗向氧化功能、保护细胞膜、稳定细胞内环境等多种生理、生化功能，具有明显降低卷烟危害的作用及明确的机理，整体降害效果达到全国领先水平。可以说，金圣已成为行业内运用中草药草本独特中式减害技术研发最早、研发时间最长、技术应用最成熟、经济效益与社会效益并举的中式低害特色卷烟领跑者。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种金圣卷烟天然添加剂指纹图谱及其建立方法，且该指纹图谱建立方法简单、快速、有效。

一种金圣卷烟天然添加剂指纹图谱，其特征峰为20号峰大黄酚，其相对保留时间为71.825min。

特征峰还包括：相对保留时间为2.968min的1号峰，相对保留时间为4.822min的2号峰，相对保留时间为17.956min的3号峰，相对保留时间为19.035min的4号峰，相对保留时间为22.473min的5号峰，相对保留时间为23.332min的6号峰，相对保留时间为24.181min的7号峰，相对保留时间为24.512min的8号峰，相对保留时间为25.811min的9号峰，相对保留时间为33.966min的10号峰，相对保留时间为34.731min的11号峰，相对保留时间为40.987min的12号峰，相对保留时间为42.773min的13号峰，相对保留时间为44.179min的14号峰，相对保留时间为48.809min的15号峰，相对保留时间为54.099min的16号峰，相对保留时间为60.273min的17号峰，相对保留时间为62.647min的18号峰，相对保留时间为67.773min的19号峰。

一种金圣卷烟天然添加剂指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

步骤1，制备金圣卷烟天然添加剂供试品溶液和参照物溶液：提供不同批次的金圣卷烟天然添加剂供试品，分别取一定量的金圣卷烟天然添加剂供试品，加入50v/v％醇溶液稀释，摇匀，过滤，取滤液即得供试品溶液；参照物溶液为一定浓度的大黄酚溶液；

步骤2，对供试品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，记录80min图谱；

高效液相色谱条件如下：

流动相A和B分别为，乙腈-体积百分比浓度0.1％甲酸溶液或甲醇-体积百分比浓度0.1％甲酸溶液；

流速为0.8mL/min～1.2mL/min；

柱温为25℃～35℃；

检测波长为200～400。

优选的，步骤1的具体过程为：取金圣卷烟天然添加剂供试品100μL加50v/v％醇溶液溶解，定容至2mL容量瓶中，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得供试品溶液；取大黄酚适量，加50v/v％醇溶液制成每1ml含6.05μg的溶液，即得参照物溶液。

优选的，所述醇溶液为50v/v％的甲醇。

优选的，高效液相色谱条件，以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度0.1％甲酸溶液为流动相B。

优选的，高效液相色谱条件，流速为1.0mL/min。

优选的，高效液相色谱条件，柱温为25℃。

优选的，高效液相色谱条件，检测波长为254nm。

优选的，高效液相色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度0.1％甲酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温为25℃；检测波长为254nm；梯度洗脱的流程为：0～48分钟，90→66％流动相A，10→34％流动相B；48～65分钟，66→18％流动相A，34→82％流动相B；65～80分钟，18→0％流动相A，82→100％流动相B。

本发明的有益效果是：

1、用本发明所提供的方法所建立的金圣卷烟天然添加剂指纹图谱，能有效地表征金圣卷烟天然添加剂的质量，有利于全面监控药物的质量；

2、指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定金圣卷烟天然添加剂质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性；

3、该方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。

附图说明

图1为本发明供试品溶剂的选择试验所获得的色谱图；

图2为本发明检测波长的选择试验所获得的色谱图；

图3为本发明洗脱系统的选择试验所获得的色谱图；

图4为本发明流速的考察试验所获得的色谱图；

图5为本发明一种实施例的13批金圣卷烟天然添加剂指纹图谱；

图6为本发明一种实施例的金圣卷烟天然添加剂对照指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合具体实施例以及附图对本发明的方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照现有技术中常规条件或制造商建议的条件进行；其中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为现有的可以通过市购获得的常规产品。

一种金圣卷烟天然添加剂指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

步骤1，制备金圣卷烟天然添加剂供试品溶液和参照物溶液：提供不同批次的金圣卷烟天然添加剂供试品，分别精密吸取金圣卷烟天然添加剂提取液100μL加50v/v％甲醇溶解，定容至2mL容量瓶中，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得供试品溶液；取大黄酚适量，加50v/v％甲醇制成每1ml含大黄酚6.05μg的溶液，即得参照物溶液。

步骤2，对供试品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱分析；分别精确吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录80分钟的色谱图；

金圣卷烟天然添加剂指纹图谱测定的色谱条件为：

以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度0.1％甲酸溶液为流动相B。

流速为1.0mL/min。

柱温为25℃。

检测波长为254nm。

本实施中具体建立方法过程如下：

仪器与试剂:仪器,SHIMADZU LC-2010A、Waters2695HPLC、Agilent1200HPLC和Agilent1100HPLC高效液相色谱仪，检测器均为二极管阵列检测器(安捷伦公司)Milli-Q超纯水仪(密理博公司，法国)XP205型电子天平(十万分之一，瑞士METTLERTOLEDO)；KM-12A型超声波清洗机(广州市科洁盟实验仪器有限公司)；

对照品：大黄酚，批号：110796-201017，购自中国药品生物制品检定所。

试剂：乙腈，色谱纯，德国默克公司；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

药品来源:本发明用金圣卷烟天然添加剂的批号分别为090421、090414、090407、090321、090314、090307、090228、090221、090214、090207、091023、090116、090109，金圣卷烟天然添加剂由江西中烟工业有限责任公司提供。

参照物：大黄酚为金圣卷烟天然添加剂含量测定的指标成分，含量较稳定，且在图谱中保留时间适中、分离度较好，因此选择大黄酚作为参照物。

供试品溶液的制备：试验对不同提取溶剂进行了考察，具体操作为：取批号为090421批的金圣卷烟天然添加剂提取液100μL，加精密加入提取溶剂水、50v/v％甲醇、甲醇，定容至2mL容量瓶中，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得供试品溶液，进样分析；结果表明溶剂为50v/v％甲醇提取效果较优，峰型和分离情况较好；结果如图1所示。

色谱条件：

一、检测波长的选择；

除检测波长条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。使用二极管阵列检测器对样品进行200-400nm全波长扫描，并对等吸收图进行分析，提取吸收峰较多的四个波长(220、250、270、315nm)下的色谱图进行比较，显示检测波长能较全面的反映金圣卷烟天然添加剂中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，因此选择作为金圣卷烟天然添加剂指纹图谱的采集波长，如图2所示。

二、流动相的选择；

使用phenomenexluna C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱比较了甲醇-体积百分比浓度0.1％甲酸溶液，乙腈-体积百分比浓度0.1％甲酸溶液为流动相的分离效果对本品指纹图谱的影响，结果上述各流动相系统所得指纹图谱中乙腈-水梯度洗脱能使各主要色谱峰达到较好的分离，因此金圣卷烟天然添加剂指纹图谱流动相选择乙腈-体积百分比浓度0.1％甲酸系统；如图3所示。

三、柱温的考察；在同一条件下考察柱温对各组分的影响，结果以25℃时所得指纹图谱中峰形和分离度较好。

四、流速的考察；试验比较了流速为0.8mL/min、1mL/min、1.2mL/min所得图谱，结果流速为1mL/min时所得指纹图谱的分离情况和峰形较好；如图4所示。综上所述，金圣卷烟天然添加剂指纹图谱检测条件确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：phenomenexluna C₁₈，4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度为0.1％甲酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为254nm；柱温为25℃。

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录80min图谱，即得。

方法学验证：精密度实验:取批号为090421批的金圣卷烟天然添加剂，按照供试品进行色谱检测的基本步骤进行检测，精密吸取供试品10μL，重复进样6次，记录各共有色谱峰的保留时间和积分面积，通过相似度软件，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。结果见表1，结果表明方法采用的HPLC仪器及整体系统精密度良好，分析结果稳定、可信。

如下表1所示，金圣卷烟天然添加剂指纹图谱精密度考察结果

表1

稳定性试验：取批号为090421批的金圣卷烟天然添加剂，按照供试品进行色谱检测的基本步骤进行检测，同一供试品溶液分别于0h、1h、2h、4h、8h、12h和24h进色谱分析，记录指纹色谱图谱，共测定7个时间点，根据相似度软件，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。结果见表2。结果表明样品在常温实验条件下稳定性较好，在24h时间能保证实验结果的科学可靠。

如下表2所示，金圣卷烟天然添加剂指纹图谱稳定性考察结果

表2

重复性试验：取批号为090421批的金圣卷烟天然添加剂，按照供试品进行色谱检测的基本步骤进行检测，同法制备供试品溶液6份，依法测定。考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。结果见表3。结果表明该方法重复性良好。

如下表3所示，金圣卷烟天然添加剂指纹图谱重现性考察结果

表3

以上方法学考察结果，表明该方法测定金圣卷烟天然添加剂指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。金圣卷烟天然添加剂指纹图谱的建立：13批金圣卷烟天然添加剂指纹图谱的检测；取13批金圣卷烟天然添加剂样品，按照供试品进行色谱检测的基本步骤进行检测，不同批次的金圣卷烟天然添加剂指纹图谱见图5。

对照指纹图谱的获得及共有峰的确定；上述13批样品用药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价软件计算相似度，生成对照指纹图谱，选择13批样品指纹图谱中均存在的色谱峰作共有峰。见图6。13批金圣卷烟天然添加剂指纹图谱相似度计算；采用对照指纹图谱用药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算13批金圣卷烟天然添加剂指纹图谱相似度，结果见表4。

如下表4所示，13批金圣卷烟天然添加剂指纹图谱相似度结果；

表4

上述试验结果表明，以对照指纹图谱为参照计算相似度，13批金圣卷烟天然添加剂指纹图谱相似度均在0.95以上，因此暂定金圣卷烟天然添加剂指纹图谱标准为：供试品图谱应与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。