一种红参中5种皂苷类成分的含量测定方法与流程

本发明涉及到一种红参中人参皂苷类成分的含量测定方法，属中药技术领域，具体的，涉及一种红参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1和人参皂苷Ro五种成分同时测定的含量测定方法。

背景技术：

红参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey的栽培品经蒸制后的干燥根及根茎，秋季采挖，洗净，蒸制后，干燥，是药用历史悠久的传统名贵中药。人参被列为《神农本草经》三十六种上品之一，在历代中医药典籍中也均有记载。本经中称，人参：“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智，久服轻身延年”，是滋补养生保健的必备圣药，其功效长期以来被中医推崇备至。自古代起就有把采集到的野生人参，用煮、蒸、焯等方法进行加工处理，得到熟人参，这种加工方式逐渐演变成以后的红参。红参作为我国传统名贵中药，具有大补元气、复脉固脱、益气摄血的功效，长期以来深受广大人民群众的喜爱。人参皂苷类成分是红参的主要有效活性成分，是衡量红参内在质量优劣的重要标准，目前尚无红参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1及人参皂苷Ro五种人参皂苷类成分同时测定的含量测定方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种红参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1及人参皂苷Ro五种人参皂苷类成分同时测定的含量测定方法。

本发明含量测定方法采用超高效液相色谱法，该方法如下：

色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用BEH C₁₈色谱柱；以乙腈为流动相A，0.05％～0.10％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A：18％→20％；9～11分钟，流动相A：20％→28％；11～40分钟，流动相A保持28％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；

混合对照品溶液的制备

取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Ro对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1对照品80μg、人参皂苷Re对照品60μg、人参皂苷Rf对照品50μg、人参皂苷Rb1对照品150μg、人参皂苷Ro对照品100μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备取红参粉末，过四号筛，0.8～1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流提取1～2小时，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1～2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。

本发明含量测定方法中，流动相B优选为0.05％磷酸；取样量优选为1.0g；测定法中分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液的量优选为1μl，注入液相色谱仪。

本发明含量测定方法最优的技术方案为：

色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用BEH C₁₈色谱柱；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A：18％→20％；9～11分钟，流动相A：20％→28％；11～40分钟，流动相A保持28％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；

混合对照品溶液的制备

取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Ro对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1对照品80μg、人参皂苷Re对照品60μg、人参皂苷Rf对照品50μg、人参皂苷Rb1对照品150μg、人参皂苷Ro对照品100μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备取红参粉末，过四号筛，1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流提取1.5小时，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。

为了验证测定含量方法的稳定性、准确性、专属性及系统适应性，对方法进行了以下方法学验证实验，以确保该含量测定方法可以用于红参的质量控制。

1、仪器与材料

仪器：Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪(双三元泵，DAD检测器)，METTLER AE240电子天平，METTLER AE163电子天平。

对照品：人参皂苷Rg1(中检院，批号：110703～201529)、人参皂苷Re(中检院，批号：110754～201525)、人参皂苷Rf(中检院，批号：111719～201505)、人参皂苷Rb1(中检院，批号：110704～201424)、人参皂苷Ro(中检院，批号：111903～201102)购自中国食品药品检定研究院。

试剂：乙腈为色谱纯(Merck)，水为超纯水(由MILLIPORE超纯水制水机自制)，其它试剂均为分析纯。

2、方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备

取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Ro对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1对照品80μg、人参皂苷Re对照品60μg、人参皂苷Rf对照品50μg、人参皂苷Rb1对照品150μg、人参皂苷Ro对照品100μg的混合溶液，即得。

2.2供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流提取1.5小时，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件

色谱柱：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈(2.1×100mm，1.7μm)

流动相：以乙腈为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序详见表1；流速0.4ml·min^-1，柱温为40℃，检测波长为203nm，对照品溶液与供试品溶液进样量各1μl。

表1流动相梯度洗脱表

含量测定的色谱图见图1，可见各人参皂苷类成分分离良好，待测成分峰附近没有干扰峰，专属性较好。

2.4流动相选择

皂苷类物质紫外吸收非常弱，紫外检测器通常采用203nm波长检测，由于有机羧酸存在末端吸收现象，在203nm波长下基线噪音很大，干扰皂苷类含量测定，所以不选择甲酸、乙酸水溶液或甲酸盐、乙酸盐缓冲盐溶液作为流动相水相。实验摸索过程中考察了乙腈～水、乙腈～0.1％磷酸溶液、乙腈～0.05％磷酸溶液、乙腈～磷酸缓冲盐溶液等不同梯度的洗脱系统，发现用乙腈～水作为流动相时，人参皂苷Ro不能被洗脱分离；选用乙腈～磷酸缓冲盐溶液作为流动相时，人参皂苷Rb1与其他未知色谱峰不易分离，干扰准确测定含量。经反复试验，当采用乙腈～0.05％磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱时，基线平稳，5种人参皂苷分离度良好且峰形较佳。

2.5提取方式的选择

取同一批样品适量，选取80％甲醇作为提取溶剂，分别采用超声、回流两种提取方式进行试验，按拟定色谱条件测定。结果表明采用超声与回流两种提取方式，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Ro的测定结果没有差别，而人参皂苷Rb1的测定结果回流明显高于超声，因此，选用回流作为本实验的提取方式(结果见表2)。

表2不同提取方式五种成分的含量测定结果

2.6提取溶剂的选择

取同一批样品适量，分别以甲醇、80％甲醇、60％甲醇、40％甲醇作为提取溶剂，回流处理1h。结果表明采用80％的甲醇作为提取溶剂五种成分的含量测定结果均较高，因此，选用80％的甲醇作为提取溶剂(结果见表3)。

表3不同提取溶剂五种成分的含量测定结果

2.7提取时间的选择

取同一批样品适量，回流提取时间分别为0.5、1、1.5、2h，按拟定色谱条件测定。结果表明回流1.5h能保证所有成分提取完全，故选择回流提取1.5h(结果见表4)。

表4不同提取时间四种成分的含量测定结果

2.8线性关系考察

精密量取人参皂苷Rg1(浓度依次为：0.01650mg/ml、0.06602mg/ml、0.082520mg/ml、0.1650mg/ml、0.3301mg/ml、0.8252mg/ml)、人参皂苷Re(浓度依次为：0.01323mg/ml、0.02646mg/ml、0.05293mg/ml、0.06616mg/ml、0.1323mg/ml、0.6616mg/ml)、人参皂苷Rf(浓度依次为：0.009568mg/ml、0.01914mg/ml、0.04784mg/ml、0.09568mg/ml、0.1914mg/ml、0.4784mg/ml)、人参皂苷Rb1(浓度依次为：0.02261mg/ml、0.09045mg/ml、0.1809mg/ml、0.4522mg/ml、0.9045mg/ml、2.261mg/ml)、人参皂苷Ro(浓度依次为：0.01202mg/ml、0.04809mg/ml、0.09619mg/ml、0.2405mg/ml、0.4809mg/ml、1.202mg/ml)1μl分别注入液相色谱仪，按“2.3”项下色谱条件测定，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，人参皂苷Rg1在0.01650～0.8252μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝644011x-593.85(r＝0.9999)；人参皂苷Re在0.01323～0.6616μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝488436x+413.18(r＝0.9999)；人参皂苷Rf在0.009568～0.4784μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝779269x～2959.3(r＝0.9999)，人参皂苷Rb1在0.02261～2.2612μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝586991x+1538.7(r＝0.9999)，人参皂苷Ro在0.01202～1.202μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝722156x～955.27(r＝0.9999)。实验结果见表5。

表5红参五成分线性关系考察结果

2.9精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，连续进样6次，记录色谱峰面积。结果显示各人参皂苷色谱峰面积R SD(n＝6)均不大于2.0％。表明本方法的仪器精密度良好(结果见表6)。

表6精密度试验结果

2.10稳定性试验

取同一批样品适量，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，考察0、2、4、6、9、12、24h，结果显示各人参皂苷峰面积R SD(n＝7)均不大于2.0％。结果表明，供试品溶液在24h内基本稳定(结果见表7)。

表7稳定性试验结果

2.11重复性试验

取同一批样品，研细，取0.5g、1.0g、1.5g各三份，精密称定，平行制成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定。结果表明，本方法重复性良好(结果见表8)。

表8重复性试验结果

2.12回收率试验

取已知含量的样品粉末9份，每份约0.5g，精密称定，每三份为一组，分别加入用80％甲醇溶液配制的低、中、高三个浓度的上述5种人参皂苷对照品溶液25ml，按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液。按“2.3”项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表9～13。表明本方法回收率较好。

表9人参皂苷Rg1回收率试验结果

表10人参皂苷Re回收率试验结果

表11人参皂苷Rf回收率试验结果

表12人参皂苷Rb1回收率试验结果

表13人参皂苷Ro回收率试验结果

2.13样品测定

取收集到的红参药材、饮片共15批，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，计算含量，结果见表14。

表14红参样品含量测定结果

附图说明

图1红参中五种人参皂苷类成分含量测定色谱图；

具体实施方式

实施例1

色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用BEH C₁₈色谱柱；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A：18％→20％；9～11分钟，流动相A：20％→28％；11～40分钟，流动相A保持28％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；

混合对照品溶液的制备

取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Ro对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1对照品80μg、人参皂苷Re对照品60μg、人参皂苷Rf对照品50μg、人参皂苷Rb1对照品150μg、人参皂苷Ro对照品100μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备取红参粉末，过四号筛，1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流提取1.5小时，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。

实施例2

色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用BEH C₁₈色谱柱；以乙腈为流动相A，0.10％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A：18％→20％；9～11分钟，流动相A：20％→28％；11～40分钟，流动相A保持28％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；

混合对照品溶液的制备

取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Ro对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1对照品80μg、人参皂苷Re对照品60μg、人参皂苷Rf对照品50μg、人参皂苷Rb1对照品150μg、人参皂苷Ro对照品100μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备取红参粉末，过四号筛，0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流提取1小时，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。

实施例3

色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用BEH C₁₈色谱柱；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A：18％→20％；9～11分钟，流动相A：20％→28％；11～40分钟，流动相A保持28％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；

混合对照品溶液的制备

取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Ro对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1对照品80μg、人参皂苷Re对照品60μg、人参皂苷Rf对照品50μg、人参皂苷Rb1对照品150μg、人参皂苷Ro对照品100μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备取红参粉末，过四号筛，1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流提取2小时，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。

上述实施例均按照药典进行方法学验证，结果显示方法准确可靠、灵敏、专属，各项指标均符合质量控制的要求。