一种长春西汀注射液中维生素C含量的检测方法与流程

本发明涉及分析化学的
技术领域：
，具体地指一种长春西汀注射液中维生素C含量的检测方法。
背景技术：
：长春西汀是从夹竹桃科小蔓长春花提取的一种生物碱的衍生物，其有效成分为阿朴长春胺酸乙酯，长春西汀最早由匈牙利的GedeonRichter药物公司研发并于1978年上市，长春西汀注射液上市以来，因临床效果显著以及安全性和耐受性良好，广泛应用于神经内科、心血管内科、耳科、眼科、神经外科等临床科室，现已成为世界各国脑血管常规用药。长春西汀具有多种作用，能改善大脑代谢、血流量以及血液流变学性质。目前上市的长春西汀注射液中辅料一般为维生素C、焦亚硫酸钠、L-酒石酸、山梨醇、氢氧化钠和注射用水。维生素C作为长春西汀注射液中重要辅料，起到助溶剂和抗氧剂的作用，它能够延缓主成分长春西汀的氧化过程，提高产品的稳定性。但维生素C性质不稳定，在高温条件下易降解，发生氧化反应后容易使溶液颜色变黄，影响产品质量，因此它在长春西汀注射液中的含量变化也应成为该药品的关注重点。目前，《中华人民共和国药典》2015版二部收载的维生素C注射液中维生素C含量的检测方法为滴定法，长春西汀注射液中含有抗氧剂焦亚硫酸钠，对检测结果存在干扰。为此，需要研究简便高效的检测长春西汀注射液中维生素C含量的检测方法，以确保药品的安全性。技术实现要素：本发明的目的就是要提供一种长春西汀注射液中维生素C含量的检测方法，该方法采用HPLC法检测长春西汀注射液中维生素C的含量，检测方法简便易行，专属性强、准确度高，为保证药品的安全、有效、可控提供依据。为实现上述目的，本发明所提供的一种长春西汀注射液中维生素C含量的检测方法，先通过紫外-可见分光光度计进行光谱扫描确定维生素C标准溶液的最大吸收波长λmax；接着配制一组不同浓度的维生素C溶液，在最大吸收波长λmax下通过高效液相色谱仪测定各维生素C溶液的色谱峰面积，绘制维生素C溶液浓度与其对应色谱峰面积的标准曲线，求得线性回归方程；同时在最大吸收波长λmax下通过高效液相色谱仪测定供试品溶液的色谱峰面积，最后计算出供试品溶液中维生素C含量。进一步地，所述确定维生素C标准溶液的最大吸收波长λmax的具体步骤如下：取适量维生素C，加入流动相溶解并定量稀释至浓度为10μg/mL，通过紫外-可见分光光度计在200～400nm范围内进行光谱扫描，确定最大吸收波长λmax。进一步地，所述绘制维生素C溶液浓度与其对应色谱峰面积A的标准曲线具体步骤如下：配制浓度为2.5μg/ml、12.5μg/ml、25.0μg/ml、37.5μg/ml、50.0μg/ml、125.0μg/ml的维生素C溶液，分别取各溶液10μL进样，在最大吸收波长λmax下通过高效液相色谱仪测定各维生素C溶液的色谱峰面积，以维生素C的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，求得到线性回归方程。进一步地，所述供试品溶液中的维生素C含量测定的具体步骤如下：1)称取适量待测长春西汀注射液制剂，制成浓度为25μg/mL的供试品溶液；2)精确称取适量纯维生素C，制成浓度为25μg/mL的对照品溶液；3)分别供试品溶液和对照品溶液取15μl注入高效液相色谱仪中，在最大吸收波长λmax下通过测定供试品溶液和对照品溶液的色谱峰面积；4)根据如下公式计算出供试品溶液中维生素C的含量：式中，C为供试品溶液中维生素C的含量，单位为μg/ml；Ai为供试品溶液的峰面积；Ar为对照品溶液的峰面积；Cr为对照品溶液的浓度，单位为μg/ml。进一步地，所述最大吸收波长λmax为265～282nm。最佳地，所述最大吸收波长λmax为267nm。进一步地，所述高效液相色谱仪测定中色谱柱为InertSustainC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。进一步地，所述高效液相色谱仪测定中柱温为25～35℃。进一步地，所述高效液相色谱仪测定中流动相为醋酸铵溶液与乙腈按体积比为35:65～45:55的混合液，所述醋酸铵溶液的浓度为0.2mol/L，流速为1ml/min。进一步地，所述高效液相色谱仪测定中定量方法采用外标法。与现有技术相比，本发明具有如下优点：其一，本发明采用HPLC法检测长春西汀注射液中维生素C的含量，所述流动相与长春西汀注射液有关物质检测用流动相相同，焦亚硫酸钠等其他辅料在此检测条件下无吸收，检测方法简便易行，专属性强、准确度高，为保证药品的安全、有效、可控提供依据。其二，本发明的测定方法耐用性好，波长、流速等的微小变化对含量测定影响不大，根据长春西汀注射液中各组分在色谱柱固定相和流动相之间分配系数的差别，不同色谱柱均能使维生素C色谱峰与其他色谱峰之间达到较好的分离。其三，在本方法中维生素C经氧化破坏后的降解产物保留时间之前的峰为维生素C降解峰，可见降解产物峰与主峰的分离度良好，不干扰样品的测定，专属性好，但维生素C稳定性较差，高温、碱、氧化等条件都会导致其降解。其四，本发明的方法简便易行，结果重现性好，灵敏度高，检测限为0.0301ng；加标回收率稳定，回收率在100.6％～102.92之间，可为维生素C在长春西汀注射液中的含量变化提供关键的技术支持。附图说明图1为本发明实施例1的紫外-可见光谱扫描示意图；图2为本发明实施例2的维生素C的标准曲线；图3为本发明实施例4中专属性实验的测试结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1：本发明确定维生素C标准溶液的最大吸收波长λmax的具体步骤如下：取适量维生素C，加入流动相溶解并定量稀释至浓度为10μg/mL，通过紫外-可见分光光度计在200～400nm范围内进行光谱扫描，结果见附图1所示，维生素C在波长267nm处具有最大吸收波峰。实施例2：本发明绘制维生素C溶液浓度与其对应色谱峰面积A的标准曲线具体步骤如下：精密称取维生素C配制成浓度为2.5μg/ml、12.5μg/ml、25.0μg/ml、37.5μg/ml、50.0μg/ml、125.0μg/ml的维生素C溶液，分别取各待测试样溶液10μl进样，在最大吸收波长λmax下通过高效液相色谱仪测定各维生素C溶液的色谱峰面积，各浓度维生素C溶液浓度(μg/ml)与峰面积见表1。高效液相色谱仪的色谱条件：色谱柱为InertSustainC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；最大吸收波长λmax为267nm；柱温为30℃；流动相为醋酸铵溶液与乙腈按体积比为40:60的混合液，所述醋酸铵溶液的浓度为0.2mol/L，流速为1ml/min。表1线性关系考察结果序号123456浓度C(μg/ml)2.512.525.037.550.0125.0峰面积A93172475653994835140348118007054537898以维生素C的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示，以峰面积A对浓度C作线性回归，得线性回归方程：A＝36041C+34228，r＝0.9997，结果表明在2.5～125.0μg/ml范围内，维生素C对照品的浓度与峰面积A线性关系良好。实施例3：本发明测定长春西汀注射液中维生素C含量的具体步骤：1)称取适量样品1～3待测长春西汀注射液制剂，制成浓度为25μg/mL的供试品溶液；2)精确称取适量纯维生素C，制成浓度为25μg/mL的对照品溶液；3)分别供试品溶液和对照品溶液取15μl注入高效液相色谱仪中，在最大吸收波长λmax下通过测定供试品溶液和对照品溶液的色谱峰面积；4)根据如下公式计算出供试品溶液中维生素C的含量：式中，C为供试品溶液中维生素C的含量，单位为μg/ml；Ai为供试品溶液的峰面积；Ar为对照品溶液的峰面积；Cr为对照品溶液的浓度，单位为μg/ml。高效液相色谱仪的色谱条件：色谱柱为InertSustainC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；最大吸收波长λmax为267nm；柱温为30℃；流动相为醋酸铵溶液与乙腈按体积比为40:60的混合液，所述醋酸铵溶液的浓度为0.2mol/L，流速为1ml/min。样品1-3检测所用的长春西汀注射液成分为长春西汀、维生素C、焦亚硫酸钠、山梨醇、L-酒石酸、氢氧化钠和注射用水，其中维生素C理论值含量为0.25mg/ml，每个实施例中维生素C含量检测进行2次平行实验，结果如表2所示。表2维生素C含量检测结果样品1-3中检测结果与理论值0.25mg/ml接近，偏低的原因是由于在生产和储存过程中会消耗部分维生素C。实施例4：本发明测定方法的专属性实验：在实施例3中的色谱条件下，精密量取上述对照品溶液、待测试样溶液、空白溶剂、无维生素C含长春西汀和其他辅料的空白对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，对色谱图中的主要成分峰进行归属并考察选择性，结果如图3所示。对照品溶液色谱图中，维生素C保留时间为1.889分钟；待测试样溶液色谱图中，维生素C峰与其他色谱峰分离度良好；空白对照溶液在维生素C峰相应保留时间处无干扰吸收峰，对含量测定无干扰。实施例5本发明测定方法的精密度试验：1、仪器精密度试验：对照品溶液(浓度为25.0μg/ml)，按上述色谱条件重复进样6次，测定峰面积，结果见表3。表3仪器精密度试验结果*rsd(％)＝标准偏差sd/平均值×100％结果表明，其峰面积测量值的RSD为1.79％，说明仪器精密度良好。2、重复性试验：取本品10支，混合均匀后按“2.3”项下方法平行制备6份待测试样溶液，测定峰面积，按外标法计算本品中维生素C的浓度，结果见表4。表4重复性试验结果(μg/ml)序号123456平均值RSD浓度150.4151.9146.0150.1150.4151.1150.01.37％结果表明，本品中维生素C的浓度为150.0μg/ml，测量结果的RSD小于2.0％，说明该方法重复性良好。3、中间精密度试验：取本品10支，混合均匀后由不同的操作人员按“2.3”项下方法平行制备6份待测试样溶液，测定峰面积，按外标法计算本品中维生素C的浓度，结果见表5。表5中间精密度试验结果(μg/ml)结果表明，不同操作人员测定本品中维生素C浓度为178.8μg/ml，测量结果的RSD小于2.0％，说明该方法中间精密度良好。实施例6本发明测定方法的准确度试验：取本品10支，混合均匀后量取0.5ml于10ml量瓶中，按“实施例3”项下待测试样溶液80％～120％取样量的范围取样，分别加入对照品溶液6ml、5ml和4ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，即平行制备高浓度、中浓度、低浓度待测试样溶液各三份。按上述色谱条件，分别取待测试样溶液和对照品溶液各10μl，进样，记录色谱图，测定峰面积。按外标法计算维生素C的含量，结果见表6。表6维生素C回收率测定结果可见在80％～120％测试浓度的范围内，测定结果的准确度良好。实施例7本发明测定方法的范围：配制三种规格待测试样中维生素浓度分别25μg/ml、41.7μg/ml和50μg/ml，选择最低浓度的80％(20μg/ml)作为低浓度溶液，最高浓度的120％(60μg/ml)作为高浓度溶液，取维生素C对照品适量，平行制备各浓度待测试样溶液三份，精密量取10μl进样，测定峰面积，按外标法计算各待测试样溶液中维生素C的浓度，结果见表7。表7维生素C范围试验结果结果表明，维生素C可以在20μg/ml～60μg/ml范围内取样定量。实施例8本发明测定方法的耐用性试验1、不同检测波长的比较考察检测波长的改变对含量测定结果的影响。使用不同的检测波长(±2nm)，其他色谱条件不变，分别精密量取待测试样溶液及对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定待测试样溶液中维生素C的峰面积，按外标法计算本品中维生素C的浓度，结果见表8。表8耐用性试验-不同检测波长的比较检测波长267nm278nm280nm282nmRSD浓度(μg/ml)179.7174.0174.6171.51.97％结果显示：本品中维生素C浓度的RSD小于2.0％，表明在一定范围内，不同的检测波长对含量测定结果无影响。但因维生素C在波长267nm处具有最大吸收，故最终确定选择267nm作为本方法的检测波长。2、不同流速的比较考察流速的改变对含量测定结果的影响。使用不同的流速(±0.1ml/min)，其他色谱条件不变，分别精密量取待测试样溶液及对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定待测试样溶液中维生素C的峰面积，按外标法计算本品中维生素C的浓度，结果见表9。表9耐用性试验-不同流速的比较流速0.9ml/min1.0ml/min1.1ml/minRSD浓度(μg/ml)169.9174.6173.51.40％结果显示：本品中维生素C浓度的RSD小于2.0％，表明在一定范围内，不同的流速对含量测定结果无影响。3、不同流动相比例考察不同流动相比例对含量测定结果的影响。使用不同流动相比例，其他色谱条件不变，分别精密量取待测试样溶液及对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定待测试样溶液中维生素C的峰面积，按外标法计算本品中维生素C的浓度，结果见表10。表10耐用性试验-不同流动相比例的比较乙腈:0.2mol/l醋酸铵溶液65:3560:4055:45RSD浓度(μg/ml)171.2173.0173.20.64％结果显示：本品中维生素C浓度的RSD小于2.0％，表明在一定范围内，不同的流动相比例均可达到较好的分离，对其含量测定无影响。结论：该检测方法耐用性良好。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，应当指出，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3