专利名称：红参皂苷Rg3组和Rh2组混合皂苷的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种活性高、毒性小，对人体更安全的由红参稀有皂苷20(5)-Rg3、 20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四种组成的Rg3组混合皂苷、由红参稀有皂苷20⑶-Rh2, 20 O ) -Rh2, Rk2和他3等四种组成的Μι2混合皂苷的制备方法。
背景技术：
人参皂苷2OC )-Rg3、2O0 )-Rg3、Rkl 和 Rg5 等四种，20 C )-Rh2、20 O )-Rh2、Rk2 和Μι3等四种是红参中存在的红参稀有皂苷。红参加工过程中白参的原人参二醇类的Rbl、 Rb2、Rc或Rd在人参自身酶与其他物质的作用下转化为20 C ) -Rg3和20 O ) -Rg3皂苷，进一步脱水20⑶-Rg3和20 O ) -Rg3皂苷的20-碳上的羟基，形成顺反结构的Rg5和Wd皂苷， 形成Rg3组皂苷。同样，红参加工过程中白参的原人参二醇类的Rbl、Rb2、Rc和Rd在人参自身酶与其他物质的作用下转化为20(5)-他2、20 0 )-他2、Rk2和他3皂苷，形成他2组皂苷(发明专利ZL 200510136799.8 高活性红参的制作方法)。Rg3组和诎2组混合皂苷比Rg3、Rg5、Rh2, Rh3单体皂苷对人体更安全，毒性少； Rg3组和他2组中四种结构相似的皂苷起协同作用，比单体皂苷生理活性更高，对人参制品、保键食品和化妆品以及药物开发意义很大。但是从红参中分离提取由20(5)-Rg3、 20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四种皂苷组成的Rg3组皂苷，分离提取由20⑶-Rh2、20 O ) -Rh2、 Rk2,Rh3等四种皂苷组成的Μι2组皂苷，难度很大，迄今为止没有相关报道。
发明内容
本发明是从参根中提取含有人参自身皂苷酶和其他水溶性物质的提取物(不含皂苷、简称人参自身酶及水溶性物质的提取物)，与原人参二醇类Rbl、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物、或者F2皂苷反应，制备活性高、毒性小，对人体更安全的由红参稀有皂苷20⑶-Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四种组成的Rg3组混合皂苷、由红参稀有皂苷 20 C ) -Rh2、20 O ) -Rh2、Rk2和Rh3等四种组成的Rh2混合皂苷。本发明的技术解决方案是一种红参皂苷Rg3组和他2组混合皂苷的制备方法，其特征在于按如下步骤进行
a.人参根(以干物计算)中加入6 10倍的65 80%乙醇，5(T75°C提取皂苷，重复2 3次； 提取皂苷后的滤渣中再加入6 10倍水(以干物计算)，6(T80°C提取人参自身酶及水溶性物质，重复2 3次；将所提取的人参自身酶及水溶性物质在品温65°C以下减压浓缩、得到波美 58 62度的提取液，既为人参自身酶及水溶性物质的提取物；
b.向所得人参自身酶及水溶性物质的提取物中加入原人参二醇类Rbl、Rb2、Rc或Rd 单体或者其混合物、或者F2皂苷，加入量与人参自身酶及水溶性物质的提取物的重量比是 1 0.广20，所述原人参二醇类Rbl、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物、或者F2皂苷的反应浓度为0.广10% ；反应后分离皂苷。所述b步骤的反应过程中还加有有机酸，有机酸的加入量为反应体积的0. 0 ~50%。本发明工艺方法简单，可从人参根中提取活性高、毒性小，对人体更安全的由红参稀有皂苷20 {$) -Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四种组成的Rg3组混合皂苷、由红参稀有皂苷20 (5·) -Rh2,20 O ) -Rh2,Rk2和诎3等四种组成的Μι2混合皂苷，可广泛应用于人参制品、 保键食品和化妆品以及药物等开发。
图1是本发明实施例lRg3组HPLC检测图谱。图2是本发明实施例lRg3组进行UPLC-Q/T0F检测图谱。图3是本发明实施例lRg3组进行UPLC-Q/T0F检测，ESI+正模式下总离子流图谱。图4是本发明实施例lRg3组进行UPLC-Q/T0F检测，ESI-负模式下总离子流图谱。图5是本发明实施例lRg3组中第一峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。图6是本发明实施例lRg3组中第二峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。图7是本发明实施例lRg3组中第三峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。图8是本发明实施例lRg3组中第四峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。图9是本发明实施例lRg3组中第一峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。图10是本发明实施例lRg3组中第二峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。图11是本发明实施例lRg3组中第三峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。图12是本发明实施例lRg3组中第四峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。图13是本发明实施例2他2组HPLC检测图谱。图14是本发明实施例2诎2组进行UPLC-Q/T0F检测图谱。图15是本发明实施例2他2组中第一峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。图16是本发明实施例2他2组中第二峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。图17是本发明实施例2他2组中第三峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。图18是本发明实施例2他2组中第四峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。
具体实施方式
实施例1
参根中含有人参自身皂苷酶(C Zhang, H Yu, Y Bao, L An, F Jin (金凤燮)伐湖. Pharm. Bull. , 2001，49(7)，795-798. ； Process BioChem. , 2002, 37，793-798·)。本发明从人参根中提取不含皂苷、含有人参自身皂苷酶和其他水溶性物质的提取物(人参自身酶及水溶性物质的提取物)，与原人参二醇类的Rbl、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物反应，制备由2O(5)-Rg3、2O0 )-Rg3、RkU Rg5等四种皂苷组成的Rg3组皂苷；与人参皂苷F2 反应，制备由2O(5)-Rh2、2O0 )-Rh2、Rk2、Rh3等四种皂苷组成的Rh2组皂苷。1、人参根的人参自身酶及水溶性物质的提取物的制备
新鲜人参3. 5公斤(相当于1公斤干参)切成2毫米厚的片，加入8升的95%的乙醇，在 50-60°C提取人参皂苷6小时，分离提取液；其渣中再加入8升的70-75%的乙醇提取，共提取3次；合并乙醇提取液，用于制备人参皂苷。人参皂苷提取过的渣中加入8升水，在75°C 以下提取6小时，同样方法共提取3次；合并提取液，品温在60°C以下减压浓缩至波美60 度，离心除渣、得到200-300毫升人参自身酶及水溶性物质的提取物，用于Rg3组和他2组红参皂苷的制备。也可以用生晒干燥人参切成2毫米厚片的1公斤生晒干燥人参中，加入8升的 70-75%的乙醇，在50°C提取人参皂苷6小时；同样方法共提取3次；合并乙醇提取液，用于制备人参皂苷。人参皂苷提取过的渣中加入8升水，在75°C以下提取6小时，同样方法共提取3次；合并提取液，品温在60°C以下减压浓缩至波美60度，离心除渣、得到200-300毫升人参自身酶及水溶性物质的提取物，用于Rg3组和Μι2组红参皂苷的制备。几次试验，原料可以是人参、也可以是西洋参或者三七参的鲜参或者干参。人参根 (以干物计算)中加入6-10倍的65-80%乙醇、在50-75°C提取皂苷，可重复3次；提取皂苷的渣中再加入干渣的6-10倍水在60-80°C提取，重复2-3次；所提取的水溶性物质，在品温 65°C以下减压浓缩，均得到所需要的人参根的复合物酶及水溶性物质提取物。2、Rg3组红参混合皂苷的制备
50克的原人参二醇类的Rbl、Rb2、Rc和Rd混合皂苷加入于300毫升水中，研磨，再加入 100毫升的上述1的人参自身酶及水溶性物质的提取物和600毫升的水，在80°C反应6小时，110°C灭酶0. 5-1小时，几乎所有的原人参二醇类的Rbl、Rb2、Rc和Rd混合皂苷转化为红参皂苷20 (5·) -Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5混合皂苷。其反应液经1升的大孔树脂(HP-20 大孔树脂，日本三菱公司产；或者AB-8大孔树脂，天津南开大学产)柱吸附皂苷，再用8升的水洗掉未吸附的糖和渣；再用6升的75-80%乙醇洗脱皂苷，其洗脱液减压浓缩、干燥得36 克的20⑶-Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5混合皂苷，即得Rg3组红参混合皂苷。几次上述反应中，使用原人参二醇类的Rbl、Rb2、Rc或Rd单体皂苷，其结果与使用 Rbl、Rb2、Rc和Rd混合皂苷效果相同；制备中，人参皂苷的反应浓度0. 1-10%,人参皂苷与人参自身酶及水溶性物质的提取物(人参根干品原料计算)的反应比例(重量)是1 :0. 1-20 倍，反应温度70-120°C，均得到良好的效果。原人参二醇类Rbl、Rb2、Rc和Rd单体或者其混合皂苷可在市场上购买。实施例1所得Rg3组红参皂苷，用高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-Q/T0F)确认。1) Rg3组红参混合皂苷的确认Rg3组红参皂苷测定的高效液相色谱仪，美国waters 2695仪器；检测器，Photodiode Array Detector Waters 2996 ；Knauer C18 色谱柱(250mmX3mm)；流动相，乙腈(A)-水 (B) ；(T35min，19%A 等度；；35 55min，19%A 29%A 线性梯度；55 65min， 40%A 线性梯度； 65 95min，40%A 100%A线性梯度；进样量，10 μ L ；柱温，35°C ；体积流速，0. 6mL/min ；检测波长，203nm。取上述Rg3组混合皂苷2毫克，溶解于1毫升的甲醇中，经0. 45 μ m滤膜过滤，高效液相色谱(HPLC)检测结果，与标准品2O(5)-Rg3、2O0 )-Rg3、Rkl和Rg5皂苷比较，如图 1所示。从图1中可以看到，与标准品皂苷相比较，Rg3组含有2O(5)-Rg3、2O0 )_Rg3、Rkl、 Rg5四种皂苷，总含量90%以上；各皂苷含量比(峰面积比)为20⑶-Rg3 :20⑷-Rg3 =Rkl Rg5 = 29 26 :21 :24。2)超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-Q/T0F)核对Rg3组的四种皂苷 超高效液相色谱-质谱联用分析仪UPLC-Q/T0F Premier Micromass (Waters)仪
器；色谱柱BEH shield RP18 (2. 1 X 100mm，1. 7 μ m，Waters)。超高效液相色谱-四级杆串联质谱联用检测在UPLC-Q/TOF PremierTM Micromass (Waters)仪器完成。ESI源，正、 负离子模式下，“V”模式下进行检测。超高效液相色谱(UPLC)检测条件流动相为(A) 0. 1%甲酸-乙腈——(B) 0. 1% 甲酸-水；梯度洗脱(T5min，5%A 95%A线性梯度，5 lOmin，95%A等度。进样量，10 μ L ；流速，0.5 mL/min ；柱温，30°C ；检测波长，203nm。四级时间飞行串联质谱(Q/T0F)检测条件毛细管电压，2. 5kv ；样品孔电压，35v ； 离子源温度，100°c ；脱溶剂气温度，350°C ；锥孔气流速，50L/hr ；脱溶剂气流速，1000L/hr ； 质量扫描范围，IOO-IOOODa0Rg3 组中 20 (S) -Rg3 和 20 O ) -Rg3 皂苷分子式为 C42H72O13 ；分子量为 784 ； Rg5 和 Rkl 分子式，C42H70O12 ；分子量，766。上述的收3组样品进行UPLC-Q/T0F检测，得到的图谱如图2、3、4所示。从图2、3、4中可以看出，收3组样品的UPLC图谱有四个明显的紫外吸收峰，和图 1的HPLC检测的2OC )-Rg3、2O0 )-Rg3、RkU Rg5的紫外吸收峰一致，其保留时间依次为 3. 77,3. 83,4. 43,4. 49 (min)。在正、负离子模式下，通过串联质谱(Q/T0F)检测、得到Rg3 组样品的总离子流图，也有四个峰，其和UPLC图谱有四个明显的紫外吸收峰一致，保留时间分别为 3. 81,3. 87,4. 46,4. 51 (min)。由此，可以进行总离子流各峰的一级质谱分析，确定Rg3样品中各物质的分子量。(1) Rg3组人参稀有皂苷在ESI+正模式下的一级质谱分析
首先对Rg3组第一、第二的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图5、6所示。20C )-Rg3和2O0 )-Rg3的分子量为784 ；从图5、6中可以看出，在ESI+正模式下，使第一、第二峰物质分子上加了一个H，形成了 m/z为785的准分子离子峰，即[M+H]+。 m/z767离子是为m/z785离子峰失去一分子H2O产生的碎片；m/z 605离子为m/z785离子峰失去末端的葡萄糖基，再失去一分子H2O产生的碎片；m/z461离子为m/z785离子峰失去两个葡萄糖基所产生的碎片；m/z443、m/z425、m/z407离子为m/z461碎片再依次失去一分子吐0产生的碎片；因此第一、第二峰物质的分子量为784 ；可确定为第一峰为20(5)-Rg3 ； 第二峰为 2O0 )-Rg3。再对Rg3组的第三、第四离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图7、8所示。Rkl和Rg5的分子量为766 ；从图7、8中可以看出，在ESI+正模式下，使第三、第四峰的物质的分子加上了一个H，形成了 m/z为767的准分子离子峰，即[M+H] +。m/z785离子峰归属于ESI+模式下形成的[M+H20] +。m/z749离子是m/z767离子峰失去一分子H2O所产生的碎片；m/z 605离子为m/z767离子峰失去末端的葡萄糖所产生的碎片；m/z587离子是 m/z605离子峰再失去一分子H2O所产生的碎片；m/z443离子是m/z767离子峰失去两个葡萄糖基所产生的碎片；m/z425和m/z407离子是m/z443碎片再依次失去一分子H2O所产生的碎片。由此得到第三、第四峰物质的分子量为766 ；可确定为Wd和Rg5皂苷。(2) Rg3组人参稀有皂苷在ESI-负模式下进行一级质谱分析
首先对收3组的第一、第二离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图9、10所示。2OC )-Rg3、2O0 )_Rg3分子量为784 ；从图9、10中可以看出，在ESI-负模式下形成[第一、第二峰物质+HC00H]一离子峰，而负离子模式下又减少一个H，所以通过Q/T0F得到的离子峰m/z 829;其物质丢失一甲基后生成核离子碎片m/z 783。故可判断，样品中含有20⑶-Rg3和20 O ) _Rg3，其分子量为784。再对Rg3组的第三、第四离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图11、12所示。Rkl和Rg5的分子量为766 ；从图11、12中可以看出，在ESI-负模式下，形成[第三、第四峰物质+HC00H]一离子峰，而负离子模式下又减少一个H，所以第三、第四峰得到离子峰m/z 811，其丢失一甲基后生成核离子碎片m/z765。故可判断，样品中含有Wd和Rg5， 其分子量为766。由此重新证明，所制备的Rg3组中含有2OC )-Rg3、2O0 )_Rg3、Rkl和Rg5等四种红参稀有皂苷；结构式分别为
经过几次试验，所制备的Rg3组中20 (5·) -Rg3和20 O ) -Rg3在Rg3组总皂苷中的含量比例的范围20-80%。实施例2
权利要求
1.一种红参皂苷Rg3组和他2组混合皂苷的制备方法，其特征在于按如下步骤进行a.人参根(以干物计算)中加入6 10倍的65 80%乙醇，5(T75°C提取皂苷，重复2 3次； 提取皂苷后的滤渣中再加入6 10倍水(以干物计算)，6(T80°C提取人参自身酶及水溶性物质，重复2 3次；将所提取的人参自身酶及水溶性物质在品温65°C以下减压浓缩、得到波美 58 62度的提取液，既为人参自身酶及水溶性物质的提取物；b.向所得人参自身酶及水溶性物质的提取物中加入原人参二醇类Rbl、Rb2、Rc或Rd 单体或者其混合物、或者F2皂苷，加入量与人参自身酶及水溶性物质的提取物的重量比是 1 0.广20，所述原人参二醇类Rbl、Rb2、Rc或Rd单体或者其混合物、或者F2皂苷的反应浓度为0.广10% ；反应后分离皂苷。
2.根据权利要求1所述红参皂苷Rg3组和他2组混合皂苷的制备方法，其特征在于所述b步骤的反应过程中还加有有机酸，有机酸的加入量为反应体积的0. 0广50%。
全文摘要
本发明公开一种红参皂苷Rg3组和Rh2组混合皂苷的制备方法，是用人参根中提取的不含皂苷、含有人参自身皂苷酶和其他水溶性物质的提取物，与原人参二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rc或Rd单体或者混合物皂苷反应，制备由20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5红参皂苷组成的Rg3组皂苷；与人参皂苷F2反应，制备由20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3红参皂苷组成的Rh2组皂苷。Rg3组和Rh2组混合红参皂苷比Rg3和Rh2等单体皂苷对人体更安全，活性更高，可用于人参制品、保健品和化妆品和其他药物开发。
文档编号C12P33/20GK102352402SQ201110214290
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者金凤燮, 鱼红闪 申请人:金凤燮