人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐联用在制备治疗动脉粥样硬化或高血脂症的药物中的应用的制作方法

本发明涉及药学技术领域，具体涉及人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐联用在制备治疗动脉粥样硬化或高血脂症的药物中的应用。

背景技术：

高脂血症是指血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等。动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，其特点是受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。血液中hdl对as的发生具有保护功能，其作用主要是介导逆胆固醇转运(reversecholesteroltransport，rct)而实现。rct是指将外周组织(包括动脉壁)游离胆固醇经由细胞膜上三磷酸腺苷结合盒转运体al(atpbindingcassettetransportera1，abca1)和清道夫受体-bi(sr-bi)外流，与血浆中载脂蛋白a-i(apo-ai)结合后逐渐形成成熟hdl，通过hdl转运至肝脏代谢，从而达到减轻或逆转as的作用。目前研究认为逆胆固醇转运是机体抗动脉粥样硬化最重要的机制之一，abca1、sr-bi是调控逆胆固醇转运的关键基因。

人参皂苷是一种固醇类化合物，三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。人参皂苷被视为是人参中的活性成分。小檗碱又称黄连素。一种常见的异喹啉生物碱，分子式c20h18no4。它存在于小檗科等四个科十个属的许多植物中。人参皂苷和小檗碱均报道有降血脂作用，但人参皂苷和小檗碱联用后用于降血脂却没有文献报道过。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种高效治疗动脉粥样硬化或高血脂症的药物。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现。

本发明提供一种人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐联用在制备治疗动脉粥样硬化或高血脂症的药物中的应用，所述的人参皂苷选自人参皂苷rb1。

发明人经大量的实验摸索，发现将人参皂苷rb1与小檗碱或小檗碱盐联用能够产生协同的治疗动脉粥样硬化或高血脂症的作用。众所周知，人参皂苷是一种固醇类化合物，三萜皂苷。主要存在于人参属药材中，人参皂苷包含的单体化合物非常多，包括人参皂苷rb1、rb2、rb3、rc、rd、rg3、rh2、人参皂苷re、rg1、rg2、rh1等，在这些化合物中并不是每个化合物都具有降血脂或降胆固醇作用，这需要发明人经实验进行筛选。另外，筛选出来的人参皂苷和哪些化合物联用具有协同治疗动脉粥样硬化或高血脂症的作用，更需要发明人经大量实验进一步筛选确定。

本发明提还供一种人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐联用在制备降胆固醇药物中应用。

发明人经大量的实验摸索，发现将人参皂苷rb1与小檗碱或小檗碱盐联用能够产生协同降胆固醇。

本发明提还供一种人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐联用在制备降低cd36mrna表达的制剂中的应用。

发明人经实验发现将人参皂苷rb1与小檗碱或小檗碱盐联用能够降低cd36mrna表达。

本发明提还供一种人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐联用在制备促进abcg1、abca1、sr-bimrna表达的制剂中的应用。

发明人经实验发现将人参皂苷rb1与小檗碱或小檗碱盐联用能够促进abcg1、abca1、sr-bimrna表达。

在上述应用中，优选地，所述的小檗碱盐选自盐酸小檗碱。

盐酸小檗碱对痢疾杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、金葡菌、链球菌、伤寒杆菌及阿米巴原虫有抑制作用。临床主要用于肠道感染及菌痢等。还可用于抗心律失常的作用。但并无现有技术报道其具有治疗动脉粥样硬化或高血脂症及降胆固醇的作用。本发明的发明人经研究发现，其与人参皂苷rb1联用具有显著的协同治疗动脉粥样硬化或高血脂症及降胆固醇的作用，该研究发现取得了意外的技术效果。除了上述效果外，实施例实验也证明，人参皂苷rb1与盐酸小檗碱联用安全、无毒。

在上述应用中，优选地，所述的人参皂苷rb1和小檗碱或小檗碱盐的质量比为1～10:1～10。更优选地，所述的人参皂苷rb1和小檗碱或小檗碱盐的质量比为1～5:5～10。进一步优选地，所述的人参皂苷rb1和小檗碱或小檗碱盐的质量比为1～3:8～10。最优选地，所述的人参皂苷rb1和小檗碱或小檗碱盐的质量比为1:9。

本发明发明人经大量实验发现，人参皂苷rb1和小檗碱或小檗碱盐在上述比例范围内具有的协同治疗动脉粥样硬化或高血脂症及降胆固醇的作用最好，尤其是人参皂苷rb1和小檗碱或小檗碱盐的质量比为9:1时，效果最佳。

一种药物组合物，包含人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐，所述的人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐的质量比为1～10:1～10。

更优选地，所述的人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐的质量比为1～5:5～10。

进一步优选地，所述的人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐的质量比为1～3:8～10。

最优选地，所述的人参皂苷与小檗碱或小檗碱盐的质量比为1:9。

优选地，所述的药物组合物中，人参皂苷选自人参皂苷rb1，所述的小檗碱盐选自盐酸小檗碱。

优选地，所述的药物组合物，还含有药学上可以接受的载体和/或辅料。

优选地，所述的药物组合物用于治疗动脉粥样硬化或高血脂症，或用于降胆固醇，或用于降低cd36mrna表达，或用于促进abcg1、abca1、sr-bimrna表达。

有益效果：(1)本发明提供了一种防治动脉粥样硬化或高脂血症或将胆固醇的新药物，疗效确切，安全无明显毒副作用，具有良好的应用前景；(2)实施例中动物体内实验表明：人参皂苷rb1与小檗碱及其盐联用可降低apoe-/-小鼠血清tc、tg、ldl-c水平，升高hdl-c水平，减少主动脉瓣部位斑块、胸腹主动脉粥样硬化斑块面积，降低肝脏组织cd36mrna的表达，升高abca1mrna的表达，这些实验表明，其具有优良的防治动脉粥样硬化和高脂血症作用；(3)实施例中的动物实验并且没有观察到明显的副作用，这说明，人参皂苷rb1与小檗碱及其盐联用增加了用药的安全性，达到了减少服用量而不降低药效的目的。

附图说明

图1为不同单体化合物给药12h油红o染色图。

图2为人参皂苷rb1与盐酸小檗碱不同组合给药12h油红o染色图。

图3为参皂苷rb1与盐酸小檗碱及二者组合给药12h油红o染色图。

图4为参皂苷rb1与盐酸小檗碱及二者组合给药对abcg1、abca1、sr-bimrna的表达的影响图(注：与对照组相比，###，p<0.001，与模型组相比，*，p<0.05，**p<0.01)。

图5为不同剂量的参皂苷rb1与盐酸小檗碱组合物对小鼠主动脉油红o染色图。

图6为不同剂量的参皂苷rb1与盐酸小檗碱组合物对小鼠主动脉斑块面积与内膜面积百分比图(**：与模型组比较p<0.01；*：p<0.05)。

图7为小鼠主动脉瓣冰冻切片油红o染色图(10x)。

图8为不同剂量的参皂苷rb1与盐酸小檗碱组合物对肝脏胆固醇转运相关基因表达的影响图(*：与模型组比较p<0.05)。

图9为实施例5中1.3.3.3部分所述的pcr反应条件。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1人参皂苷rb1与盐酸小檗碱联用对raw264.7巨噬细胞泡沫细胞形成的影响

1.1细胞培养，造模

实验中所用细胞为raw264.7巨噬细胞株。制备完全培养基：在高糖(dmem)培养基含10％胎牛血清(fbs)，1％青链霉素混合液。置于含5％co2，37℃的细胞孵育箱中培养。细胞融合达75％时，细胞传代：0.25％胰酶消化1mim，轻轻吹打贴壁细胞，将细胞悬液转移至离心管中，800r/min转速下离心5min。弃上清，加入细胞完全培养液重悬细胞，用吸管将其移至新的培养皿中，置于5％co2，37℃培养箱中培养。

建立泡沫细胞模型：raw264.7巨噬细胞株以1×10⁵接种在24控板上，置于co2培养箱中37℃孵育24h后，待细胞生长状态良好，用含40％fbs的完全培养基孵育5天，每天换液。相应的对照组用含10％fbs的完全培养基孵育5天，每天换液。

泡沫化细胞鉴定：

1)按上述步骤将raw264.7巨噬细胞处理6天后，移除培养基，pbs洗2次；

2)4％多聚甲醛固定10min，pbs洗3次；

3)将油红o原液与纯水按3:2比例混合，静置10min。于滤纸上过滤。将滤液加入皿中，避光染色5min；

4)移除油红o工作液，加入60％异丙醇溶液，洗1次，pbs洗2次；

5)胶水封片，与光学显微镜下观察拍照。

细胞内胆固醇酯含量测定：

1)取出细胞，移除培养基，pbs洗2次。每孔加0.1ml裂解液，吹打混匀，静置10min；

2)取适量上清转移到1.5ml离心管，进行步骤(3)的操作。余下的裂解液用bca法蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定，或-20℃储存待测；

3)70℃加热10min，室温2000g离心5min，取上清液待测；

4)配制工作液、不同浓度标准品；

5)在96孔板中每孔加入190ul工作液+10ul样品(或不同浓度标准品)。37℃反应20min后测定550nm处的吸光度

6)建立标准曲线，计算每mg蛋白中胆固醇(tc)和游离胆固醇(fc)含量。

7)计算细胞内单位蛋白中胆固醇酯含量(ce＝tc-fc)。用ce/tc表示泡沫化程度。

1.2细胞分组及给药

细胞给药：各组给药情况见表1(不同单体化合物给药方案)和表2(人参皂苷rb1与盐酸小檗碱的不同配比给药方案)，其中所述的比例为质量比。

表1.不同单体化合物给药分组方案

表2人参皂苷rb1与盐酸小檗碱的不同配比给药方案

造模成功后，按上述分组给药12h后，行油红o染色操作。

图1结果显示：在相同条件下，来自黄连中的生物碱和来自人参皂苷rb1类均能不同程度降低细胞泡沫化发展，其中人参皂苷rb1组、盐酸小檗碱组细胞泡沫化程度明显低于其它给药组。这说明人参皂苷rb1、盐酸小檗碱具有显著的降胆固醇作用，在治疗动脉粥样硬化方面具有良好的应用与开发前景。

图2结果显示：在相同条件下，盐酸小檗碱与人参皂苷rb1的不同配比均能不同程度降低细胞泡沫化发展。其中盐酸小檗碱：人参皂苷rb1＝9：1时，细胞泡沫化程度明显低于其它配比组。这说明盐酸小檗碱与人参皂苷rb1联用，具有显著的降胆固醇作用，在治疗动脉粥样硬化方面具有良好的应用与开发前景。

实施例2人参皂苷rb1与盐酸小檗碱联用对raw264.7巨噬细胞内胆固醇酯含量的影响

培养液按照实验处理要求不同分为5类，分别对应相应的细胞培养分组：空白组(无fbs培养基)；模型组、人参皂苷rb1与盐酸小檗碱联用组(盐酸小檗碱：人参皂苷rb1＝9：1)、人参皂苷rb1组、盐酸小檗碱。含10％fbs的完全培养基孵育5天后，除培养基，pbs洗2次，4％多聚甲醛固定10min，pbs洗3次，然后将油红o原液与纯水按3:2比例混合，静置10min。于滤纸上过滤。将滤液加入皿中，避光染色5min。移除油红o工作液，加入60％异丙醇溶液，洗1次，pbs洗2次，胶水封片，与光学显微镜下观察拍照。同时测定细胞内胆固醇酯含量，取出细胞，移除培养基，pbs洗2次。每孔加0.1ml裂解液，吹打混匀，静置10min；取适量上清转移到1.5ml离心管，待测；配制工作液、不同浓度标准品；在96孔板中每孔加入190ul工作液+10ul样品(或不同浓度标准品)。37℃反应20min后测定550nm处的吸光度建立标准曲线，计算每mg蛋白中胆固醇(tc)和游离胆固醇(fc)含量。计算细胞内单位蛋白中胆固醇酯含量(ce＝tc-fc)。用ce/tc表示泡沫化程度。

图3结果显示：raw264.7巨噬细胞株可建立泡沫细胞模型，模型细胞培养基上清液中胆固醇酯含量高于对照细胞(p<0.05)。人参皂苷rb1与小檗碱联用可显著减少培养基上清液中胆固醇酯含量，降低细胞泡沫化发展，且优于人参皂苷rb1组和盐酸小檗碱单独给药组，表明人参皂苷rb1与小檗碱联用在减少胆固醇含量以及降低细胞泡沫化发展作用上具有协同效应，在治疗动脉粥样硬化方面具有良好的应用与开发前景。

实施例3人参皂苷rb1与盐酸小檗碱联用对raw264.7巨噬细胞活力的影响

在高糖(dmem)培养基含10％胎牛血清(fbs)，1％青链霉素混合液。置于含5％co2，37℃的细胞孵育箱中培养。细胞融合达75％时，细胞传代：0.25％胰酶消化1mim，轻轻吹打贴壁细胞，将细胞悬液转移至离心管中，800r/min转速下离心5min。弃上清，加入细胞完全培养液重悬细胞，用吸管将其移至新的培养皿中，置于5％co2，37℃培养箱中培养。

raw264.7巨噬细胞株以1×10⁵接种在24控板上，置于co2培养箱中37℃孵育24h后，待细胞生长状态良好，用含40％fbs的完全培养基孵育5天，每天换液。相应的对照组用含10％fbs的完全培养基孵育5天，每天换液。将raw264.7巨噬细胞以1×10⁵个/ml，100μl/孔接种于96孔板中，孵育24h。待细胞完全贴壁后分组培养。按不同组别(人参皂苷rb1与盐酸小檗碱的不同分组参见实施例1表2中的分组)分别加入不含血清的药物、空白培养基继续孵育24h后弃掉培养液，加入含有10％cck-8的无血清dmem培养液，继续孵育4h。用酶标仪测定450nm处的吸光度。每个实验组设置6个复孔，实验重复3次。

细胞存活率＝[(as-ab)]/[(ac-ab)]×100％

as：实验孔(含有细胞培养液、cck-8、药物)

ac：control(含有细胞培养液、cck-8)

ab：blank(不含细胞和药物的培养液、cck-8)

实验结果显示：人参皂苷rb1与盐酸小檗碱联用在0～150um的浓度范围内，对细胞存活率无显著影响(细胞的存活率均≥80％)。这说明，人参皂苷rb1与盐酸小檗碱联用安全、无毒。

实施例4人参皂苷rb1与小檗碱联用对raw264.7巨噬细胞泡沫化模型abcg1、abca1、sr-bimrna的表达的影响

首先提取总rna，取出细胞，弃去培养基，pbs轻轻洗2次。每孔加入0.5mltrizol。室温放置约5min，使样品被充分裂解，将含细胞的裂解液转移至1.5mlep管中，反复吹打至无明显沉淀，室温静置5min；然后加入0.1ml氯仿，剧烈摇动混合至溶液呈乳白色，室温静置5min。12000g，4℃离心15min，小心取出离心管，取上清转移至新的ep管中，切勿吸出白色中间层；加入0.6ml异丙醇(-20℃预冷30min)，颠倒混匀，室温静置10min。12000g，4℃离心10min，倾倒弃去上清，残留少量异丙醇没关系。加入1mldepc水配制的75％无水乙醇，颠倒混匀，7500g，4℃离心5min；小心吸取上清液，切勿触及沉淀。在超净台中开吹风，打开ep管盖，吹风5-10min待乙醇挥发。rna略干后，加入30uldepc水轻轻吹打溶解；用多功能酶标仪进行纯度分析，检测后，od260/od280＝1.7～2.1的rna存于-20℃待用。根据takara公司的primescript^tmrtreagentkitwithgnaeraser说明书操作进行rna的逆转录。

图4结果表明：与对照组相比，模型组促进胆固醇吸收的清道夫受体cd36表达显著升高(p＜0.001)，而促进胆固醇外排的受体：abcg1、abca1、sr-bi表达显著降低(p＜0.001)。通过与模型组比较，人参皂苷rb1与小檗碱联用(1:9)均能显著降低cd36mrna表达，升高abcg1、abca1、sr-bimrna表达(p＜0.01)。

实施例5人参皂苷rb1与小檗碱联用对apoe^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的作用影响

1.材料

1.1药物与试剂

总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇试剂盒，均购自南京建成生物工程有限公司，苏木素-伊红染色套装广州瑞舒生物科技有限公司；阿托伐他汀

1.2实验仪器

cm1900研究型冷冻切片机(徕卡仪器有限公司)，zt-12p生物组织自动脱水机(湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司)，yb-6lf生物组织石蜡包埋机湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司(湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司)，ax10倒置荧光显微镜(德国carlzeissag股份公司)。

1.3实验动物

apoe-/-小鼠，spf级，雄性，体重18-25克，购于广东省实验动物中心。

小鼠基因型鉴定：

1.3.1剪尾：用消毒后的剪刀剪下小鼠尾尖部约1cm,置于1.5mlep管中。剪尾后用手指捏紧小鼠尾端伤口持续几十秒进行止血。剪尾后的小鼠需进行编号，以便鉴定后可以辨认，编号方法如下：小鼠左右前肢各有四个手指。其中右前肢代表个位数，从外向内分别表示1、2、3、4，1指和2指加起来表示5，1指和三指共表示6，依此类推，1和4表示7，二和三表示8，二和四表示9。如该小鼠的编号为6，就剪去右边1指和3指；左前肢代表十位数，从外向内分别表示1、2、3、4，而5、6、7、8、9的表示方法同右前肢，如编号为50，则剪去左前肢的外侧1指和2指，右前肢四个手指均保留。

1.3.2抽提尾部dna：在ep管中将鼠尾用小剪刀剪碎(每剪完一只后用酒精棉球擦拭干净剪刀，防止dna交叉)。向每只ep管中加入500uldna裂解液，10ul蛋白酶k(20mg/ml),充分混匀，置于55℃水浴锅中，过夜。次日早晨，从水浴锅中拿出消化好的鼠尾，离心10000rpm，10min，转移上清。上清用等体积饱和酚，氯仿各200ul抽提，10000rpm，5min，转移上清，再重复一次。上清加入800ul无水乙醇沉淀，轻摇匀，有白色絮状沉淀析出，即为dna。将沉淀离心，4000rpm，5min，弃去上清。用70％的乙醇清洗沉淀，此时沉淀容易从粘附的管壁脱落，用移液器小心吸掉乙醇。自然无尘晾干或放入烘箱内烘干。干燥后，用100ul无菌去离子水溶解，-20℃保存待用。

1.3.3apoe^-/-小鼠dna的pcr

1.3.3.1引物序列：

apoe1:5'-gcctagccgagggagagccg-3'

apoe25'-tgtgacttgggagctctgcagc-3'

apoe35'-gccgccccgactgcatct-3'

1.3.3.2pcr反应体系

按照50ul反应体系配置底物：

1.3.3.3pcr反应条件为：见图9所示。

1.3.4琼脂糖凝胶电泳：取pcr反应产物9ul,加入10×loaddingbuffer1ul,加样于1.5％琼脂糖凝胶孔，于tae电泳缓冲液中电泳(170v,20min)。用凝胶成像系统观察电泳结果，apoe敲除小鼠的扩增产物片段长度为245bp，杂合型小鼠扩增产物片段长度为245bp和155bp，野生型小鼠扩增产物片段长度为155bp。

2方法

2.1高热量饲料的制备

2.2动物分组及处理

50只雄性apoe-/-小鼠，随机分为模型组、组方(小檗碱：人参皂苷rb1＝9：1)低剂量治疗组(zf-l)、组方中剂量治疗组(zf-m)、组方高剂量治疗组(zf-h)、阿托伐他汀治疗组(avt)，每组10只。喂养12周后，灌胃给予相应药物12周，进行药效及药效机制研究。

2.3观察指标

(1)血清：禁食不禁水12小时，乙醚麻醉小鼠，眼眶取血于1.5mlep管，室温静置1小时后，以室温下3500rpm离心15min，分离血清于0.2mlep管中，-80℃保存备用。

(2)灌注：用预冷的pbs缓冲液50ml进行小鼠心脏灌注，输液针头插入小鼠左心室，止血钳固定，剪去小鼠右心耳，缓慢推入pbs缓冲液，灌注过程中小鼠肝脏颜色慢慢转为淡粉色，小鼠头尾剧烈晃动，身体抽搐，说明心脏灌注成功。pbs持续灌注左心室至小鼠的肝变黄白，尽量使小鼠的主动脉内的残余血液冲刷干净。

(3)肝脏：灌注完毕后迅速剥离小鼠肝脏，分离小鼠肝脏，生理盐水洗净，滤纸吸水后称重。切取适量大小的肝组织放入包埋盒，编号，放入4％多聚甲醛固定24h，pbs清洗，乙醇梯度脱水，石蜡包埋后室温保存。剩余部分放入液氮中固化后转置-80℃冰箱。

(4)心脏：迅速剥离心脏，生理盐水洗净，滤纸吸水后称重。装入编号的冻存管，放入液氮中固化后转置-80℃冰箱。

(5)主动脉：左手持镊子夹起小鼠的两肾右手持剪沿脊柱上至心脏口的动脉弓，下至腹主动脉即腹主动脉向左右肾分支处分离出胸腹主动脉。剔除动脉弓处多余脂肪，装入编号的冻存管，放入液氮中固化后转置-80℃冰箱。

小鼠胸腹主动脉粥样硬化斑块面积测定

(1)分离：将分离出的动脉条竖直固定在黑色背景的塑料泡沫上。在放大镜将主动脉外脂质分离干净，用细剪沿腹侧剖开血管。由于主动脉弓部位弯曲，在主动脉弓背部剪开1cm，铺开呈y状并平铺在适当大小的滤纸上。

(2)固定：平铺好的血管连同滤纸一起放入1.5mlep管中用4％的多聚甲醛溶液固定10min。

(3)漂洗：pbs稍漂洗之后带滤纸一起转入另一1.5mlep管中，加入60％异丙醇溶液中浸洗30s。

(4)染色：储备染液为0.5％油红o。用前以储备液：超纯水＝3：2稀释。过滤，24小时内使用。将(3)中的主动脉条转入装有1.2ml60％油红o的1.5mlep管中，避光染色1～1.5h。

(5)脱色、分化：将标本取出放入60％浸润30s。此时斑块呈鲜红色，血管内膜为淡红色。

(6)分析：将标本铺平在载玻片上，然后把整个玻片放在黑色背景的实验台面拍照。照片经ps背景处理后，用image-proplus6.0图片分析软件分析。

(7)在ipp软件中分别统计出主动脉条纵切平铺后的表面积(s1)和被油红o

染成红色的粥样硬化斑块的面积(s2)。计算出s2与s1的百分比值，即可作为评价小鼠动脉粥样硬化严重程度的另一指标。

主动脉瓣部位斑块的测定

(1)包埋：取出小鼠的心脏，用滤纸沾干表面水分，小鼠心脏尖朝下oct包埋剂包埋，将样品连同托盘放到速冻台上迅速冷冻30min，保证包埋剂完全固化。

(2)切片：箱体温度-20℃，切头温度-20℃，切片厚度7um，使用玻片不同位置贴片，在显微镜下观察到主动脉瓣结构出现时，开始连续切片，收集8个切片用于染色，或存于-80℃待用。

(3)染色：将获得的切片放入pbs中1min短暂水化，以洗脱冷冻包埋剂(-80℃冰箱拿出时要先恢复到室温后再进行水化)；60％的异丙醇漂洗30秒后，转入配制好的60％油红o染液中，避光染色处理30min，取出；60％的异丙醇短暂漂洗4min，以洗去切片上多余的染料除去背景染色；流水稍洗后苏木素复染40s，pbs漂洗两次。

待漂洗结束后，将切片置于常温晾干。

(4)封片：甘油明胶封片。(2ml甘油明胶配制：称取0.2g明胶，加入2.6ml蒸馏水，40度水浴溶解后，加入1.4ml甘油。混匀即可。存于4℃待用，用前40度水浴使其变为液态。)

(5)显微镜20倍物镜下拍照。将拍摄到的主动脉根部照片置于imageproplus软件中统计小鼠8个切片斑块面积均值，即视为为该小鼠动脉粥样硬化的面积值。

2.4rt-pcr检测肝脏组织cd36mrna，abcg1、abca1、sr-bimrna的表达。

2.4.1总rna提取

(1)裂解：把肝脏组织迅速从-80℃冰箱取出，称取0.05g，加入1mltrizol。冰上匀浆，室温(15-30℃)静置5分钟，确保裂解液完全裂解组织。12000r/min，4℃离心5min。转移上清至1.5mlep管中；

(2)萃取：加入0.2ml氯仿，剧烈摇动混合至溶液呈乳白色，室温静置5min。12000g，4℃离心15min，小心取出离心管，取上清转移至新的ep管中，切勿吸出白色中间层；

(3)沉淀：加入1.0ml的异丙醇(-20℃预冷30min)，颠倒混匀，室温静置10min。12000g，4℃离心10min，倾倒弃去上清，残留少量异丙醇没关系。加入1mldepc水配制的75％无水乙醇，颠倒混匀，7500g，4℃离心5min；

(1)溶解：小心吸取上清液，切勿触及沉淀。在超净台中开吹风，打开ep管盖，吹风5-10min待乙醇挥发。待rna略干后，加入70uldepc水轻轻吹打溶解；

(2)检测：用多功能酶标仪进行纯度分析，检测后，od260/od280＝1.7～2.1的rna存于-20℃待用。

2.4.2rna的逆转录

根据takara公司的primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser说明书操作。

(1)去除基因组dna的反应

(2)逆转录

反应程序：37℃，15min；85℃，5s；降至4℃。反应完成后，得到cdna(rt产物)，-20℃保存备用。

2.4.3rt-pcr反应

根据takara公司的sybrprimixextaq说明书及上海生工合成的引物操作。

反应程序：预变性：95℃，30s；变性及退火：95℃，5s；60℃，30s；39-40个循环；溶解曲线分析：每0.5℃停留5s。测得的ct值，根据公式△ct＝[ct(目的基因)]-[ct(内参基因)]和△△ct＝[△ct(研究组)]-[△ct(对照组)]，计算出2^-△△ct，得到实验组与对照组相比目的基因表达水平。基因引物序列如下：

β-actin

上游引物：5’-aacagtccgcctagaagcac-3’

下游引物：5’-ctgtgacatccgtaaagacc-3’

cd36

上游引物：5’-gacaaagagaccgcaaatca-3’

下游引物：5’-accaagccaaagaacacacc-3’

abca1

上游引物：5’-aaggggtggtgttcttcctc-3’

下游引物：5’-cctcacatcctcatcctcgt-3’

abcg1

上游引物：5’-gcctactacctggcaaagacc-3’

下游引物：5’-gaacagcacaaaacgcacag-3’

sr-bi

上游引物：5’-gcctgtttgttgggatgaa-3’

下游引物：5’-cttgctgagtccgttccatt-3’

2.5统计学处理

采用spss13.0统计软件进行数据分析。实验数据以平均值±标准差表示，各组间比较采用方差分析，以p＜0.05标示差异有统计学意义。

3结果

3.1人参皂苷rb1与小檗碱联用对apoe^-/-小鼠血脂的影响

与模型组相比，各给药组小鼠血清tc、tg、ldl-c均显著降低(p＜0.01)，hdl-c显著升高(p＜0.05)；各给药组之间，血脂变化没有显著性差异，统计结果无显著性差异。说明人参皂苷rb1与小檗碱联用调节小鼠血脂代谢主要作用与降低tc、ldl-c、tg的含量有关，且调节血脂代谢的作用优于辛伐他汀。

表3.组分药物高低剂量对小鼠血脂的影响(mmol/l)

^**：与模型组比较p<0.01；^*：p<0.05

3.2人参皂苷rb1与小檗碱联用对apoe^-/-小鼠主动脉斑块的影响

如图5所示，c57组小鼠主动脉内膜光滑，无脂质斑块形成。apoe^-/-小鼠模型组主动脉可见大面积的不规则灰黄色斑块或脂质条纹凸起于内膜表面，有部分斑块已经脱落，病灶主要位于升主动脉、主动脉弓、腹主动脉及腹主动脉与肾动脉分支处，严重者主动脉内膜多见脱落斑块，油红o染色后呈现鲜红色，斑块面积与主动脉内膜面积比均值达18％，与c57组相比已形成严重的as病变。各给药组小鼠主动脉内膜病变程都较模型组均有减轻，没有斑块脱落现象，油红o染色后，经统计，如图6所示，人参皂苷rb1与小檗碱联用治疗组和辛伐他汀治疗组主动脉斑块面积占主动脉内膜面积比值均低于模型组(p＜0.05)，人参皂苷rb1与小檗碱联用高剂量组治疗组与辛伐他汀治疗组比较，效果无显著性差异(p＞0.05)。表明人参皂苷rb1与小檗碱联用具有抑制动脉粥样硬化斑块形成的作用。

3.3人参皂苷rb1与小檗碱联用对apoe^-/-小鼠主动脉瓣部位斑块的影响

如图7所示，c57组小鼠主动脉瓣部位冰冻切片，油红o染色现示无明显斑块，模型组斑块形成明显，且斑块脆弱易脱落。各给药组小鼠主动脉瓣部位病变程都较模型组均有减轻，没有斑块脱落现象，油红o染色后，经统计，人参皂苷rb1与小檗碱联用治疗组和辛伐他汀组主动脉瓣部位斑块面积均低于模型组(p＜0.05或p＜0.01)，人参皂苷rb1与小檗碱联用高剂量治疗组与辛伐他汀治疗组比较，小鼠主动脉瓣部位斑块少于辛伐他汀组，统计结果有显著相差异(p＜0.01)。与小鼠动脉内膜斑块面积比值结果一致。表明人参皂苷rb1与小檗碱联用具有抑制动脉粥样硬化斑块形成的作用。

3.4人参皂苷rb1与小檗碱联用对apoe^-/-小鼠肝脏组织cd36mrna，abcg1、abca1、sr-bimrna的表达

如图8可知，同模型组比较，各给药较均能在一定程度上降低cd36表达，其中组方高剂量组和辛伐他汀组具有显著性(p＜0.05)；同模型组比较，各给药较均能在一定程度上升高abca1表达，且各给药组均具有显著性(p＜0.05)；同模型组比较，各给药较均能在一定程度上升高sr-bi表达，其中组方高剂量组和辛伐他汀组具有显著性(p＜0.05)。

根据实施例5所有实验数据可知，人参皂苷rb1与小檗碱联用可降低apoe^-/-小鼠血清tc、tg、ldc-c水平，升高hdc-c水平,降低cd36mrna表达，升高abca1、sr-bimrna表达。以上结果提示，人参皂苷rb1与小檗碱联用可调节血脂水平，减少apoe^-/-小鼠主动脉斑块面积和主动脉瓣部位斑块面积，对动脉粥样硬化、高脂血症具有治疗作用。人参皂苷rb1与小檗碱联用降低cd36mrna表达，升高abca1、sr-bimrna表达，可能是其治疗动脉粥样硬化的作用机制之一。