小檗碱用于促进生成线粒体和改善线粒体功能的制作方法

小檗碱用于促进生成线粒体和改善线粒体功能的制作方法
【专利摘要】本发明涉及小檗碱在制药方面应用，将小檗碱用于促进线粒体生成和改善线粒体功能。小檗碱可促进皮下白色脂肪棕色化，用于增加促进皮下白色脂肪组织、棕色脂肪组织、原代棕色脂肪细胞产热相关基因的表达。
【专利说明】小檗碱用于促进生成线粒体和改善线粒体功能

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药和生理学领域，具体为小檗碱在制药方面应用，将小檗碱用 于促进线粒体生成。

【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的不断提高，肥胖及其相关性疾病如2型糖尿病（T2DM)、心脑 血管病等这些以前常见于西方发达国家的与能量代谢相关的疾病现在越来越成为威胁中 国人群健康的重要疾病。据统计，目前中国成年人中超重和肥胖的发病率分别为30. 6%和 12.0%。如此高的发病率以及各种严重的并发症，使得对肥胖的防治已然成为一项全民性 问题。
[0003] 肥胖的发生是由于机体能量摄入超过能量消耗，基于这一能量代谢平衡原理，限 制能量摄入，或者增加能量消耗，或者两者兼顾显然是治疗肥胖的三种基本策略。然而人们 往往会首选限食来减轻体重，考虑到限食对机体造成的不良影响，增加机体能量消耗无疑 是更为理想的治疗方法。常规增加机体能量消耗的方法是通过运动、体育锻炼增强骨骼肌 收缩、做功来实现。然而在现代高节奏的社会背景下很少有人能进行合理规律的体育锻炼。 因此人们将治疗肥胖的希望寄托于寻找能够增强机体代谢的新型药物上。
[0004] 在人和其他哺乳动物体内有两种不同的脂肪组织，即白色脂肪组织和棕色脂肪组 织。虽然同为脂肪组织，但这两种脂肪组织无论是体内的分布还是本身功能均完全不同。与 白色脂肪组织体内广泛分布不同，棕色脂肪组织主要分布于动物的肩甲区、腹部大血管及 颈部血管周围、肾周、胸部动脉和下腔静脉周围等局限的区域内。
[0005] 以往的观点认为棕色脂肪只存在于新生或幼小的哺乳动物体内，并且会随着年龄 的增长逐渐消失，但近年研究发现在成年哺乳动物体内也有棕色脂肪的存在，而且会随着 外界环境改变而发生相应变化。白色脂肪组织的主要功能是为机体储存能量，除此之外近 年研究发现白色脂肪组织还具有内分泌功能，能够分泌许多具有代谢调节作用的脂肪因 子，如瘦素、脂联素。棕色脂肪虽然早在1551年就已经被人们发现，但直到近几十年人们才 逐渐弄清它的生理功能。1961年始有关于棕色脂肪具有产热功能的报道，然而，将棕色脂肪 与能量代谢及肥胖联系在一起只有20几年时间。白色脂肪组织中的脂肪细胞被体积大小 不一的脂滴所充满，而且这些脂滴会不断的融合成更大的脂滴。而棕色脂肪组织中的脂肪 细胞体积较小，细胞中脂滴体积小且均一，细胞内含有大量线粒体，细胞周围有丰富的毛细 血管，交感神经纤维直接到达棕色脂肪组织的细胞膜上。另外，在棕色脂肪组织细胞的线粒 体内膜上特异表达一种解偶联蛋白，即解偶联蛋白1 (UCP1)。脂肪酸经三羧酸循环在线粒体 内膜两侧形成的质子势能会经过UCP1以热能形式散发，进而促进了能量的消耗。
[0006] 骨骼肌在调控糖脂代谢过程中发挥着重要作用。研究证实在人体内大约80%以上 的葡萄糖要经过骨骼肌转化代谢。这其中大部分直接经糖酵解途径或三羧酸循环分解代谢 生成ATP为机体提供能量，其余以糖原的形式储存在骨骼肌和肝脏中，以备在饥饿或应激 状态下为机体提供血糖。当血液中葡糖糖突然升高时，骨骼肌细胞在胰岛素的作用下可以 快速摄取葡萄糖进而维持血糖水平稳定。当机体处于饥饿状态时，骨骼肌还可以直接利用 脂肪酸、酮体等能量物质，进而为大脑等以葡萄糖为单一能量底物的重要脏器节省葡萄糖。 由此可见，骨骼肌在机体葡萄糖和脂肪酸代谢过程中起着非常关键的作用。
[0007] 研究证实2型糖尿病患者骨骼肌纤维萎缩、肌力下降、胰岛素敏感性降低。另有研 究报道，骨骼肌细胞中线粒体功能障碍在2型糖尿病的发病中起着非常重要的作用。体育 锻炼是目前预防和治疗糖尿病和肥胖的一种非常有效的措施。通过体育锻炼可以促进骨 骼肌细胞增殖，增强肌力，促进肌纤维类型的转换，使酵解型快收缩肌纤维（I型骨骼肌纤 维）数量减少，而氧化型慢收缩肌纤维（II型骨骼肌纤维）增多，加强对葡萄糖、脂肪酸氧 化利用。
[0008] 小檗碱（Berberine，BBR)又名黄连素，是从我国传统中药黄连中提取出来的一种 季胺类生物碱。黄连用于治疗消渴症在我国医药典籍中早有记载。而BBR为黄连的主要成 分一直以其抗感染作用应用于临床。研究证实BBR不但具有较广的抗菌谱，而且对病毒和 真菌感染也有一定作用。上世纪80年代，我国临床工作者在应用BBR治疗胃肠道感染性疾 病过程中发现BBR具有降低血糖的作用。随后几年，同一研究团队开展应用BBR治疗T2DM 的研究并取得了较好的疗效。近年研究发现，BBR具有调节机体代谢的作用。体内和体外 实验均证实BBR能够改善胰岛素抵抗、高血脂等代谢紊乱状态。
[0009] 本发明发现，小檗碱能够增加脂肪细胞、骨骼肌细胞的线粒体，增强其代谢。


【发明内容】

[0010] 本发明旨在提供小檗碱在促进生成线粒体以及提高线粒体功能方面的应用。
[0011] 本发明提供了小檗碱的以下应用：小檗碱在制备促进线粒体生成的药物方面的应 用。所述线粒体为骨骼肌细胞线粒体、棕色脂肪细胞线粒体、白色脂肪细胞的线粒体。
[0012] 小檗碱在制备提高棕色脂肪代谢活性的药物方面的应用。
[0013] 小檗碱在制备改善和促进线粒体功能的药物方面的应用。所述线粒体为骨骼肌细 胞线粒体、棕色脂肪细胞线粒体、白色脂肪细胞的线粒体。
[0014] 小檗碱在制备促进皮下白色脂肪棕色化药物方面的应用。
[0015] 小檗碱用于增加促进皮下白色脂肪组织、棕色脂肪组织、原代棕色脂肪细胞产热 相关基因的表达。
[0016] 小檗碱（BBR)可以促进与棕色脂肪细胞相关基因的表达，明显增强db/db小鼠棕 色脂肪组织代谢活性。BBR在棕色脂肪组织和原代棕色脂肪细胞中可以升高产热相关基因 如UCP1、PGC-1 a，C0X8b和CIDEA的表达。小檗碱可以增强棕色脂肪代谢活性，降低血糖、 血脂水平，改善糖耐量，增加胰岛素敏感性。
[0017] 另外，BBR促进棕色脂肪、白色脂肪及骨骼肌细胞中线粒体生成和功能改善，使白 色脂肪细胞及细胞内脂滴体积明显变小；BBR可促进皮下白色脂肪发生棕色化改变，表现 为细胞中棕色脂肪细胞特异性基因表达明显增加，线粒体生成与功能显著增强；并且直接 促进棕色脂肪细胞能量代谢相关基因表达、线粒体生成与功能改善，使UCP1表达明显增 多。还通过激活AMPK/PGC-la通路增强脂肪细胞和骨骼肌细胞的代谢功能。促进PGC-la 及其他代谢相关因子表达。在C3H10和C2C12细胞中过表达失活型AMPKa亚基，阻断内源 性ΑΜΡΚ作用后小檗碱不再促进PGC-la表达并且对线粒体生成和功能的作用也消失。另 夕卜，在C3H10细胞中BBR可以协同PGC-1 α增加 UCP1启动子的活性，而且这一协同作用依 赖于PGC-1 α分子上的AMPK特异性磷酸化位点。ChIP实验结果显示，在C3H10细胞中小檗 碱能够使UCP1启动子区的PGC-1 α含量明显增加。
[0018] 通过增加机体能量消耗的办法来治疗肥胖是当前研究的热点。本发明证实BBR能 够激活机体的产热机制促进机体能量消耗进而达到减轻体重的效果。增强棕色脂肪组织的 产热活性或使白色脂肪组织获得棕色脂肪组织那样的产热活性是治疗肥胖的一种新策略， 也可以作为目前治疗肥胖的一种良好的补充方法。
[0019] 结果显示，从皮下白色脂肪细胞中分离得到的原代脂肪细胞在体外诱导分化为成 熟的脂肪细胞后在BBR作用下可以表现出棕色脂肪样表型。BBR可以促进皮下白色脂肪 组织及从其原代脂肪细胞的产热相关基因表达，并使其展现出棕色脂肪样表型。经BBR干 预的肥胖小鼠皮下白色脂肪组织中这种棕色化细胞明显增多，这些细胞与经典棕色脂肪细 胞具有相似的表型，即胞内脂滴体积小且呈多房型分布，另外棕色脂肪细胞特异性基因如 UCP1，PGC-1 α，Cidea和DI02表达量明显升高。在BBR干预组小鼠的脂肪组织中由脂肪氧 化在线粒体内膜形成的质子梯度会通过UCP1的介导直接以热能的形式散发。用PET-CT证 明BBR可以增强肥胖小鼠棕色脂肪的代谢活性。
[0020] 转分化是指一种分化成熟的细胞在不经过去分化作用的情况下直接转化为另外 一种表型和功能均不相同的细胞类型。BBR干预组小鼠皮下白色脂肪组织在发生棕色化改 变的同时伴随棕色脂肪特异性基因的表达升高。直接作用于白色脂肪细胞使其向棕色脂肪 细胞转分化是目前治疗肥胖及其相关疾病的新探索。
[0021] 在实验中我们发现，BBR干预组小鼠的内脏脂肪细胞虽然也出现体积缩小的现象， 但整体上并没有发生棕色脂肪细胞样的改变，然而内脏脂肪组织中与能量代谢相关的因子 的基因表明显增高。虽然BBR可以使皮下脂肪组织和内脏脂肪组织中的UCP1的mRNA水平 明显增高，但BBR对UCP1的蛋白水平的促进作用只见于皮下脂肪组织中。我们的实验结果 显示BBR对白色脂肪组织的棕色化作用主要发生在皮下白色脂肪组织中，这具体表现在促 进产热基因及棕色脂肪样分子的表达及向棕色脂肪样细胞表型的转变。
[0022] 我们发现BBR在棕色脂肪组织和原代棕色脂肪细胞中可以升高产热相关基因如 UCP1、PGC-1 α，C0X8b和CIDEA的表达。同时，BBR对皮下白色脂肪组织中的产热相关基因 也有明显的促进作用。研究证实包括转录共激活因子PGC-la在内的多种转录复合体均可 以促进UCP1的表达。PGC-la在棕色脂肪产热活性和增强线粒体生成过程中发挥着非常 重要的作用；PGC-la在棕色脂肪组织高表达而在白色脂肪组织低表达，在白色脂肪组织 中异位表达PGC-1 α可以使白色脂肪组织获得棕色脂肪组织样的特征，包括线粒体生成增 多，脂肪酸氧化和产热相关基因表达增强等。
[0023] 通过原代脂肪细胞及经典脂肪细胞系在体外进行的相关实验显示，BBR对脂肪细 胞具有直接的作用，这一作用与体内的结果相似。这在很大程度上证实了 BBR对脂肪细胞 的直接作用。
[0024] 本发明证实，BBR可以激活或增强机体的产热机制进而表现出有效的减轻体重的 作用。我们进一步的研究发现BBR通过激活ΑΜΡΚ和PGC-la这一调节机体能量代谢的通 路促进UCP1表达的分子机制。通过上述工作我们证实BBR具有增强棕色脂肪组织产热和 促进白色脂肪棕色化的重要作用。这一发现为BBR用于肥胖的治疗打下了良好理论基础。

【专利附图】

【附图说明】
[0025] 图1为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠代谢活性
[0026] 图2为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠棕色脂肪组织所占体重比值
[0027] 图3为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠棕色脂肪组织HE染色结果
[0028] 图4为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠棕色脂肪组织的透射电镜图
[0029] 图5为实施例1中为BBR处理组和对照组小鼠棕色脂肪组织线粒体DNA(mtDNA) 拷贝数
[0030] 图6为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠棕色脂肪组织线粒体生成相关转录因 子及棕色脂肪特异性因子的mRNA水平
[0031] 图7为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠棕色脂肪组织线粒体功能相关因子的 mRNA水平
[0032] 图8为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠棕色脂肪组织脂肪酸氧化代谢相关因 子的mRNA水平
[0033] 图9为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠棕色脂肪组织内UCP1、PGC-1 α、 Ρ-ΑΜΡΚ的蛋白表达量
[0034] 图10为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠的原代棕色脂肪细胞代谢相关因子 mRNA水平
[0035] 图11为实施例1中BBR处理组和对照组小鼠的原代棕色脂肪细胞代谢相关因子 的蛋白表达量
[0036] 图12为实施例2中BBR处理组和对照组小鼠的皮下白色脂肪细胞形态（HE染色）
[0037] 图13为实施例2中BBR处理组和对照组小鼠的皮下白色脂肪细胞的透射电镜图
[0038] 图14为实施例2中BBR处理组和对照组小鼠的皮下白色脂肪细胞的线粒体 DNA(mtDNA)拷贝数
[0039] 图15为实施例2中BBR处理组和对照组小鼠的皮下白色脂肪细胞的棕色脂肪特 异性因子及PGC-la表达量（mRNA)
[0040] 图16为实施例2中BBR处理组和对照组小鼠的皮下白色脂肪细胞的棕色脂肪特 异性因子的蛋白表达量
[0041] 图17为实施例2中BBR处理组和对照组小鼠的原代皮下白色脂肪细胞能量代谢 相关因子mRNA水平
[0042] 图18为实施例2中BBR处理组和对照组小鼠的原代皮下白色脂肪细胞能量代谢 相关因子的蛋白表达量
[0043] 图19为实施例2中不同浓度BBR对C3H10T1/2细胞mtDNA拷贝数的影响
[0044] 图20为实施例2中不同浓度BBR下细胞柠檬酸合成酶（CS)活性（体现线粒体功 能）
[0045] 图21为实施例2中不同浓度BBR对C3H10T1/2脂肪细胞中UCPUPGC-1 a、P-AMPK 等代谢相关因子蛋白表达水平的影响
[0046] 图22为实施例3中BBR处理组和对照组小鼠的内脏白色脂肪组织细胞形态（HE 染色）
[0047] 图23为实施例3中BBR处理组和对照组小鼠的内脏白色脂肪组织细胞能量代谢 相关因子的蛋白水平
[0048] 图24为实施例3中BBR处理组和对照组小鼠的内脏白色脂肪组织细胞能量代谢 相关因子的mRNA水平
[0049] 图25为实施例4中BBR处理组和对照组小鼠的骨骼肌组织中甘油三酯含量
[0050] 图26为实施例4中BBR处理组和对照组小鼠的骨骼肌组织电镜图片
[0051] 图27为实施例4中BBR处理组和对照组小鼠的骨骼肌组织中线粒体DNA拷贝数
[0052] 图28为实施例4中BBR处理组和对照组小鼠的骨骼肌组织中柠檬酸合成酶（CS) 活性（体现线粒体功能）
[0053] 图29为实施例4中BBR对C2C12骨骼肌细胞线粒体拷贝数的影响
[0054] 图30为实施例4中BBR对C2C12骨骼肌细胞中柠檬酸合成酶（CS)活性的影响 (体现线粒体功能）
[0055] 图31为实施例4BBR对C2C12骨骼肌细胞中能量代谢相关因子的影响。

【具体实施方式】
[0056] 所使用的小鼠为：8周龄雄性、健康SPF级C57bl/Ksj_db/+m L印rdb(db/db)小鼠， 购于南京大学模式动物研究所。db/db小鼠饲养条件：环境温度为22±0. 5°C，12小时/12 小时明暗交替。
[0057] 普通饲料由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，基本组成：鱼粉、小麦、玉米、 豆柏、植物油、奶粉、苜蓿草粉、各种维生素、矿物质、必需氨基酸等。普通饲料热量组成为碳 水化合物占65 %、蛋白质22 %、脂肪5 %、纤维和其它成份8 %。每1克饲料含热量3. 3Kcal。
[0058] 实施例1 BBR增强db/db小鼠棕色脂肪组织代谢活性
[0059] db/db小鼠经普通饲料适应性饲养一周后，随机分成溶剂对照组（Vehicle)和小 檗碱干预组（BBR)两组，并按体重、空腹血糖校准。分组后开始给予药物干预，小檗碱干预 组给予Smg+kg-Scf 1小檗碱溶液腹腔注射，空白溶剂对照组给予腹腔注射对照溶剂。
[0060] 给药满4周时开始动物取材。动物禁食16小时后，摘眼球留取血标本，用断颈法 处死小鼠，腹面朝上固定四肢，酒精棉球消毒腹部皮肤，迅速从腹部正中线剪开腹腔，快速 剪取肩胛间区棕色脂肪组织、附睾周脂肪、腹股沟区脂肪、股四头肌、腓肠肌等组织，其中部 分组织放入4%多聚甲醛固定液中固定12-24小时后，做HE染色，部分组织放入2%戊二醛 固定液中固定，行电镜观察。其余组织迅速放入液氮中，后转入负80°C冰箱冻存备用。
[0061] 1、BBR增强db/db小鼠棕色脂肪组织代谢活性
[0062] 研究报道，以2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖（18F-FDG)为示踪剂的PET-CT可以检测 成年哺乳动物体内棕色脂肪组织的代谢活性。因此我们应用此技术对实验小鼠的棕色脂肪 组织进行检测。结果显示，BBR处理组小鼠肩胛间区等棕色脂肪聚集的区域PET-CT信号较 对照组小鼠明显增强。经系统软件分析，BBR处理组小鼠在上述区域示踪剂的标准摄取值 (SUV)明显高于对照组小鼠（vehicle)(图1)。这说明BBR可以增强棕色脂肪的代谢活性。
[0063] 2、BBR对棕色脂肪细胞形态和结构的影响
[0064] 棕色脂肪组织HE染色结果显示，BBR处理组小鼠棕色脂肪细胞体积变小，胞内脂 滴减少（图3)。与此相符，BBR处理组小鼠棕色脂肪组织所占体重的比值低于对照组小鼠 (如图2)。这说明BBR虽然增强了棕色脂肪代谢活性，但并没有使棕色脂肪的总量增加。进 一步，我们应用透射电镜技术对棕色脂肪的亚细胞结构进行了观察。结果显示，BBR处理组 小鼠棕色脂肪细胞内线粒体数量明显增多（图4)。通过检测线粒体DNA拷贝数（mtDNA)的 方法同样证实BBR使棕色脂肪细胞线粒体数量增多的作用（图5,棕色脂肪组织mtDNA拷贝 数的相对水平）。实验数据用均数土标准误表示，BBR干预组小鼠与空白溶剂对照组小鼠 对比，**p < 〇· 01η = 5。
[0065] 3、BBR促进棕色脂肪组织能量代谢相关因子表达
[0066] 为了进一步探讨BBR上述作用的机制，我们检测了棕色脂肪组织中与能量代谢密 切相关的一些因子的表达情况。A-C实时定量PCR(Real-time PCR)分析显示BBR明显升 高棕色脂肪组织代谢相关因子mRNA水平，包括线粒体生成相关转录因子及棕色脂肪特异 性因子（图6)，线粒体功能相关因子（图7)，脂肪酸氧化代谢相关因子（图8)。结果显 示，在BBR处理组小鼠棕色脂肪组织内产热相关基因 UCP1及其他棕色脂肪特异性分子如 CIDEA，C0X8b，lsdp5等表达量明显升高。与线粒体生成密切相关的转录因子，如PGC-1 α、 ERR a、NRF-1在BBR处理组小鼠棕色脂肪组织内的表达水平明显升高。另外，蛋白免疫印 迹（Western-blot)结果显示反映线粒体功能及脂肪酸氧化代谢的相关因子基因的表达 水平也有了显著升高。蛋白免疫印迹结果显示，在BBR干预组小鼠棕色脂肪组织内UCP1、 PGC-1 α、P-AMPK蛋白表达量也明显增多（图9)。实验数据用均数土标准误表示，BBR干 预组小鼠与空白溶剂对照组小鼠对比，*Ρ〈〇. 05, #ρ < 0. 01，< 0. 001，η = 5。
[0067] 4、BBR对棕色脂肪细胞的直接作用
[0068] 以上实验结果显示BBR可以通过促进能量代谢相关因子表达、线粒体生成进而增 高棕色脂肪组织代谢活性。然而，BBR这种作用是对脂肪细胞的直接作用，还是整体作用 后的间接影响呢？为了证实这一点，我们从棕色脂肪组织分离得到其前体原代细胞，并在 体外进行培养并诱导分化，给予BBR(2. 5 μ M)作用24小时后对上述各类代谢相关因子表 达情况进行检测。mRNA水平（图10)和蛋白免疫印迹检测（Western-blot)蛋白表达水平 (图11)结果显示，当BBR直接作用于这种原代棕色脂肪细胞时，上述代谢相关因子在转录 和翻译水平均明显增加。BBR处理组细胞与对照组细胞对比，*P〈0. 05, #p < 0. 01，***p < 0· 001。
[0069] 实施例2 BBR对皮下白色脂肪细胞形态和结构的影响
[0070] 1、BBR对皮下白色脂肪细胞形态和结构的影响
[0071 ] 为了验证BBR对白色脂肪组织能量代谢的作用，我们首先观察了 BBR对皮下白色 脂肪细胞形态和结构的影响。如图12,腹股沟区白色脂肪组织HE染色结果所示，BBR处理组 小鼠皮下白色脂肪组织（IWAT)中脂肪细胞本身及胞内脂滴体积较对照组小鼠明显缩小， 进一步透射电镜结果显示IWAT细胞内线粒体数目明显增多（图13,放大倍数分别为3400 倍和7400倍，箭头所示为线粒体位置）。mtDNA拷贝数检测同样证实在BBR干预组小鼠 IWAT 细胞内线粒体DNA拷贝数明显增加，线粒体数量比对照组小鼠明显增多（图14)。实验数据 用均数土标准误表示，BBR干预组小鼠与对照组小鼠对比，*P〈0. 05, η = 5。
[0072] 2、BBR促进皮下白色脂肪组织中棕色脂肪特异性因子表达
[0073] 我们接着检测了 BBR对皮下白色脂肪组织（IWAT)中代谢相关因子表达的影响。 Real-time PCR检测发现BBR处理组小鼠白色脂肪组织中UCP1等棕色脂肪特异性因子及 PGC-1 α表达量明显升高（图15)。Westenr-blot结果同样证实UCP1、DI02等棕色脂肪特 异性因子在BBR处理小鼠 IWAT中表达明显升高，另外PGC-1 α、P-AMPK等重要的代谢相关 因子以及反映线粒体功能的CytoC，脂肪酸氧化代谢相关的CPT II等的蛋白表达水平在BBR 处理组小鼠的IWAT内均明显升高（图16)。实验数据用均数土标准误表示，BBR干预组小 鼠与对照组小鼠对比，*Ρ〈〇· 05, #p < 0· 01，< 0· 001，η = 5。
[0074] 3、BBR对IWAT细胞的直接作用。
[0075] 为了验证BBR对白色脂肪细胞的直接作用，应用体外诱导分化的原代皮下白色脂 肪细胞检测BBR对棕色脂肪特异性因子表达的影响，BBR明显促进原代IWAT细胞能量代谢 相关因子mRNA(图17)及蛋白（图18)的表达。结果显示BBR在转录和翻译水平均可以促 进这些因子的表达。实验数据用均数土标准误表示，BBR处理组细胞与对照组细胞对比， *Ρ〈0· 05, **p < 0· 01BBR, ***p < 0· 001。
[0076] 4、BBR促进C3H10T1/2脂肪细胞线粒体生成和UCP1表达。
[0077] C3H10T1/2是一种小鼠胚胎来源的间充质干细胞，具有多向分化潜能，可以在体外 不同诱导条件下分化为脂肪、骨骼肌、骨、软骨以及内皮细胞。在本实验中，我们将其体外诱 导分化为脂肪细胞，并以此作为研究BBR影响脂肪组织作用机制的细胞模型。
[0078] 应用免疫荧光染色的方法验证BBR对C3H10T1/2脂肪细胞线粒体生成和UCP1表 达的影响。结果显示，BBR干预组细胞中反映线粒体数量的Mito-tracker红色突光及反映 UCP1表达量的绿色荧光明显增强。另外，BBR可以明显增加 C3H10T1/2细胞中mtDNA拷贝 数（图19,不同浓度BBR对C3H10T1/2细胞mtDNA拷贝数的影响）。为了验证BBR作用下细 胞内增多的线粒体的功能，我们检测了不同浓度BBR下细胞柠檬酸合成酶（CS)活性，以此 来反映线粒体功能。结果显示BBR干预组细胞CS活性明显升高（图20)。进一步，我们通 过蛋白免疫印迹实验证实BBR能够明显增加 C3H10T1/2脂肪细胞中UCP1、PGC-1 α、P-AMPK 等代谢相关因子蛋白水平（图21)。实验数据用均数土标准误表示，BBR干预组小鼠与对 照组小鼠对比，*Ρ〈〇· 05, **p < 0· 01，***p < 0· 001，η = 5。
[0079] 5、BBR协同PGC-1 α增强UCP1启动子活性
[0080] PGC-1 α是一种非常重要的转录共激活因子，它可以通过多种途径调节机体能量 代谢，如控制线粒体生成，促进脂肪酸、葡萄糖氧化代谢，调控骨骼肌纤维类型转化等。研究 报道，PGC-la可以作为UCP1的上游调控因子促进其表达。在本部分实验中我们发现，BBR 在体内棕色脂肪组织和白色脂肪组织，体外原代脂肪细胞及C3H10T1/2脂肪细胞中均可以 明显增加 UCP1和PGC-1 α在转录和翻译水平的表达。那么在BBR促进脂肪细胞UCP1表 达的过程中是不是也需要PGC-la的参与呢？为了证实这一点我们构建了带有UCP1启动 子的报告基因质粒，用脂质体转染的方法将其导入HEK293细胞，然后分别观察BBR、过表达 的PGC-la及两者联合对UCP1启动子活性的影响。结果显示，BBR单独作用并不能使UCP1 启动子活性增强（虽然与对照组相比有略微升高的趋势，但并无统计学意义），而过表达的 PGC-1 α可以明显增强UCP1启动子活性（约为对照组基础值的2倍），当BBR与过表达的 PGC-la联合作用时UCP1启动子活性在过表达PGC-la作用的基础上有了进一步的增强 (约为对照组基础值的3. 5倍）。这说明BBR可以协同PGC-1 α作用于UCP1启动子。
[0081] 实施例3 BBR对内脏白色脂肪（EWAT)组织的影响
[0082] 机体内的白色脂肪组织根据分布部位的不同又可分成皮下白色脂肪组织和内脏 白色脂肪组织。近年的研究证实在胰岛素抵抗及2型糖尿病的发生过程中内脏白色脂肪发 挥着更为重要的作用。因此我们在实验中同时观察了 BBR对内脏白色脂肪的影响。首先， 组织HE染色结果显示，BBR干预组小鼠体内的附睾周围的白色脂肪组织细胞体积明显缩小 (图22)。这说明BBR促进了白色脂肪细胞对其胞内脂肪的消耗。接着我们对能量代谢相 关因子的表达情况进行了检测。结果显示BBR可以明显增加这些因子的mRNA和蛋白的水 平（图23和图24的A、B、C)。实验数据用均数土标准误表示，BBR干预组小鼠与对照组 小鼠对比，*Ρ〈〇· 05, **p < 0· 01，***p < 0· 001，η = 5。
[0083] 值得注意的是，虽然在内脏白色脂肪组织中BBR可以明显增加棕色脂肪特异性分 子UCP1的mRNA水平，但我们在内脏白色脂肪组织中并未能检测到UCP1蛋白水平。然而我 们的结果却显示，在内脏白色脂肪组织中另外一种解偶联蛋白即UCP2的蛋白水平在BBR干 预组有了明显升高。这说明BBR虽然可以激活内脏白色脂肪组织的代谢活性，但并不能有 效促进其棕色化。
[0084] 实施例4 BBR对db/db小鼠骨骼肌组织及体外骨骼肌细胞的影响
[0085] 1、C2C12骨骼肌细胞体外培养及诱导
[0086] 将C2C12成纤维细胞接种于培养皿或细胞培养板中，用含10% FBS和100u/ml青 霉素/链霉素的高糖DMEM培养液（生长培养液）与37°C、5% C02细胞培养箱中进行培养， 当细胞密度达到70-80%左右时即进行传代、铺板，当培养板中细胞密度达90%后，换用含 2%马血清，100u/ml青霉素/链霉素的高糖DMEM培养液（诱导分化培养液），每2天换液 一次，4 一 6天后90%以上的细胞融合成为多核的肌管细胞，此时可用于实验操作。取8? 12代细胞用于实验。
[0087] 2、BBR降低db/db小鼠骨骼肌组织中甘油三酯含量
[0088] 骨骼肌组织中甘油三酯沉积既是引起骨骼肌胰岛素抵抗的原因，又可以视为胰岛 素抵抗在骨骼肌的结果。运动可以改善糖尿病患者的胰岛素抵抗状态，同时可以减少骨骼 肌组织中甘油三酯沉积，增强骨骼肌对胰岛素的敏感性。在我们实验中发现，经BBR干预的 db/db小鼠骨骼肌组织中甘油三酯含量明显低于对照组小鼠（图25)。实验数据用均数土 标准误表示，BBR干预组小鼠与对照组小鼠对比，*P〈0. 05, < 0. 01，< 0. 001，η = 5〇
[0089] 3、BBR促进db/db小鼠骨骼肌线粒体生成和功能改善
[0090] 研究证实骨骼肌细胞线粒体功能与胰岛素抵抗及2型糖尿病的发生具有密切关 系。在前面的实验中我们发现，BBR能够降低糖尿病小鼠血糖，改善糖耐量及胰岛素抵抗， 而且可以促进脂肪细胞线粒体生成。那么BBR对骨骼肌细胞中线粒体会有怎样的影响呢？ 首先，我们的骨骼肌电镜结果显示，BBR干预组糖尿病小鼠骨骼肌组织中的线粒体数量明显 增多（图26)。接着我们应用检测线粒体DNA拷贝数的方法从另一个角度观察BBR对骨骼 肌线粒体生成的影响。结果显示，在BBR干预组小鼠骨骼肌中线粒体DNA拷贝数比对照组 小鼠显著增多（图27)。我们通过检测骨骼肌中柠檬酸合成酶（CS)活性，对骨骼肌线粒体 的功能进行测定。结果发现BBR处理组小鼠柠檬酸合成酶活性较对照组小鼠明显增强（图 28)。实验数据用均数土标准误表示，BBR干预组小鼠与对照组小鼠对比，*P〈0.05, ***p < 0· 001, η = 5。
[0091] 4、BBR对C2C12骨骼肌细胞线粒体生成和功能的影响
[0092] 我们在体外应用C2C12这种骨骼肌细胞模型对BBR促进骨骼肌细胞线粒体生成 和功能的作用进行了验证。白藜芦醇（RSV)和AMPK特异性激动剂AICAR是以被证实的两 种具有促进线粒体生成的药物，因此在本实验中我们用来作为阳性对照。采用不同浓度的 88尺(1、5、1(^]\〇及1?￥(5(^]\〇、4扣41?(50(^]\〇对02(：12细胞线粒体0嫩拷贝数及柠檬酸 合成酶活性的影响如图29和30,实验结果显示，在C2C12细胞中BBR可以明显升高线粒体 DNA拷贝数和CS活性。
[0093] 5、BBR促进C2C12骨骼肌细胞能量代谢相关因子表达
[0094] 我们进一步在体外C2C12细胞中检测BBR对线粒体生成和功能相关的基因以及其 他与能量代谢相关基因表达的影响。结果发现在C2C12细胞中BBR能够明显升高PGC-1 α 这一与线粒体生成和功能密切相关的转录共激活因子蛋白表达水平。如图31，BBR(1、5、 10 μ M)、RSV(50 μ M)、AICAR50 ( μ Μ)明显升高C2C12细胞能量代谢相关因子蛋白表达水平。
[0095] Western-blot结果还显示，BBR可以使ΑΜΡΚ的磷酸化水平明显升高，这说明BBR 在C2C12骨骼肌细胞中能够激活AMPK这一能量代谢调节因子。与此同时AMPK下游的乙酰 辅酶A羧化酶（ACC)磷酸化水（P-ACC)平明显升高，这说明BBR在C2C12可以通过激活AMPK 进而调节糖脂代谢。另外我们的结果还显示，BBR可以使UCP3蛋白表达水平明显升高，这 说明BBR在骨骼肌细胞中可以通过促进解偶联蛋白的表达进而增加细胞的能量消耗。
【权利要求】
1. 小檗碱在制备促进线粒体生成的药物方面的应用。
2. 权利要求1所述的应用，其特征在于，所述线粒体为骨骼肌细胞线粒体、棕色脂肪细 胞线粒体、白色脂肪细胞的线粒体。
3. 小檗碱在制备提高棕色脂肪代谢活性的药物方面的应用。
4. 小檗碱在制备改善和促进线粒体功能的药物方面的应用。
5. 权利要求4所述的应用，其特征在于，所述线粒体为骨骼肌细胞线粒体、棕色脂肪细 胞线粒体、白色脂肪细胞的线粒体。
6. 小檗碱在制备促进皮下白色脂肪棕色化药物方面的应用。
7. 小檗碱用于增加促进皮下白色脂肪组织、棕色脂肪组织、原代棕色脂肪细胞产热相 关基因的表达。
【文档编号】A61P3/10GK104116737SQ201410286441
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】宁光, 张会志, 王卫庆, 张志国 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院