专利名称：20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法
技术领域：
本发明涉及一种三萜类化合物的提取分离方法，具体涉及20(s)_原人参二醇-3-酮的提取分离方法。
背景技术：
肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。刘星堦研究发现人参二醇型皂苷元和人参二醇葡萄糖苷(尤其是人参皂苷Rh2)具有高度细胞毒活性(达玛烷型三萜研究的进展，国外医学·药学分册，1987，3，141-144)。
研究发现20 (S)-原人参二醇-3-酮是俄罗斯学者Morita M.和Atopkina, L. N.等将桦叶烯三醇转化为人参皂苷Rh2及其它人参皂苷化学合成研究中的关键中间产物 (王红燕等，人参化学成分研究的新进展，中国药物化学杂志，1992，2 (I) 64-70)0因此通过 20 (s)-原人参二醇-3-酮合成的化学产物能开发成为抗肿瘤药物的药效物质成分。
目前通常采用合成方法制备20(S)-原人参二醇-3-酮，工艺复杂。周媛媛等首次从青龙衣中分离得到20(s)_原人参二醇-3-酮(周媛媛等，中草药，2010，41(1) :11_14)， 但分离过程复杂，尤其是反复硅胶柱层析过程，需要技术人员的经验判断，不断调整实验参数，不适合工业化生产，且产率较低。发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种步骤明确、且产率较高的20 (S)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种20(s)_原人参二醇-3-酮的提取分离方法，包括以下步骤(O提取取干燥的青龙衣药材，乙醇提取，提取液浓缩得乙醇浸膏；乙醇的浓度为 90% 100%,优选 95% ；(2)萃取分离将步骤(I)中制备的乙醇浸膏加水制备悬浮液，依次采用二氯甲烷萃和乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液浓缩得乙酸乙酯浸膏；(3)硅胶柱层析取步骤(2)中制备的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，依次采用体积比为15:1 10:1 (优选体积比为15:1)的石油醚和乙酸乙酯混合液、体积比为8:1 5:1的石油醚和乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，收集体积比为8:1 5: I (优选体积比为5:1)的石油醚和乙酸乙酯混合洗脱液；石油醚的沸程为60 90°C ；(4)二次硅胶柱层析将步骤(3)中收集的洗脱液进行硅胶柱层析，采用二氯甲烷和甲醇的混合液进行等度洗脱或梯度洗脱；采用等度洗脱时，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为 8:1，收集2. 5个柱体积后的洗脱液；采用梯度洗脱时(优选洗脱方式)，依次采用的体积比为12:1的二氯甲烷和甲醇混合液、体积比为8:1的二氯甲烷和甲醇混合液进行梯度洗脱， 收集体积比为8:1的二氯甲烷和甲醇混合洗脱液；(5)反相柱层析取步骤(4)中收集的洗脱液，进行C18反相柱层析，依次采用30%甲醇和60%的甲醇进行梯度洗脱；收集60%甲醇洗脱液，回收溶剂，即得20(s)_原人参二醇-3-酮。
将20(s)_原人参二醇-3-酮进行甲醇重结晶即得纯度更高的产品。
其中，步骤(I)中乙醇的用量为每克药材采用6 IOml (优选8ml )，优选提取方式米用超声提取O. 5 I. 5h,最佳提取时间50min,反复提取一次,合并提取液。
步骤(2)中混悬液制备时加入蒸馏水的重量为乙醇浸膏的5倍，采用占所述蒸馏水体积的O. 75 I倍量(优选等体积量)的二氯甲烷和乙酸乙酯依次进行两相回流萃取lh。
步骤(3)和步骤(4)中硅胶柱层析均采用干法上样，拌样硅胶采用80 100目硅胶，装柱硅胶采用200 300目硅胶。其中，步骤(3)中乙酸乙酯浸膏与拌样硅胶的重量比为1:1. 5，乙酸乙酯浸膏与装柱硅胶的重量比为1:20 ;步骤(4)中进行柱层析前，先将步骤(3)中收集的洗脱液浓缩至浸膏，浸膏进行干法上样，浸膏与拌样硅胶的重量比为1:1，浸膏与装柱硅胶的重量比为1:30。
步骤(5)中C18反相柱采用预先处理好的体积为2cmX IOOcm的常压敞口玻璃层析色谱柱(C-18反相填料为YMC公司生产，填料粒径彡50// m)，洗脱液流速为lml/min。
本发明相比现有技术具有以下优点本发明提取分离方法采用两次柱层析和一次反相柱层析替代多次反复的柱层析，步骤简略，且每次柱层析的收集段明确，无需进行经验判断，避免了误差和损耗；同时采用二氯甲烷替代氯仿，降低了毒性和对环境的污染。在柱层析分离前依次采用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，分取乙酸乙酯段更加有效地富集了目标化合物的极性段，减少了柱层析的分离步骤。利用本发明提取分离方法能有效制备20 (S)-原人参二醇-3-酮，制备方法简单，步骤明确，适合工业化生产。制得的化合物纯度高，且产率较现有技术提高了一倍。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明20 (S)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法进行详细说明。
实施例一(1)采集当年8月中上旬产核桃青皮，在阴凉通风处晾干后，粉碎，过40目筛，称重5kg。 按药材溶剂=l:6(g/ml)加入浓度为95%乙醇充分混匀后浸泡20min，在35 40°C、40KHz 下超声提取30min，滤过，药渣如上述方法再超声提取I次，合并两次95%乙醇液，减压回收乙醇得浸膏252g。(利用超声提取，能有效减少溶剂、能源等生产成本的消耗，达到对药材资源的充分利用)(2)将252g浸膏按1:5比例用1260ml蒸馏水混悬后放入5000ml圆底烧瓶中，再加入 1260ml 二氯甲烷在40 45°C加热条件下进行两相回流萃取lh，静置放冷后分取二氯甲烷层；剩余水相再加入IOOOml乙酸乙酯在80 85°C加热条件下进行两相回流萃取lh，静置放冷后分取乙酸乙酯层，回收溶剂得乙酸乙酯浸膏A 59. 5g。
(3)用250ml甲醇分散乙酸乙酯浸膏A，按I: I. 5加入硅胶(80 100目)约90g进行拌样蒸干，处理后样品加入按1:20比例取1200g硅胶(200 300目)干法装入常压敞口玻璃层析柱，石油醚(60 90°C):乙酸乙酯(15:1和5:1)进行梯度洗脱，其中石油醚(60 90°C ):乙酸乙酯(15:1)洗脱3. 5个柱体积弃去，石油醚(60 90°C ):乙酸乙酯(5:1)洗脱5个柱体积，收集5:1的洗脱部位，浓缩得浸膏B 16. 2g。
(4)将浸膏B按I: I加入硅胶(80 100目)16. 2g进行拌样蒸干，处理后样品加入按1:30比例取约500g硅胶(200 300目)干法装入常压敞口玻璃层析柱，用二氯甲烷 甲醇(8:1)进行等度洗脱，弃去前2. 5个柱体积后，收集3个柱体积，浓缩得浸膏C 3. lg。
(5)将C加入甲醇45°C加热溶解，滤过，加入预先处理好的体积为2cmX IOOcm的常压敞口玻璃层析色谱柱中(C-18反相填料为YMC公司生产，填料粒径彡50//m)，用30% 甲醇以lml/min流速洗脱，收集前段1500ml洗脱液弃去，然后用60%甲醇洗脱，收集洗脱液3000ml，回收溶剂至干。用甲醇进行重结晶，即得20(S)_原人参二醇-3-酮。制得产品 26mg,纯度为 98. 3%。
实施例二(I)取实施例一中制备的干燥药材5kg。按药材溶剂=l:8(g/ml)加入浓度为95%乙醇充分混匀后浸泡20min，在35 40°C、40KHz下超声提取50min，滤过，药渣如上述方法再超声提取I次，合并两次95%乙醇液，减压回收乙醇得浸膏260g。
(2)将乙醇浸膏按1:5比例用蒸馏水混悬后放入5000ml圆底烧瓶中，再加入等体积的二氯甲烷在40 45°C加热条件下进行两相回流萃取lh，静置放冷后分取二氯甲烷层； 剩余水相再加入等体积的乙酸乙酯在80 85°C加热条件下进行两相回流萃取lh，静置放冷后分取乙酸乙酯层，回收溶剂得乙酸乙酯浸膏A 65g。
(3)用250ml甲醇分散乙酸乙酯浸膏A，按I: I. 5加入硅胶(80 100目)进行拌样蒸干，处理后样品加入按1:20比例取硅胶(200 300目)干法装入常压敞口玻璃层析柱，石油醚(60 90°0:乙酸乙酯(15:1和5:1)进行梯度洗脱，其中石油醚(60 90°C ): 乙酸乙酯(15:1)洗脱3. 5个柱体积弃去，石油醚(60 90°C):乙酸乙酯(5:1)洗脱5个柱体积，收集5:1的洗脱部位，浓缩得浸膏B 18g。
(4)将浸膏B按I: I加入硅胶(80 100目)进行拌样蒸干，处理后样品加入按 I 30比例取硅胶(200 300目)干法装入常压敞口玻璃层析柱，用二氯甲烷甲醇(12:1和 8:1)进行梯度洗脱，其中二氯甲烷甲醇(12:1)洗脱4个柱体积，二氯甲烷甲醇(8:1)洗脱3个柱体积，收集8:1的洗脱部位，浓缩得浸膏C 4g。
(5)将C加入甲醇45°C加热溶解，滤过，加入预先处理好的体积为2cmX IOOcm的常压敞口玻璃层析色谱柱中(C-18反相填料为YMC公司生产，填料粒径彡50//m)，用30% 甲醇以lml/min流速洗脱，收集前段1500ml洗脱液弃去，然后用60%甲醇洗脱，收集洗脱液3000ml，回收溶剂至干。用甲醇进行重结晶，即得20(S)_原人参二醇-3-酮。制得产品 32mg，纯度为 99. 2%。
实施例三(I)取实施例一中制备的干燥药材5kg。按药材溶剂=1:10 (g/ml)加入浓度为90%乙醇中，在35 40°C、40KHz下超声提取I. 5h，滤过，药渣如上述方法再超声提取I次，合并两次90%乙醇液，减压回收乙醇得浸膏269g。
(2)将乙醇浸膏按1:5比例用蒸馏水混悬后放入5000ml圆底烧瓶中，再加入等体积的二氯甲烷在40 45°C加热条件下进行两相回流萃取lh，静置放冷后分取二氯甲烷层； 剩余水相再加入等体积的乙酸乙酯在80 85°C加热条件下进行两相回流萃取lh，静置放冷后分取乙酸乙酯层，回收溶剂得乙酸乙酯浸膏A 68g。
(3)用250ml甲醇分散乙酸乙酯浸膏A，按I: I. 5加入硅胶(80 100目)进行拌样蒸干，处理后样品加入按1:20比例取硅胶(200 300目)干法装入常压敞口玻璃层析柱，石油醚(60 90°C):乙酸乙酯(10:1和8:1)进行梯度洗脱，其中石油醚(60 90°C) 乙酸乙酯(10:1)洗脱2. 5个柱体积弃去，石油醚(60 90°C):乙酸乙酯(8:1)洗脱6. 5个柱体积，收集8:1的洗脱部位，浓缩得浸膏B 18. 6g。
(4)将浸膏B按I: I加入硅胶(80 100目)进行拌样蒸干，处理后样品加入按 I 30比例取硅胶(200 300目)干法装入常压敞口玻璃层析柱，用二氯甲烷甲醇(12:1和 8:1)进行梯度洗脱，其中二氯甲烷甲醇(12:1)洗脱4个柱体积，二氯甲烷甲醇(8:1)洗脱3个柱体积，收集8:1的洗脱部位，浓缩得浸膏C 3.5g。
(5)将C加入甲醇45°C加热溶解，滤过，加入预先处理好的体积为2cmX IOOcm的常压敞口玻璃层析色谱柱中(C-18反相填料为YMC公司生产，填料粒径彡50//m)，用30% 甲醇以lml/min流速洗脱，收集前段1500m l洗脱液弃去，然后用60%甲醇洗脱，收集洗脱液3000ml，回收溶剂至干。用甲醇进行重结晶，即得20(S)_原人参二醇-3-酮。制得产品 27mg，纯度为 97. 8%。
权利要求
1.一种20 (S)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法，其特征在于包括以下步骤 (1)提取取干燥的青龙衣药材，乙醇提取，提取液浓缩得乙醇浸膏；所述乙醇的浓度为 90% 100% ； (2)萃取分离将步骤(I)中制备的乙醇浸膏加水制备悬浮液，依次采用二氯甲烷萃和乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液浓缩得乙酸乙酯浸膏； (3)硅胶柱层析取步骤(2)中制备的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，依次采用体积比为15:1 10:1的石油醚和乙酸乙酯混合液、体积比为8:1 5:1的石油醚和乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，收集体积比为8:1 5:1的石油醚和乙酸乙酯混合洗脱液；所述石油醚的沸程为60 90°C ; (4)二次硅胶柱层析将步骤(3)中收集的洗脱液进行硅胶柱层析，采用二氯甲烷和甲醇的混合液进行等度洗脱或梯度洗脱；采用等度洗脱时，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为8:1，收集2.5个柱体积后的洗脱液；采用梯度洗脱时，依次采用的体积比为12:1的二氯甲烷和甲醇混合液、体积比为8:1的二氯甲烷和甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比为8:1的二氯甲烷和甲醇混合洗脱液； (5)反相柱层析取步骤(4)中收集的洗脱液，进行C18反相柱层析，依次采用30%甲醇和60%的甲醇进行梯度洗脱；收集60%甲醇洗脱液，回收溶剂，即得20 (s)-原人参二醇-3-酮。
2.根据权利要求I所述的20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法，其特征在于所述步骤(3)中梯度洗脱依次采用15:1的石油醚和乙酸乙酯混合液、体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯混合液进行洗脱，收集体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯混合洗脱液。
3.根据权利要求I所述的20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法，其特征在于所述步骤(4)中进行硅胶柱层析时，先将步骤(3)中收集的洗脱液浓缩至浸膏，干法上样，硅胶柱中硅胶的重量为上样浸膏重量的30倍。
4.根据权利要求I所述的20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法，其特征在于所述步骤(I)中乙醇的用量为每克药材采用6 10mL，采用超声提取O. 5 1.5h，反复提取一次，合并提取液；所述步骤(2)中混悬液制备时加入蒸馏水的重量为乙醇浸膏的5倍，采用占所述蒸馏水体积的O. 75 I倍量的二氯甲烷和乙酸乙酯依次进行两相回流萃取Ih ；所述步骤(5)中洗脱液的流速为lmL/min。
5.根据权利要求4所述的20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法，其特征在于所述步骤(I)中乙醇的浓度为95%，用量为每克药材采用8毫升，采用超声提取50min，反复提取一次，合并提取液。
6.根据权利要求I所述的20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法，其特征在于所述步骤(5)制备的20 (s)-原人参二醇-3-酮采用甲醇进行重结晶，即得产品。
全文摘要
本发明公开了一种20(s)-原人参二醇-3-酮的提取分离方法，将干燥的青龙衣药材通过乙醇提取，二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取、两次硅胶柱层析和一次反相柱层析，得到纯化的20(s)-原人参二醇-3-酮目标化合物。利用本发明提取分离方法能有效制备20(s)-原人参二醇-3-酮，制备方法简单，步骤明确，适合工业化生产。且制得的化合物纯度高，产率高。
文档编号C07J9/00GK102977176SQ20121056055
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者周媛媛, 于莹, 付蕾 申请人:黑龙江中医药大学