一种用于鉴定中药人参的引物对及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药人参的引物对及其应用。
背景技术：
：人参属植物药材的鉴定方法主要有形态鉴定、理化鉴定、细胞鉴定等，这些传统的鉴定手段由于易受环境条件的影响或植物本身的限制，认为干扰因素较多，无法直接体现种质的遗传特征，有时难以得到准确的结果。人参类中药的鉴定是研究中药品种、质量，制定中药标准，寻找和扩大药源的前提和基础。中药四大传统鉴定方法为基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型。从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在dna序列上的差异。因此，对基因组序列差异的比较研究无疑为植物分类和鉴定提供了本质依据。随着生命科学不断取得重大突破，分子生物学鉴定方法应运而生，此类方法应用dna分子标记技术鉴定中药源植物及其药材和饮片，取得了快速发展。从1994年ap-pcr首次用于人参、西洋参的鉴别以来，dna分子标记鉴别应用于参类药材鉴别已有不少的报道，rflp、ssr、rapd、ap-pcr、aflp、issr、snp等技术相继应用于参类药材的鉴别鉴定。然而，这些技术由于存在着操作步骤繁琐、工作量大、试验结果重复性差等弱点，难以在实际中得到应用而逐渐退出舞台。随着分子生物学的发展和后基因组时代的到来，一些新的技术为参类药材的鉴定提供了新的方法。但是现有技术中人参鉴定的条形码通用性差，区分不同变异品种的能力差，且在植物中dna条形码的研究进展相对缓慢，目前尚处于对所提议的各片段比较和评价阶段，还未获得一致的标准片段。技术实现要素：本发明的目的是：为了克服现有技术中的缺陷，获得一种通用性好，特异性好，灵敏度高的引物对，本发明提供了一种用于鉴定中药人参的引物对及其应用。技术方案：一种用于鉴定中药人参的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。优选的，所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。表1引物对及发卡结构序列名称序列(5，-3，)seqidno.p1-fgcgtttcttttcctccgct1p1-rggaggagaagtcgtaacaag2p2-fcggttatgcatgaacgtaatgctc3p2-rcgctggtggattcacaaatc4p3-fgcataacaataccggggtcatt5p3-rggccagtcatggcaggag6发卡结构cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物对在制备鉴定中药人参试剂盒中应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。优选的，所述试剂盒鉴定中药人参的步骤包括：(1)提取人参样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。进一步的，所述人参样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。进一步的，所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。有益效果：(1)本发明所述引物对具有通用性好，能够区分变异品种的人参；(2)本发明所述引物对特异性好、灵敏度高。附图说明图1是实施例1～3pcr鉴定结果电泳图；其中m为分子量为2000的maker；1为实施例1pcr产物鉴定结果；2为实施例2pcr产物鉴定结果；3为实施例3pcr产物鉴定结果。具体实施方式实施例1一种用于鉴定中药人参的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药人参试剂盒中应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。优选的，所述试剂盒鉴定中药人参的步骤包括：(1)提取人参样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述人参样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。实施例2一种用于鉴定中药人参的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药人参试剂盒中应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。优选的，所述试剂盒鉴定中药人参的步骤包括：(1)提取人参样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述人参样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。实施例3一种用于鉴定中药人参的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药人参试剂盒中应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。优选的，所述试剂盒鉴定中药人参的步骤包括：(1)提取人参样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释60倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述人参样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。sequencelisting<110>苏州市李良济健康产业有限公司<120>一种用于鉴定中药人参的引物对及其应用<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1gcgtttcttttcctccgct19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ggaggagaagtcgtaacaag20<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3cggttatgcatgaacgtaatgctc24<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4cgctggtggattcacaaatc20<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5gcataacaataccggggtcatt22<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6ggccagtcatggcaggag18<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列<400>7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40当前第1页12