专利名称：一种从中药三七中提取纯化总皂苷的制备方法
技术领域：
本发明属于医药领域，具体而言是涉及从中药三七中经过提取、精制，获得三七总皂苷。
背景技术：
目前，在全球范围内，中草药都有广阔的市场，随着人们对健康要求认识水平的增高以及人口的老龄化，亚健康状态化，人们更加渴望回归自然，利用天然植物治疗、预防一些化学合成药物难以解决的疾病。从天然药物中寻求副作用小、且物美价廉的药物成为世界各国医药企业所追逐的目标。欧共体对草药进行了统一立法，加拿大和澳大利亚等国草药地位已经合法化，美国政府也已起草了植物药管理办法，开始接受天然药物的复方混合制剂作为治疗药，这些为中药作为治疗药物进入国际医药市场提供了良好的国际环境。另一方面，随着全球经济一体化进程的加快，特别是我国正式加入WTO，中国医药市场融入国际医药大市场的广度和深度将进一步加大。面临强大跨国医药集团的激烈竞争以及日本、韩国、印度、泰国等亚洲国家传统医药产品和德国、法国等欧洲国家植物药的巨大冲击，我国传统中药产生的众多产品由于尚不能符合国际医药市场的标准和要求而被拒之门外。
三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根。中医认为，其味甘、微苦，性温，归肝、胃经。具有散瘀止血，消肿定痛之功效，适用于治疗咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛等。现代研究表明，三七中主要含人参皂苷(Ginsenosides)Rb1、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rh，20-O-葡萄糖人参皂苷Rf，三七皂苷(Notoginsenoside)R1、R2、R3、R4，七叶胆皂苷(Gypeno-side)X VII，尚含人参皂苷Rb2。还含挥发油，有α-及β-愈创烯(α-，β-guaiene)，另外有α-古巴烯(α-copaene)、δ-愈创烯、花柏烯(cuparene)、α-，β-，γ-榄香烯(α-，β-，γ-elemene)、α-依兰油烯(α-muurolene)、α-古芸烯(α-gurjunene)、十六酸甲酯、十六酸乙酯、十七碳二烯酸甲酯、十八碳二烯酸乙酯、邻苯二甲酸二叔丁酯(benzene-diformic acid ditert-butylate)、十八碳二烯酸、异丙苯、环十二碳酮(cy-clodode-canone)、1-甲基-4-过氧甲硫基[2，2，2]辛烷、十四烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、廿烷、廿一烷、廿二烷等。水提取液中含一种具止血活性的三七素(N-oxalo-L-α，β-diaminopro-pionic acid)。另含槲皮素、三七黄酮B、β-谷甾醇、β-谷甾醇-D-葡萄糖苷、蔗糖。三七中的皂苷类成分是目前研究最多，药效活性最为显著的成分，具有强心，收缩血管，缩短凝血时间及凝血酶原形成时间的作用，现已用于治疗出血性紫癜。对血压的影响是先升高后使之下降。大剂量能扩张血管，增加冠状动脉血流量，减慢心率，减少心肌耗氧量，现已用于治疗冠心病。
目前，从三七中制备总皂苷的工艺尚有一些文献及专利报道，但总体而言，存在工艺步骤繁琐，产物纯度不高，质量控制水平低下三方面不足。
现有技术从三七中制备总皂苷的步骤较为繁琐或关键步骤技术要求较高，难以实现工业化生产或生产成本太高。如专利1(CN01108591.6)所公开的方法为了去除三七中的糖类、黄酮类以及色素等物质，使用了大孔树脂和离子交换树脂两种类型的树脂，工艺复杂，经过提取、澄清、脱色、脱糖、喷雾干燥等多道步骤；专利2(CN93105774.4)更是采用了浸泡、粉碎、浸提、精滤、浓缩、层析、脱色、过滤、浓缩、干燥等十道工序，并且先后使用了氧化铝和活性炭两种脱色剂，干燥则使用了丙酮干燥和真空干燥；专利3(CN02131193.5)所公开的方法使用了季胺基树脂进行纯化。工艺步骤繁多不但会导致产物损失增加、得率下降，也会影响到工业化生产效率，提高生产成本。专利4(CN200410091532.7)所公开的方法则使用了制备型高效液相色谱仪进行分离。制备液相等要求较高的生产条件现阶段不可能在工业生产中推广运用。本发明所公开的方法简便，可操作性强，只需提取后经大孔树脂纯化即可，利于大规模生产运用，并且能够大幅降低生产成本。
此外，现有工艺技术制备三七总皂苷存在纯度不高，产品质量标准低等问题。中华人民共和国药典(2005版第一部)中规定三七中总皂苷的含量测定采用的是高效液相色谱法，相对于传统的紫外分光光度法，其准确度和专属性均优，而专利1(CN01108591.6)采用传统的紫外分光光度法来对总皂苷质量进行评价，而仅用高效液相法对其中Rg1，Rb1，R1三个单体皂苷进行含量测定。专利2(CN93105774.4)和专利3(CN02131193.5)中使用高效液相色谱法测定产品中皂苷含量分别为88％和60％，可控成分含量不高，这必然影响三七总皂苷在临床用药的安全性和有效性，也不利于突破进入国际市场的技术壁垒。本发明所公开的方法在简单工序的基础上实现了高纯度、高产率，使用高效液相法测定总皂苷，纯度可达95％，总皂苷从药材到产物中的转移率在90％以上。尤其是在大孔树脂纯化过程中，经过大量的实验证明，样品上样后采用一定浓度的氨水溶液冲洗，能有效除去酚性成分，极大地提高了总皂苷的含量(经实验证明，总皂苷含量能从80％提高到95％)。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种从中药三七中提取纯化总皂苷的制备方法，包括药材用醇水溶液提取，提取液浓缩用大孔吸附树脂柱分离的步骤。
具体通过以下技术方案实现(1)三七药材粉碎成过20目筛的粉末或粒径小于1cm的颗粒，去除杂质，烘干，用含浓度为0-95％的乙醇水溶媒渗滤，超声，热回流提取，溶剂用量5-20倍量，提取1-3次，每次0.5-2小时，提取液减压浓缩富集；(2)浓缩液上D101大孔树脂，依次以水、氨水、醇水洗脱，先用水冲洗3-6个柱体积(BV)，再用0.05％-3％氨水冲洗3-6BV，再用水冲洗至pH＝7，最后用20-80％乙醇洗脱4-8BV，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得三七总皂苷精制物。
步骤(1)中三七药材粉碎成粒径1mm-10mm的颗粒状，以含浓度为30-95％的乙醇水溶媒渗滤，溶剂用量6-15倍量，热回流提取1-2次，每次1-2小时。
步骤(1)中，三七药材粉碎成3mm-8mm的颗粒状，以含浓度为65-75％的乙醇水溶液，溶剂用量10-12倍量，热回流提取2次，每次2小时。
步骤(2)中样品上D101大孔树脂，先用水冲洗4-6个柱体积，再用0.05％-1％氨水冲洗4-6个柱体积，再用水冲洗至pH＝7，再用20-30％乙醇冲洗3-5个柱体积，最后用60-80％乙醇洗脱3-6个柱体积，收集洗脱液，回收溶剂得三七皂苷精制物。
步骤(2)中，样品上样后，先用水冲洗4-5个柱体积(BV)，再用0.05-0.1％氨水冲洗4-5BV，再用水冲洗至pH＝7，再用20-30％乙醇冲洗4-5BV，最后用60-70％乙醇洗脱5-6BV，收集洗脱液，浓缩，干燥，得三七总皂苷精制物。
按照本发明的方法制成的三七总皂苷，可制成片剂、胶囊、注射剂等多种药剂学上所说的剂型，也可配合其它药物或组分一起制成制剂使用。
本发明所述方法的有益之处在于所述方法操作简便，提取只需乙醇水溶液，分离只需使用一次大孔树脂柱；终产物三七总皂苷纯度高，可达95％以上；在过大孔树脂柱时，以氨水冲洗，能有效去除三七中黄酮、酚酸类成分，提高皂苷得率(总皂苷得率从80％提高到95％以上)；对总皂苷中5个主要成分R1，Rg1，Re，Rd，Rb1以HPLC进行含量测定，同时HPLC指纹图谱分析结果证明产品稳定性和均一性良好。本发明方法设计合理，低成本、易操作、稳定性好、质控更严格、易于产业化生产。
图1为五种三七中含量最高的单体皂苷进行定量分析。
具体实施例方式
本发明结合实施例作进一步的说明，应该理解下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例一取三七药材粗颗粒(粒径约1cm)500g，50℃干燥6小时，加8倍量30％乙醇微沸状态加热回流提取2次，每次1小时，提取液过滤，合并，减压浓缩至0.5g/mL(生药量)，上D101大孔树脂。用4倍量柱体积去离子水冲洗，弃去，继续用4BV 30％乙醇溶液冲洗，弃去，最后用5BV 70％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得三七总皂苷。经HPLC测定，精制物中三七皂苷R12％、人参皂苷Rg115％、人参皂苷Rb19％、人参皂苷Rd 3％、人参皂苷Re 1％，总皂苷含量达30％。
实施例二取三七药材粗颗粒(粒径约1cm)500g，50℃干燥6小时，加15倍量40％乙醇微沸状态加热回流提取1次，2小时，提取液过滤，合并，减压浓缩至0.5g/mL(生药量)，上D101大孔树脂。用5倍量柱体积去离子水冲洗，弃去，再用4BV 1％氨水冲洗，弃去，然后用去离子水冲洗至流出液pH＝7，最后用6BV 30％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得三七总皂苷。经HPLC测定，精制物中三七皂苷R14％、人参皂苷Rg130％、人参皂苷Rb115％、人参皂苷Rd 5％、人参皂苷Re 3％，总皂苷含量达57％。
实施例三取三七药材粗颗粒(粒径约1cm)500g，50℃干燥6小时，加18倍量50％乙醇微沸状态加热回流提取1次，1小时，提取液过滤，合并，减压浓缩至0.5g/mL(生药量)，上D101大孔树脂。用4倍量柱体积去离子水冲洗，弃去，再用4BV 0.1％氨水冲洗，弃去，然后用去离子水冲洗至流出液pH＝7，最后用5BV 60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得三七总皂苷。经HPLC测定，精制物中三七皂苷R14％、人参皂苷Rg126％、人参皂苷Rb116％、人参皂苷Rd 5％、人参皂苷Re 4％，总皂苷含量达55％。
实施例四取三七药材颗粒(1mm-10mm)500g，50℃干燥6小时，加12倍量50％乙醇微沸状态加热回流提取2次，每次2小时，提取液过滤，合并，减压浓缩至0.5g/mL(生药量)，上D101大孔树脂。用3倍量柱体积去离子水冲洗，弃去，再用3BV 0.05％氨水冲洗，弃去，然后用去离子水冲洗至流出液pH＝7，继续用4BV 20％乙醇溶液冲洗，弃去，最后用5BV 50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得三七总皂苷。经HPLC外标法测定，精制物中三七皂苷R16％、人参皂苷Rg142％、人参皂苷Rb123％、人参皂苷Rd 7％、人参皂苷Re 3％，总皂苷含量达81％。
实施例五取三七药材颗粒(1mm-10mm)500g，50℃干燥6小时，加15倍量60％乙醇微沸状态加热回流提取1次，1小时，提取液过滤，合并，减压浓缩至0.5g/mL(生药量)，上D101大孔树脂。用3倍量柱体积去离子水冲洗，弃去，再用5BV 0.5％氨水冲洗，弃去，然后用去离子水冲洗至流出液pH＝7，继续用4BV 20％乙醇溶液冲洗，弃去，最后用6BV 40％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得三七总皂苷。经HPLC外标法测定，精制物中三七皂苷R17％、人参皂苷Rg138％、人参皂苷Rb120％、人参皂苷Rd 8％、人参皂苷Re 3％，总皂苷含量达76％。
实施例六取三七药材颗粒(3mm-8mm)500g，50℃干燥6小时，加12倍量50％乙醇微沸状态加热回流提取3次，每次0.5小时，提取液过滤，合并，减压浓缩至0.5g/mL(生药量)，上D101大孔树脂。用3倍量柱体积去离子水冲洗，弃去，再用3BV 2％氨水冲洗，弃去，然后用去离子水冲洗至流出液pH＝7，继续用4BV 30％乙醇溶液冲洗，弃去，最后用6BV 50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得三七总皂苷。经HPLC外标法测定，精制物中三七皂苷R17％、人参皂苷Rg135％、人参皂苷Rb122％、人参皂苷Rd 6％、人参皂苷Re 3％，总皂苷含量达73％。
实施例七取三七药材颗粒(3mm-8mm)500g，50℃干燥6小时，加10倍量70％乙醇微沸状态加热回流提取2次，每次2小时，提取液过滤，合并，减压浓缩至0.5g/mL(生药量)，上D101大孔树脂。用4倍量柱体积去离子水冲洗，弃去，再用4BV 0.05％氨水冲洗，弃去，然后用去离子水冲洗至流出液pH＝7，继续用4BV 30％乙醇溶液冲洗，弃去，最后用5BV 70％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇，冷冻干燥，即得三七总皂苷。经HPLC外标法测定，精制物中三七皂苷R18％、人参皂苷Rg144％、人参皂苷Rb128％、人参皂苷Rd 10％、人参皂苷Re 5％，总皂苷含量达95％以上。
实施例八三七总皂苷的含量测定色谱条件 色谱柱Agilent Extend-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；采用梯度洗脱，流动相A相为水，流动相B相为乙腈，洗脱梯度0min，20％B；30min，20％B；55min，46％B；65min，55％B；70min，55％B；72min，95％B；80min，95％B。流速1.0mL·min-1；检测波长203nm；柱温15℃；进样量5μL。
供试品溶液的制备 称取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。
测定方法 精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例九滴丸的制备取实施例七的三七总皂苷0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸300粒。
实施例十冻干粉针剂的制备取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤液低温干燥得降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基β-环糊精的包合物粉末外，再取实施例七的三七总皂苷0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装350支，即得。
实施例十一片剂的制备取实施例七中三七总皂苷适量与微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60℃干燥1小时，整粒，加入滑石粉适量，混匀，压片，即得。
实施例十二胶囊的制备取实施例七中三七总皂苷与花生油按2∶18的比例水溶式不锈钢搅拌灌中，同时加入适量明胶和甘油混合，放出再用胶体磨磨浆，磨出的混合液搅拌，制成药液；将甘油与蒸馏水在40-50℃温度下搅拌混溶，再将甘油液温至80-90℃，取明胶加入其中混合搅拌，直至全部溶化成胶液，然后在60℃温度下使胶液静置4小时，用制板机制成胶板供制丸工序使用；将上述制成的药液和胶板送入压丸机制丸，然后在22-25℃温度下吹风4小时作滚筒定型，又在25-30℃温度下吹风干燥16-20小时，检选合格胶丸，用95％乙醇清洗，在25-30℃下吹风干燥4小时，即得。
实施例十三注射液的制备取实施例七中三七总皂苷适量用40℃注射用水溶解，加入适量药用载体等渗剂，调节溶液的pH值为7.0-8.0，加注射用水至全量，用超滤器超滤除热源，测定pH值后，用膜过滤，分装后，高压灭菌，检验、包装，即得。
实施例十四三七总皂苷对大鼠急性心肌缺血的影响1、实验材料1.1药品与试剂三七总皂苷，按实施例七方法制备。
盐酸维拉帕米注射液，上海禾丰制药有限公司，批号6E12001。
盐酸利多卡因注射液，浙江诚意药业有限公司，批号20060422。
水合氯醛，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号T20060922TTC，Sigma公司CK检测试剂盒，宁波亚太生物技术有限责任公司，批号06090102。
LDH检测试剂盒，宁波亚太生物技术有限责任公司，批号06060101。
1.2实验器材大鼠灌胃针，2ml注射器，手术器械，小动物呼吸机，恒温水浴锅，电子天平，酶标仪1.3实验动物SD大鼠，160-180g，雄性，浙江省医学科学院，许可证SCXK(浙)2003-0001。
2、实验方法2.1分组给药160-180g雄性SD大鼠，随机分作四组假手术组，模型组，阳性药组，三七组。阳性药组，腹腔注射给予维拉帕米0.5mg/kg；三七组，灌胃给予三七总皂苷50mg/kg；假手术组和模型组灌胃给予等体积生理盐水。各组连续给药7天。
2.2模型复制第7次给药后，各组动物腹腔注射300mg/kg水合氯醛麻醉。仰卧位固定于手术板上。后肢肌肉注射利多卡因10mg/kg。胸部正中切开皮肤，3、4肋间开胸，挤出心脏，结扎冠状动脉前降支(假手术组穿线而不结扎)。结扎点定位于肺动脉圆锥和左心耳交界下2mm处。
2.3样品采集造模后24h，腹腔注射300mg/kg水合氯醛麻醉。下腔静脉抽血，供制备血清。开胸，取出心脏，生理盐水洗涤，除去血液，剪掉心房以及与心室相连的血管。心室切成等厚的五片，置于1％TTC中，37℃水浴5min染色，正常心肌组织染成砖红色，坏死组织不染色，呈灰白色。取出心脏切片，生理盐水洗掉多余TTC，10％甲醛溶液固定过夜。
2.4药物作用评价检测血清CK、LDH，按试剂盒说明书操作。甲醛固定过夜的心脏切片，分离呈砖红色的正常组织和不染色的坏死组织。坏死组织，以及整个心室称重，计算梗死率(％)梗死率％＝坏死心肌重mg/心室总重mg×100％3、实验结果结果显示，模型组血清CK、LDH含量，较假手术组明显升高，梗死率为20.9±3.5％。阳性药维拉帕米能有效降低梗死率，以及血清CK、LDH含量。提示模型复制成功。
受试药物三七总皂苷能显著降低心肌梗死率(15.0±3.1％)，与模型组比较差异有显著意义(P＜0.01)。同时三七组血清CK、LDH含量较模型组明显降低，差异有显著性意义(P＜0.05，P＜0.01)。具体数据见表1。
表1三七总皂苷(A2)对大鼠急性心肌缺血损伤的影响(X±SD)
注与假手术组比较##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
4、结论按本发明方法制备的三七总皂苷对大鼠急性心肌缺血损伤具有明显的保护作用，能显著降低心肌梗死率。
实施例十五本发明所公开的方法与现有技术相比的另一个优势在于能对三七总皂苷进行较好的质量控制。本发明建立了高效液相色谱的分析方法，对R1、Rg1、Re、Rb1、Rd这五种三七中含量最高的单体皂苷进行定量分析，样品分离度较好(参见附图1)，满足定量要求。同时，本工艺稳定性和重现性好，用本发明所述方法进行六次重复实验，制得六批三七总皂苷，进行液相分析，结果以上五种单体皂苷含量RSD均在5％以内。
综合以上所述，用本发明所述方法制备三七总皂苷具有工艺简单，得率较高，重现性好的优点，同时，依据本发明所建立的分析方法能对三七总皂苷进行质量控制。表2为本发明所述方法与现有技术之间在工艺步骤、总皂苷测定方法及含量等几方面的对比。
表2本发明所述方法与现有技术的对比
权利要求
1.一种从中药三七中提取纯化总皂苷的制备方法，其特征通过以下步骤实现(1)三七药材粉碎成过20目筛的粉末或粒径小于1cm的颗粒，去除杂质，烘干，用含浓度为0-95％的乙醇水溶媒渗滤，超声，热回流提取，溶剂用量5-20倍量，提取1-3次，每次0.5-2小时，提取液减压浓缩富集；(2)浓缩液上D101大孔树脂，依次以水、氨水、醇水洗脱，先用水冲洗3-6个柱体积，再用0.05％-3％氨水冲洗3-6个柱体积，再用水冲洗至pH＝7，最后用20-80％乙醇洗脱4-8个柱体积，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得三七总皂苷精制物。
2.根据权利要求1所述的一种从中药三七中提取纯化总皂苷制备方法，其特征是步骤(1)中三七药材粉碎成粒径1mm-10mm的颗粒状，以含浓度为30-95％的乙醇水溶媒渗滤，溶剂用量6-15倍量，热回流提取1-2次，每次1-2小时。
3.根据权利要求1所述的一种从中药三七中提取纯化总皂苷制备方法，其特征是步骤(1)中三七药材粉碎成粒径3mm-8mm的颗粒状，以含浓度为65-75％的乙醇水溶液，溶剂用量10-12倍量，热回流提取2次，每次2小时。
4.根据权利要求1所述的一种从中药三七中提取纯化总皂苷制备方法，其特征是步骤(2)中样品上D101大孔树脂，先用水冲洗4-6个柱体积，再用0.05％-1％氨水冲洗4-6个柱体积，再用水冲洗至pH＝7，再用20-30％乙醇冲洗3-5个柱体积，最后用60-80％醇洗脱3-6个柱体积，收集洗脱液，回收溶剂得三七皂苷精制物。
5.根据权利要求1所述的一种从中药三七中提取纯化总皂苷制备方法，其特征是步骤(2)中样品上D101大孔树脂，先用水冲洗4-5个柱体积，再用0.05％-0.1％氨水冲洗4-5个柱体积，再用水冲洗至pH＝7，再用20-30％乙醇冲洗4-5个柱体积，最后用60-70％乙醇洗脱5-6个柱体积，收集洗脱液，回收溶剂得三七皂苷精制物。
全文摘要
一种从中药三七中提取纯化总皂苷的制备方法，通过将三七药材粉碎成过粉末或颗粒，去除杂质，烘干，用含浓度为0－95％的乙醇水溶媒渗滤，热回流提取，提取液减压浓缩富集，将浓缩液上D
文档编号A61P9/00GK101049331SQ20071006849
公开日2007年10月10日 申请日期2007年5月11日 优先权日2007年5月11日
发明者贺庆, 刘雳, 程翼宇, 瞿海滨, 水文波, 窦静, 霍杨, 葛志伟 申请人:浙江大学