专利名称：一种大分子量t载体及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种大分子量T载体及其制备方法。
背景技术：
PCR(polymerase chain reaction)是分子生物学中的常规实验技术。绝大多数情况下需要将PCR扩增产物克隆到质粒载体上，以便对PCR产物进行测序、体外转录、体外翻译等操作。克隆PCR产物的方法有很多种，但最直接的、最方便的方法是TA克隆。所谓TA 克隆就是将3’端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到3’端具有单个T尾巴的T载体上。TA 克隆的理论依据是在PCR扩增过程中，由于Taq聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性而在PCR产物的3’末端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的脱氧腺苷酸，使得50%以上的PCR产物的3’末端具有单个脱氧腺苷酸，即3’端A尾巴。目前，T载体的制备方法有2种。第一种方法是利用产生平末端的内切酶将环状质粒酶切成线状质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到线状载体的3’端。第二种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3’端具有单个T突出的线性T载体。前一种方法在制备T载体过程中存在加尾效率较低以及线性质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题。与前两种方法相比，第二种方法更快捷、更高效以及更稳定。理论上，可以用来制备T载体的内切酶包括)(CmI，Eamll05I，其中kml在制备T载体中得到广泛应用。其它内切酶要么因为太昂贵，要么因为在普通的克隆载体上有太多的识别位点，因而在制备T载体中的应用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆载体中，例如pUC18、pBlueSCript SK载体等，都不具有kml 酶切位点，但在Amp抗性基因中含有一个Eamll05I及其同裂酶的酶切位点，因而在这些载体的多克隆位点引入)(cml位点更方便一些，这就是为什么更多人采用kml制备T载体(美国专利文献 US005487993A ；中国专利文献 CN1142279C, CN1344795A 以及 CN1362521A)。使用)(cml构建T载体均存在一个潜在的问题部分酶切的前T载体混杂在T载体中会导致非重组转化子的本底过高。目前，解决这一问题最有效的方法是在前T载体的两个kml或两个kml酶切位点之间引入足够长的间隔DNA，经琼脂糖凝胶电泳后将完全酶切的质粒和部分酶切的质粒分开。然而，引入间隔DNA后带来的一个新问题是由于环形质粒在琼脂糖凝胶电泳中比起分子量相当的线型质粒移动得快，因而，未被酶切的环型质粒 (前T载体，带有间隔DNA)往往与分子量小于自身的T载体(不带有间隔DNA)混杂，最终造成非重组转化子的本底过高。pBlueScript II SK(+/-)载体(GenBank Accession No. X52330)是由 pUC载体派生而来的噬菌粒载体(phagemid或phasmid)，除了含有一个Amp抗性基因及一个IacZ基因作为筛选标记外，在多克隆位点的两侧存在T3和T7噬菌体的启动子，同时具有一个单链噬菌体fl的复制起点(pBlu必cript II SK(+)和pBlueScript II SK(-)的唯一区别是两者 Π的方向相反)。ccdB 基因(GenBank Accession No. AP001918)位于 F 质粒上，它和 ccdA 基因一起构成F质粒的ccd (control or cell death)位点。Ccd位点通过杀死不含F质粒的大肠杆菌细胞达到稳定F质粒的作用。CcdB蛋白干扰大肠杆菌的DNA促旋酶，因而抵制大多数大肠杆菌菌株。但是大肠杆菌DB3. 1菌株中促旋酶的A亚基基因发生了一处突变，突变后的促旋酶可以抵抗CcdB蛋白的毒性效应，因而含有ccdB基因的质粒要以在DB3. 1菌株中增殖。目前，市场上常用的T载体长度都在^OObp到3100bp之间，对于长度在2500bp 至3500bp之间的片段而言，通过酶切得到的片段，很难和该类载体在电泳时长度上做出明显的区分，不利于后续更换载体等的后续操作，很容易和载体一起回收，最终造成非重组转化子的本底过高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对目前常用的T载体长度都在^OObp到3100bp 之间，对于长度在2500bp至3500bp之间的外源片段的克隆，存在非重组转化子的本底过高，克隆效率较低的不足，而提供一种克隆2500bp至3500bp片段具有较高TA克隆效率的 T载体及其制备方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下本发明的第一方面是提供一种前T载体，是以已知载体为出发载体进行改良后的载体，出发载体是 pBlu必cript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或 pGEM 系列载体，它们的多克隆位点被替换为)(cml盒，所述的kml盒包括ccdB基因序列以及紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个kml酶切位点序列，并且出发载体中的抗性基因前和/或后插入了长度为1000 2000bp的无义序列而被延长。较佳的，所述的kml盒还包括连接于所述各一个kml酶切位点序列的除kml酶切位点序列外的酶切位点序列。更佳的，所述的)CcmI盒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或 SEQ ID NO 6 所示。出发载体中的抗性基因前和/或后插入了长度为1000 2000bp，优选1500bp的无义序列而被延长。所谓的无义序列是指不影响载体复制、转录、翻译等功能的序列，例如可以是某些载体的骨架结构，如包含AMP抗性基因的载体pJETl. 2中AMP抗性基因前后的载体骨架结构优选BpiI和HindIII双酶切的结构。更佳的，在Amp抗性基因和在其前和/ 或后插入了长度为1000 2000bp，优选1500bp的无义序列后的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。本发明的第二方面是提供一种T载体，由如上所述的前T载体经kml或kml同裂酶酶切而得。其中，所述T载体较佳的为图4所示的pXL-T，图5所示的pXL01_T或图6所示的 PXL02-T。本发明的第三方面是提供一种制备所述的前T载体的方法，包括以下步骤1) WpBlueScript II SK (-), pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pUC19，或 pGEM 系列载体为出发载体，在其多克隆位点引入引入)(cml盒，得到前T载体；所述的)(CmI盒包括 ccdB基因序列以及紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个kml酶切位点序列；2)将所述出发载体中的Amp抗性基因延长。
其中，步骤幻中较佳的在载体的Amp抗性基因前和/或后插入无义序列，从而延长。例如将pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因用来自载体pJETl. 2的AMP抗性基因及其前后的载体骨架(如载体PJET1. 2的BpiI和HindIII双酶切片段)替换，即得。所述的Amp抗性基因延长后优选如序列表中SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。本发明的第四方面是提供所述的前T载体和T载体在基因克隆中的应用。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。采用本发明的T载体进行TA克隆时由于彻底解决了非重组转化子本底过高的问题，因此大大提高了 T载体的质量和稳定性。克隆片段的选择范围更为广泛。实验证明本发明的T载体分别克隆2. Skb和3. 2kb的PCR产物的TA克隆效率在95%以上。本发明的 T载体及其制备方法将在基因工程领域中发挥重要的作用。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1显示用于构建上述前T载体(pXL，pXLOl，pXL02，)的引物序列。其中左边方框中的序列为酶切位点。图2是实施例1的质粒构建示意图。图3是实施例2的质粒构建示意图。图4是为pXL-T的物理图谱。图5是pXLOl-T的物理图谱。图6是pXL02-T的物理图谱。
具体实施例方式本发明的目的是提供具有较高TA克隆效率的尤其是克隆2500bp至3500bp之间的常规商业克隆载体不易于区分的片段的T载体。本发明提供一种具有较高TA克隆效率尤其是克隆2500bp至3500bp之间常规商业克隆载体不易于区分的片段的T载体及其制备方法。本发明的一T载体包括pBlueScript II SK(-)的ColEI ori序列，pBlue Script II SK(-)的 Π ori 序列，pBlue Script II SK(-)的 IacZ 基因序列，pBlue Script II SK(-)的T3噬菌体启动子序列，pBlue Script II SK(-)的T7噬菌体启动子序列以及分别位于两个末端的改造过的各一个多克隆位点序列，还包括一段含有amp+基因的外源片段。 其中，所述两个多克隆位点均具有3’突出T末端。所述含有amp+基因的外源片段除amp+ 基因外还增加了其他序列，被人为延长，从而增加整个载体的总长度，便于区分2500bp至 3500bp之间常规商业克隆载体不易于区分的片段。所述分别位于两个末端的改造过的各一个多克隆位点序列经过改造。其特征在于所述3’突出T末端的序列为5，· · · CCCGGGATT 3’5’ ATCTTGGG. · · 3’3，· · · GGGCCCTA 5，，3，TTAGAACCC. · · 5，改造过的多克隆位点(MCS)序列(见序列表SEQ ID NO :1所示)为GAATTC GAGCTC GGTACCC GG GGATCC* AAGATt ATCTTGG GGATCC TCTAGAGTCGAC CTGCAG* GCATGC AAGCTT
*表示单一酶切位点。所述T载体优选为pXL-T (图4)，pXLOl-T (图幻或pXL02_T (图6)。本发明的第二个目的是提供一种制备上述T载体的方法。本发明提供一种制备上述一 T载体的方法，包括以下步骤1)将pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因延长，从而增加整个载体的长度。2)在步骤1)得到的载体的多克隆位点中引入kml盒，所述的kml盒包括ccdB 基因序列以及紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个kml酶切位点序列。3)用kml或其同裂酶酶切步骤2、所得的前T载体，得到T载体。所述的kml盒较佳的还包括连接于所述各一个kml酶切位点序列的除kml酶切位点序列外的酶切位点序列。所述的)(cml盒优选如序列表中SEQ ID N0:4，SEQ ID NO: 5，或SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列。SEQ ID NO 4由718个碱基组成；SEQ ID NO 5由 726个碱基组成；SEQ ID NO 6由712个碱基组成。所述的ccdB基因序列较佳的是序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。所述前T载体优选pXL，pXLO 1或pXL02 ；所述T载体优选pXL_T (图4)，pXL01-T (图 5)或 pXL02-T (图 6)。本发明构建的pXLxx系列前T载体以及由这些前T载体制备而来的pXLxx-T系列 T载体是基于pBlueScript II SK(-)构建而成。具有pBlueScript II SK(-)载体的全部特性。除了含有一个IacZ基因作为筛选标记外，在多克隆位点的两侧存在T3和T7噬菌体的启动子，同时具有一个单链噬菌休Π的复制起点。本发明中，XcmI盒中的ccdB基因具有间隔DNA和负选标记的双重作用。ccdB作为间隔DNA是指ccdB基因序列将两个kml酶切位点间隔开，ccdB基因作为负选标记基因是指含有ccdB基因的质粒转化到普通大肠杆菌菌株细胞后将杀死大肠杆菌细胞。)(CmI盒中的ccdB基因可以有三种形式第一种形式是ccdB基因与其前面的IacZ读码框融合，在 IacZ启动子驱动下表达产生融合ccdB蛋白；第二种形式是ccdB基因的前面带有核糖体结合位点(RBQ序列，在IacZ启动子驱动下表达产生ccdB蛋白；第三种形式是ccdB基因的前面带有自身启动子及RBS序列，在IacZ启动子和其自身启动子的双重驱动下表达产生ccdB 蛋白。序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO :6所示分别是这三种形式。以ccdB基因作为间隔DNA的前T载体可以在DB3. 1菌株中增殖，当将T载体与 PCR产物等组成的连接体系转化普通大肠杆菌菌株(例如DH5a，JM109，DH10B，T0P10)时， 混杂到T载体中的前T载体(包括未酶切的环型质粒及部分酶切的线型质粒经连接而成的环型质粒)会杀死大肠杆菌细胞。这样，TA克隆过程中由前T载体造成的非重组转化子本底过高的问题得到彻底解决。此外，一小部分T载体的T尾巴由于种种原因(例如kml及其同裂酶以及连接酶等残存的核酸外切酶活性、反复冻融等)会被去除，去除T尾巴的T载体经自身连接产生的转化子是组成非重组转化子本底的另一个来源。本发明的方法通过精确设计kml盒使得上述来源的非重组转化子具有完整的IacZ读码框，从而可以经蓝白斑筛选去除这种非重组转化子。本发明的载体中，人为延长了 Amp+的区域，有效增加了整个载体的总长度，从而对常见商业载体的长度缺陷做一个有利的补充。和常规商业载体的组合后，可以克隆任何长度的外援片段，达到优势互补。
本发明的制备T载体的方法可最大限度的降低T载体中混杂的未酶切的环型质粒和部分酶切的线型质粒。pXLxx-T系列前T载体是把pSK的多克隆位点进行改造，引入2个常规筛选用位点 (BamHI或HindIII或EcoRI)以及XcmI盒。XcmI盒的核心序列如下(框中部分代表ccdB 基因序列，表示酶切割的具体位点)-ccaagatt"cctttggctcgagttcc--ccdB--ccatggca"atcttgg-3'-ggttcta"aggaaaccgagctcaagg ；--ccdB--ggtaccg"ttagaacc 5，使用)(cml内切酶酶切pXLxx系列前T载体，酶切体系经琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收的大片段即是相应的T载体。3种T载体的区别在于多克隆位点中酶切位点的种类及数量不同。其中，PXLOl-T和pXL02-T具有最少的酶切位点，可以减少高GC含量及回文结构对体外转录的影响，因此这两种载体尤其适合于对插入片段进行体外转录。pXL-T酶切位点最多，因此可以选择更多的内切酶从T载体上释放插入片段。此外，由于这3种载体上分别额外引入了一个BamHI或HindIII或EcoR I酶切位点，因此可以用BamHI或HindIII 或EcoR I单酶切从T载体上释放插入片段，使用者可以有更多的选择。当制备的pXLxx-T (包括pXL-T，pXL01-T，pXL02-T)系列T载体中的一小部分由于种种原因(例如)(cml及其同裂酶以及连接酶等残存的核酸外切酶活性、反复冻融等)其T 尾巴被去除时，这些失去T尾巴的质粒经自身连接后可以形成完整的IacZ读码框，因而可以通过蓝白斑筛选的方法排除这些非重组转化子。下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1pBluescriptll SK(_)载体多克隆位点的改造和)(cml盒的引入本质粒构建示意图见图2。合成MCS_01_MCS_18，共18条引物，通过PCR将18条引物(序列如图1所示)连接成约400bp的目的片段即MCS。以载体pENTR3C-dual (Invitrogen)为模版，扩增得到ccdb 基因(引物如图1所示的CCdb_F/CCdb_R)。然后通过重叠PCR，与上述400bp片段融合，得到改造后的)(cml盒。获得MCS的PCR反应体系为50μ L反应体系中含5U Pfu, 0. 2mmol/LdNTPs U XPfu bufferU号和18号引物各lOymol/L、模板(1-18号引物的混合物)5ng左右；PCR扩增的循环程序为94°C预变性 5min，(94°C，30s ；56°C, 30s ；72°C，1. 5min) X30 个循环，72°C最后延伸5min ；重叠PCR法获得)(cml盒，模板为上述获得的400bp MCS以及扩增得到的ccdb 基因，扩增引物为(MCSCCdb_F/MCSCCdb_R)(序列如图1所示)；PCR反应体系和程序与上述一致，在此不便赘述。琼脂糖凝胶电泳回收约700bp的目的条带OCcmI盒)。将回收的 PCR 产物和 pBluescript SK(-)载体(GenBank Accession No. X52330)分别用 PvuII单酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。将酶切后的PCR产物与酶切后的pBluescript SK(-)载体建立如下连接反应体系10 μ L连接体系中含3U连接酶 (Promega)，IX连接缓冲液，约50ng质粒，约50ng PCR产物。4°C连接16小时以上。连接产物按照常规方法转化到DB3.1菌株(Invitrogen)。经酶切鉴定得到阳性菌落。阳性菌落经测序验证之后得到PSKMC。插入片段的测序的结果，就是kml盒，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。第1位到第145位是第一个MCS的核苷酸序列，其酶切位点分别对应EcoRl-SacI-KpnI-SmaI-BamHI。第146位到第451位是ccdb基因的核苷酸序列。第452位到第718位是第二个MCS的核苷酸序列，其酶切位点分别对应 BamHI-XbaI-SaII-SphI-HindIII。实施例2构建前T载体，用包含AMP+基因的pJETl. 2 (Fermentas)载体来人为延长 pBluescriptll SK(-)的amp+基因部分，从而整体延长整个载体的长度本质粒构建示意图见图3。以实施例1构建得到的质粒pSKMC为模板，用XL_F和XL_R引物(序列见图1)进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为50μ L反应体系中含5U Pfu,0. 2mmol/L dNTPs,lXPfu buffer,引物各1(^11101/1，模板51^左右；PCR扩增的循环程序为94 °C预变性5min， (94°C，30S ；60°C，30S ；72°C，1. 5min) X 30 个循环，72°C最后延伸 5min。PCR 产物经琼 脂糖凝胶电泳后切胶回收，将回收的PCR产物用BsaI酶切。将pJETl. 2质粒O^rmentas) 用BpiI和HindIII双酶切。酶切产物经1 %琼脂糖凝胶电泳后切胶回收2. 3kb的大片段。 将酶切后的PCR产物与酶切后的pJETl. 2载体建立如下连接反应体系10 μ L连接体系中含3U连接酶(Promega)，1 X连接Buffer，约50ng质粒，约50ng PCR产物。4°C连接16小时以上。连接产物按照常规方法转化DB3. 1菌株(Invitrogen)。经酶切鉴定筛选得到阳性菌落，阳性菌落经测序鉴定得到前T载体pXL。前T载体pXLOl的构建过程除所用的PCR扩增引物是XL01_F和XL01_R(序列见图1)以及所使用的模板是PGH载体(生产商上海捷瑞生物工程有限公司Generay)外，其它步骤与PXL-T相同。前T载体pXL02的构建过程除所用的PCR扩增引物是XL01_F和XL01_R(序列见图1)以及所使用的模板是PGE载体(生产商上海捷瑞生物工程有限公司Generay)外，其它步骤与PXL构建相同。T 载体 pXL-T、pLXOl-T、pLX02_T 结构如图 4，5，6 所示，其中 pXL_T(图 4)设计了一对用于鉴定的酶切位点BamHI，MCS上包括的酶切位点为=EcoRl-SacI-KpnI-SmaI-BamHI -ccdbBox-BamHI-Xbal-SalI-SphI-HindIII。pXLOl-T (图 5)设计了一对鉴定酶切位点 HindiII，MCS 为 HindiII-SmaI-HindI11。pXL02-T (图 6)设计了一对鉴定酶切位点 EcoRI，MCS 为 EcoRI-Smal-EcoRI。实施例3pXL-T系列T载体的制备及TA克隆效率分析1、制备T载体用)(cml酶切前 T 载体 pXL 或 pXLOl 或 pXL02 制备 pXL-Τ 或 pXLOl-T 或 pXL02_T。 酶切反应体系如下20 μ L酶切体系中含3U XcmI内酶切(购自NEB公司)，lXNEBuffer4, 大约Iyg质粒。37°C酶切3小时后，经琼脂糖凝胶电泳后切分别切胶回收大片段。切胶回收纯化的大片段即是相应的PXL-T或pXLOl-T或pXL02-T载体。2.测试TA克隆效率
权利要求
1.一种前T载体，其特征在于，是以已知载体为出发载体进行改良后的载体，出发载体是 pBlueScript II SK (-)，pUC18, pUC19, pUCl 18，pUCl 19，pUC19，或 pGEM 系列载体，它们的多克隆位点被替换为)(cml盒，所述的kml盒包括ccdB基因序列以及紧密连接于所述ccdB 基因序列两侧的各一个)(cml酶切位点序列，并且出发载体中的抗性基因前和/或后插入了长度为1000 2000bp的无义序列而被延长。
2.根椐权利要求1所述的前T载体，其特征在于，所述的kml盒还包括连接于所述各一个)(CmI酶切位点序列的除)(CmI酶切位点序列外的酶切位点序列。
3.根椐权利要求1或2任一项所述的前T载体，其特征在于，所述的kml盒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO 6所示。
4.根椐权利要求1 3任一项所述的前T载体，其特征在于，所述的出发载体是 pBlueScript II SK(-)。
5.根椐权利要求1 4任一项所述的前T载体，其特征在于，所述的抗性基因和在其前和/或后插入了无义序列后的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。
6.一种T载体，其特征在于，由如权利要求1 5任一项所述的前T载体经)(CmI或 XcmI同裂酶酶切而得。
7.根椐权利要求6所述的T载体，其特征在于，所述T载体为图4所示的pXL-T，图5 所示的pXLOl-T或图6所示的pXL02-T。
8.根椐权利要求6或7任一项所述的T载体，其特征在于，所述T载体是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :7所示的pXL-T，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :8所示的pXL01_T， 或核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 9所示的pXL02-T。
9.一种制备权利要求1 5任一项所述的前T载体的方法，包括以下步骤1)以pBlueScript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或 pGEM 系列载体为出发载体，在其多克隆位点引入引入)(cml盒，得到前T载体；所述的kml盒包括ccdB基因序列以及紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个)(CmI酶切位点序列；2)将所述出发载体中的Amp抗性基因延长。
10.如权利要求1 5任一项所述的前T载体和如权利要求6 8所述的T载体在基因克隆中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种T载体及其制备方法。是以已知载体为出发载体进行改良后的载体，出发载体是pBlueScript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或pGEM系列载体，它们的多克隆位点被替换为XcmI盒，所述的XcmI盒包括ccdB基因序列以及紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个XcmI酶切位点序列，并且出发载体中的抗性基因前和/或后插入了长度为1000～2000bp的无义序列而被延长。本发明的T载体具有较高TA克隆效率，尤其对于克隆2500bp至3500bp之间的常规商业克隆载体不易于区分的片段，TA克隆效率可达100％，将在基因工程领域中发挥重要作用。
文档编号C12N15/66GK102304537SQ20111021417
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者周磊, 肖爱军, 赫英俊 申请人:上海捷瑞生物工程有限公司