专利名称：抗独特型抗cea抗体分子及其作为癌疫苗的用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了适用作针对CEA(癌胚抗原)阳性肿瘤的抗独特型疫苗的分子，优选地为经设计的免疫球蛋白。所述分子对CEA荷瘤细胞均可诱导MHC I类和MHC II类介导的免疫反应，以产生有效且持久的宿主抗肿瘤反应。本发明提供了有改进疫苗特性的抗独特型抗CEA抗体，优选地为小鼠抗体708的经修饰形式。该修饰涉及将来自例如CEA、CD55抗原和CEA癌特异MHC表位的序列段导入到所述抗体分子的可变区。
背景技术：
提供能刺激或增强人免疫系统与癌细胞相互作用以从身体中消除癌细胞的组合物是长久以来所期望的。与疫苗接种对传染因子提供免疫不同，利用免疫系统消除癌细胞是更具有挑战性的技术目的，不仅仅因为免疫系统需要针对已建立免疫耐受的细胞或在某些情况下，癌细胞自身可获得使它们能逃避正常免疫检测或清除的特性。
本发明涉及诱导针对癌细胞的T细胞依赖性免疫反应。以前的大部分工作集中于CD8阳性T细胞和MHC I类限制性抗原，但本发明认识到MHC II类限制性CD4阳性T细胞反应的重要性并在优选的实施方案中提供了均能递呈I类和II类限制性癌抗原表位的疫苗。
本发明分子靶向的癌抗原为癌胚抗原(CEA)。CEA为大量实体癌过量表达的细胞表面蛋白质并且它已成为世界上许多不同研究小组作为疫苗研发靶的焦点。该分子为90％结肠直肠癌、70％胃癌、胰腺癌及非小细胞肺癌和50％乳腺癌表达的gpi-锚定的180kDa糖蛋白。该蛋白质显示与正常粒细胞上发现的非特异交叉反应抗原(NCP)和胆糖蛋白(BGP)有很高的同源性。CEA可在大多数CEA阳性肿瘤的患者的循环中检测到，并且它也在人胎儿的正常消化道中发现。该蛋白质似乎作为粘附分子起作用并且期望直接针对CEA的治疗可在预防肿瘤转移中是有好处的。CEA是癌免疫治疗包括疫苗接种方案中的吸引人的靶，因为当它出现时，它一般在肿瘤表面以高水平存在。
许多以前的研究利用CEA来源的蛋白质序列用于治疗的疫苗接种方法中。小鼠的研究已经证明了痘苗病毒表达的CEA(rV-CEA)比重组CEA作为疫苗更具优越性，并且已经显示了诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应导致已建立的肿瘤退化[Kantor，J.等人(1992)，J.Natl.Cancer Inst.841084-1091]。当用于患有转移癌的患者的I期临床研究时，rV-CEA能诱导针对CEA的CTL反应而杀死肿瘤细胞[Tsang，K.Y.等人(1995)J.Natl.Cancer.Inst.87982-990]。然而也引起对痘苗的显著免疫反应，这限制了对这些受试者继续免疫以达到有用的临床结果的前景。其它涉及初次剂量用rV-CEA及然后用禽痘病毒载体编码的CEA加强的临床研究对也应用GM-CSF和低剂量IL-2的患者中达到满意反应[Marshall，J.L.等人(2000)J.Clin.Oncology.183964-3973]。在证实这种复合的疫苗接种方案的实用性前需要进一步的临床研究。
另一用于靶CEA的方法是抗独特型免疫。识别抗肿瘤抗体结合位点的抗独特型抗体能作为抗原的功能性模拟物。因此可将它们均用于刺激体液反应和细胞反应。在患晚期结肠直肠癌的患者中进行了模拟CEA的小鼠抗独特型3H1的I期临床试验。3H1抗体在美国专利US,5,977,315中进行了详细描述，并且已经显示了该抗体诱导患者的抗CEA抗体反应，一些患者显示了对CEA的增殖反应[Foon，K.A.等人(1995)J.Clin.Invest.96334-342]。治疗患有微小残余疾病的患者的其它研究显示患者对抗独特型抗体和CEA均有T细胞反应。但该研究中，抗独特型不能引起CTL反应[Foon，K.A.，等人(1999)J.Clin.Oncology.172889-2895]。
已经对模拟除CEA外的其它肿瘤抗原的抗独特型抗体作为治疗疫苗的实用性进行了临床研究。其实例包括GD2抗原和抗独特型抗体1A7[US，6,509,016]，还包括GD3抗原的抗独特型抗体[US，5,529,922；EP0473721]及黑素瘤相关的p97抗原的抗独特型抗体[US，4,918,164]，这里仅举了几个例子。利用抗独特型抗体的更复杂的过继免疫治疗方法已进行深入化，如在US，5,766,588中的教导。
用抗独特型抗体的疫苗接种方案的一个特定实例是通过对人单克隆抗体107AD5的研究提供的。已发现该抗体提供CD55蛋白的分子模拟物，CD55蛋白质也已知为结肠直肠癌细胞上发现的肿瘤相关抗原791T/gp72。CD55蛋白的功能是保护细胞免受补体介导的攻击并且在癌细胞中通常发现该蛋白水平升高[Li，L.，等人(2001)Br.J.Cancer 8480-86]。在许多临床试验中显示了107AD5抗体的前景并且在许多患者中能测量到包括IL-2诱导的抗肿瘤免疫反应[Robins，R.A等人(1991)Cancer Res.515425-5429；Denton，G.W.L.，等人(1994)Int.J.Cancer 5710-14；及W090/04415]。然而更多最近的试验表明仅用抗体对大荷瘤患者可能无效，而有该抗体的疫苗接种策略对有微小残余疾病的患者可能更有好处[Maxwell-Armstrong，C.A.等人(2001)Bri.J.Cancer 841443-1446]。
尽管有明显的进展，还需要能在总体上对人癌细胞及CEA阳性癌细胞和/或特别是CD55过量表达阳性的癌引起免疫反应的改进分子。
发明概述本发明提供了适合用作针对CEA阳性肿瘤的抗独特型疫苗的多肽。发明人认识到对CEA荷瘤细胞需要诱导MHC I类和MHC II类介导的免疫反应的重要性，用于产生有效且持久的宿主抗肿瘤反应。文中的多肽组合物均能提供MHC I类和MHC II类限制性CEA表位。
本发明提供了修饰多肽，其中的多肽序列大部分来自小鼠抗独特型抗体708。当多肽序列与抗体708的V-区有共同的序列段时，本发明提供的许多实施方案中还另外提供了来自CEA和/或CD55抗原的序列段。又一实施方案中提供了进行氨基酸替代导致去除不需要T细胞表位的多肽序列。在这些组合物中目的集中于对CEA和/或CD55表位组分诱导的免疫反应并去除对需要的抗癌反应无贡献的竞争肽表位。
亲本708抗体用抗CEA抗体NCRC23作为抗原而产生的。NCRC23单克隆抗体自身与CEA特异表位结合并显示与正常组织的最小交叉反应性[Price，M.R.等人(1987)，Cancer，Immunology and Immunotherapy.2510-15]。抗独特型抗体708特异识别NCRC23并能在小鼠和大鼠中诱导识别CEA的Ab3抗体。特别重要的是708抗独特型抗体也能诱发癌患者的人T淋巴细胞识别CEA或表达CEA的肿瘤细胞[Durrant，L.G.等人(1992)，Int.J.Cancer.50811-816]。
已获得了708抗体的可变区序列并分析了与CEA蛋白区同源的序列元件的存在。H-链的第一和第二互补决定区(CDRH2和CDRH3)与CEA显示同源，但与密切相关分子NCA或BGP不同源。708可变区及H-链的互补决定区(CDRs)特别代表CEA分子特有元件的分子模拟物并且可能提供708抗体针对CEA的独特型性质的基础。
本发明包含亲本抗体708的经修饰衍生物。在所有优选的实施方案中经修饰708分子包括替代了亲本鼠C区的人C区结构域。在分子的V区进行了其它修饰。能将这些修饰总结为包括针对下列目标的一个或更多变化，其中至少包括针对CEA序列的变化I.将存在的CEA同源性区域转变为CEA序列相同区。
II.将存在的短序列段用CEA衍生序列段代替。
III.将存在的短序列段用抗体107AD5衍生序列段代替。
IV.将存在的短序列段用CD55衍生序列段代替。
V.通过将特异的氨基酸残基用另外的氨基酸残基替代，去除不需要的T-细胞表位。
因此本发明提供了新的多肽序列，这些多肽序列每一序列按照一个或多个上述目的设计并且每一序列的特征为具有与天然708V-区、人CEA分子和/或人CD55分子或以小鼠抗体107AD5形式的CD55分子的独特型同一性或高同源性的序列元件。本发明引入了许多多肽序列，这些多肽序列一起包含所有上述所列“设计元件”。于此公开的每一多肽是本发明的总之，本发明涉及下列主题·衍生自亲本抗独特型抗CEA抗体并且包含人源恒定区及人工合成可变区的免疫球蛋白分子或其片段，其中所述人工合成可变区包含一个或多个来自人肿瘤抗原CEA(癌胚抗原)的多于4、优选5-20个连续氨基酸残基的序列段。最优选有与对应的抗独特型抗体的轻链或重链的CDR有同样长度(氨基酸残基数量)(例如5、7、8、9、10、11、12、17、18)的序列段。
·对应的免疫球蛋白分子，其中至少所述序列段之一为所述免疫球蛋白重链和/或轻链的互补决定区(CDR)的组分或与所述CDR邻近的构架区邻近残基重叠。
·对应的免疫球蛋白分子，其中所述组分形成所述CDR的氨基酸残基的30至100％，优选80-100％。
·对应的免疫球蛋白分子，其中所述亲本抗独特型抗体为小鼠抗体708。然而，按照本发明，其它抗独特型抗CEA抗体也适合。
·对应的免疫球蛋白分子，可变区内还额外包含来自人CD55抗原或抗独特型抗CD55抗体(其中优选抗体105AD7)高变区的5至25，优选10至20个连续氨基酸残基的序列段。
·对应的免疫球蛋白分子，其中可变区内对CEA阳性人癌细胞的免疫反应无贡献的潜在MHC II类表位已通过氨基酸替代去除。
·在可变区内额外包含CEA衍生序列段的对应免疫球蛋白分子，所述CEA衍生序列段为对CEA阳性人癌细胞反应的MHC I类表位，优选TLLSVTRNDV和YLSGANLNL，其中在本发明一个优选的实施方案中所述序列为所述免疫球蛋白轻链一个或多个CDR的部分或全部。
·可变区内额外包含CEA衍生序列段的对应免疫球蛋白分子，所述CEA衍生序列段为对CEA阳性人癌细胞免疫反应有贡献的MHC II类表位。
·包含选自图4至7描述的任一序列的可变重链和/或选自图8和图9描述的任一序列的可变轻链的对应免疫球蛋白分子。
·对应的免疫球蛋白分子，其中可变重链和/或轻链包含与选自下列序列段具同一性的一个或多个序列段。
(i)人CEA的345-354；(ii)人CEA的387-396(iii)人CEA的571-579(iv)人CEA的629-645(v)人CD55的148-167·包含生物学有效量的上述免疫球蛋白分子、佐剂、和任选地包含可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
·任何上述免疫球蛋白分子或药物组合物的用途，用于制备对患CEA阳性实体肿瘤或转移肿瘤的人个体进行疫苗接种的药物，其中优选地所述疫苗接种在所述人个体中引起提高的刺激CD8和/或CD4阳性T细胞。
·用于产生适合用于治疗患CEA(癌胚抗原)阳性实体肿瘤或转移肿瘤的人个体的基于人工设计的免疫球蛋白分子的疫苗分子的方法，所述方法包括下列步骤(i)选择非人抗独特型抗CEA抗体，优选小鼠抗体708，(ii)将非人恒定区用人恒定区代替，(iii)用衍生自CEA的序列段部分或完全替代一个或多个高变区(CDR)，由此可能包括与所述CDR邻近的构架残基，且所述方法任选地包括选自以下的一个或多个步骤(iv)将可变区内的序列段用来自CD55抗原或抗独特型抗CD55抗体的CDRs的序列段替代，(v)将可变区内的序列段用对CEA阳性人癌细胞的免疫反应有贡献的MHC I类和/或MHC II类表位序列段替代，(vi)去除可变区内对CEA阳性人癌细胞的免疫反应无贡献的潜在MHC II类表位。
本发明的第一个实施方案提供的抗体分子包含具有人恒定区的抗体708。
第二个实施方案提供了具有人恒定区和V区结构域被特征性修饰的抗体708。在所述分子的一个或多个CDR区内进行了优选的修饰并导致与人CEA具同一性序列段的存在。认为这些CEA序列元件为“目的”表位。又一实施方案中通过引入其它CEA衍生的序列元件进一步增加目的CEA表位数量。又一实施方案中通过氨基酸残基替代又在序列内额外包括备选的目的表位。特别需要的备选表位是来自人CD55抗原或称为105AD7的小鼠抗体的序列元件，称为105AD7的小鼠抗体本身为可提供CD55蛋白分子模拟物的抗独特型单克隆抗体[Maxwell-Armstrong，C.A.，等人(2001)Bri.J.Cancer 841433-1436]。这些另外的目的表位可在包括CDRs和或邻近构架结构域的位置插入到抗体的V区。
在本发明的又一实施方案中，提供了在V区结构域内去除了不需要表位序列的包含一个或多个目的表位序列的抗体序列。在这种情况下这些序列为针对MHC II类的表位并且通过对人群中存在的至少一个MHC II类同种异型的配体构成的肽中通过公正的氨基酸替代而移出。
在本发明的方案下提供了4个不同H链V区序列和2个不同L链V区序列。本发明的公开对可提供组成完整抗体分子的H链和L链的可能组合没有限制。完整抗体分子的组成可通过本领域公知的重组DNA技术及纯化和处理抗体分子的方法完成。于此公开的编码多肽序列的多核苷酸(例如DNA)分子同样在本发明范围内并为优选的实施方案。
本发明的抗体分子用于完整应用但这不表明是限制性的，并且抗体的免疫原性片段也可考虑应用。因此Fv、Fab或F(ab′)2或其它衍生物可用重组技术或用常规的抗体蛋白酶剪切和纯化技术制备。
于此公开的抗体在包含免疫原性量及最优选治疗量的至少一种本发明经修饰抗体分子的组合物中有实用性是本发明的一个目的。免疫原性量或治疗量为抗体组合物能对接受治疗的患者刺激免疫反应并且最优选患者的免疫反应有体液反应和细胞反应这两者的量。最希望提供其治疗量导致患者免疫系统对表达CEA的肿瘤细胞显示增强活性的组合物。组合物在清除肿瘤细胞或阻止肿瘤生长中有治疗作用。
附图简述
图1提供了708抗独特型抗体和CEA的CDR区序列比较。粗体氨基酸为显示同一性的氨基酸并将下划线标在下一个氨基酸中具同一性或相似性的氨基酸下。
图2提供了708抗独特型重链CDR2和CDR3可变区MHC结合基序分析的实例。粗体氨基酸为显示同一性的氨基酸并将下划线标在下一个氨基酸中具同一性或相似性的氨基酸下。
图3显示抗体708可变区的蛋白质序列(单字母代码)。A＝重链；B＝轻链。有下划线的序列为CDRs。FR＝构架序列。CDR名称根据Kabat的方案[Martin，A.C.R.(1996)，蛋白质结构、功能和遗传，25130-133]但根据本发明残基编号已进行个别改变。
图4显示708VH1的蛋白质序列(单字母代码)。该序列包含去除不需要表位的708VH。有下划线的序列为CDRs。
图5显示708VH2的蛋白质序列(单字母代码)，该序列包含去除不需要表位并掺入额外CEA相关序列的708VH。有下划线的序列为CDRs。
图6显示708VH3的蛋白质序列(单字母代码)，该序列包含去除不需要表位并掺入额外CEA和CD55衍生序列的708VH。有下划线的序列为CDRs。
图7显示708VH4的蛋白质序列(单字母代码)，该序列包含去除不需要表位并掺入额外CEA和105AD7衍生序列的708VH。有下划线的序列为CDRs。
图8显示708VL1的蛋白质序列(单字母代码)，该序列包含去除了不需要表位的708VL。有下划线的序列为CDRs。
图9显示708VL2的蛋白质序列(单字母代码)，该序列包含去除不需要表位并掺入额外CEA相关序列的708VL。有下划线的序列为CDRs。
图10显示CEA的蛋白质序列(单字母代码)。
图11显示CD55抗原的蛋白质序列(单字母代码)。
发明详述本发明的分子为作为抗癌疫苗的活性组分有实用性的经修饰抗体分子。本发明因此涉及治疗性治疗人疾病。该分子来源于称为708的抗独特型抗体。708单克隆抗体为针对抗CEA单克隆抗体NCRC23制备的。天然的708抗体能阻止NCRC23与其抗原的相互作用并均能诱导特异识别该抗原的抗体和T细胞反应，但自然小鼠708抗体不能刺激正常供体的淋巴细胞[Durrant，L.G.等人(1992)，出处同上]。已对天然708抗体进行了许多修饰以改进其作为抗癌疫苗的能力。修饰导致如此处公开的组合物并为本发明的实施方案。对天然(亲本)小鼠708抗体的所有修饰可用本领域公知的基因工程方法进行。
第一个此种修饰对每一变体708分子是共同的。此修饰是对恒定区结构域的改造使它们为人恒定区蛋白质序列。本领域一般称此改造的抗体为嵌合抗体。在本发明中，将小鼠708抗体转变为嵌合抗体在经修饰708分子作为抗癌疫苗方面有非常显著效果。本发明人认识到刺激幼稚T细胞反应需要对抗原呈递细胞如树突状细胞的好的靶向作用。本发明的每一经修饰708分子的人恒定区结构域能通过树突状细胞和其它细胞上的Fc(CD64)受体而被摄入。通过此途径摄取显示了导致均引发辅助性T细胞反应和细胞毒性T细胞反应[Durrant，L.G.，等人(2001)，Int.J.Cancer.92414-420]。在本情况下将人IgG1同种型改造进708衍生的V区，尽管原则上理解为任何能被Fc受体系统识别的同种型均可用于本发明方案。
708抗体的第一个修饰是转换为嵌合抗体并且因此涉及到恒定区的改造，下一个修饰并因此为本发明的实施方案，为直接对亲本708抗体的V区进行改造。708的V区序列在以前已进行描述[W098/52976]并且又提供了如图3中的蛋白质序列。将互补决定区(CDR)序列对与CEA和相关序列如NCA的同源区已进行分析。CDRH2显示与CEA三个特异区有同源性并且其中两个也与NCA有同源性。第三个区在CEA特异区中。由于最初Ab1 NCRC23与CEA特异区结合，发现抗独特型708应包含CEA同源序列是可以预计的。除了CDRH2发现的区域外，CDRH3显示与CEA的三个区有同源性，这些区域与NCA也有同源性。多肽序列和多核苷酸序列的比较分析是本领域公知的并且许多软件工具能进行这些比较。用于比较如上所述抗体708和CEA序列的一个软件是“DNAstar”(DNASTARInc，Madison，Wl，美国)，该软件有几个特别用于蛋白质序列相似性分析的比对算法，包括Lipman & Pearson[Lipman & Pearson(1985)，Science2271435-1441]的工具。
也对抗体708的重链和轻链区及与识别的T细胞表位基序一致的人CEA区进行分析。此分析可用本领域公知的方法进行，例如如在W098/52976中描述或参考数据库SYFPEITHI[Rammensee，H.G.等人(1999)Immunogenetics 50213-219]。一个分析显示CDRH2区包括HLA-A3、A11、Aw68、B35、B53、DR1、DR3、DR7和DR8结合基序。对CEA序列的平行分析证实HLA-A3、DR1和DR7基序也存在于与CDRH2同源的CEA特异区。CDRH3区包含HLA-A2、A3、A11、A24、B27、DQ7、pan DR和DR1结合基序。HLA-A3基序也在CEA的同源区发现。虽然该CEA区也显示与NCA同源，但NCA有一个氨基酸不同，其中为从亮氨酸变为精氨酸。由于亮氨酸为A3结合的关键袋残基，表达NCA的细胞不可能将该表位递呈给HLA-A3。这些结果表明具HLA-DR1或7及HLA-A3表型的患者对天然708均显示辅助T细胞反应和细胞毒性T细胞反应并最可能对其CEA阳性肿瘤作出反应。
总之，这些结果和观测数据导致理解天然708V区序列提供了CEA分子的分子模拟物。此外，这些模拟物似乎针对CEA序列上的许多不同位点并且接下来这些序列与许多T辅助细胞和细胞毒性T细胞基序一致。本发明人通过将序列进行修饰以增加分子内CEA样序列的程度来寻找增加天然708序列的内在CEA样免疫原性特性。该方案延伸到包括在与将插入的CEA衍生序列没有预先存在同源性的位点处将另外CEA衍生序列元件插入到亲本708V区。这已通过免疫球蛋白V区能在特定区(CDRs)接受高变序列但仍保持总体结构完整性的内在灵活性及如任何其它免疫球蛋白分子那样被表达和加工的能力成为可能。该过程进一步受益于不需要工程化抗体而保留任何形式的抗原结合活性，真正最优选与任何抗原特别是细胞结合抗原无相互作用，通过本发明的制剂是可能的。
本发明的多肽分子是为了向受试患者的免疫系统提供免疫原性表位，以使患者免疫系统成为重新针对消除表达CEA的细胞而设计的。因此重要的是引发免疫系统的体液和细胞免疫并且这通过递送强效的T辅助表位和MHC I类限制性表位来提供。在CEA序列中以前已鉴定了许多MHC I类限制性表位并在某些情况下这些MHC I类限制性表位已作为临床试验的受试物[Kwong，Y.等人(1995)JNCI 87982-990]。在本发明中，已将已知为MHC I类表位的CEA衍生序列段TLLSVTRNDV(345-353位残基)和YLSGANLNL(571-579位残基)改造入轻链的CDRs中。
除了CEA衍生序列段的用途外，本发明的又一重要特征是掺入CD55序列和以来自抗体105AD7序列段形式的部分CD55分子的模拟物。CD55分子在正常人组织中广泛表达，它的功能是保护细胞免受补体和自然杀伤(NK)细胞介导的裂解作用。CD55作为免疫治疗靶的确实性来源于观察到的多种肿瘤类型CD55表达增加及用抗体105AD7的研究结果。该抗体模拟CD55上的表位并且临床试验证实在疫苗接种方案中，用完整105AD7抗体治疗的患者刺激T细胞反应[W097/32021和其中所有参考文献]。
本发明第一次提供了以来自CEA、CD55和/或105AD7免疫原性表位组合为特征的组合物。此外，在刺激人免疫反应方面将经证实的具生物学效力的每一表位作为免疫球蛋白分子的部分进行提供，较例如作为合成肽单独提供的同样表位的方案相比有显著的技术和生物学的优越性。作为分子实体能将本发明的多肽描述为“抗原化抗体”。在参考文献中报道的抗原化抗体包括以MHC I类和MHC II类表为组合位特征的抗体[Zaghouani，H.等人(1993)Eur.J.Immunol.232746-2750；Xiong，S.等人(1997)NatureBiotech.15882-886和其中参考文献]。本发明人理解这些方法没有针对自身抗原，没有利用独特型决定簇，也没有根据本发明采取步骤去除不需要免疫原性表位的非改造序列。同样，这些以前的研究没有提供针对癌免疫治疗的组合物。
因此本发明提供了包含与CEA分子区具有同一性的序列段的经修饰V区序列。本发明也公开了与CD55分子中存在序列段有同一性的V区序列。又在另一实施方案中公开了包含来自抗体107AD5序列段的经修饰V区序列。特别是提供了包含与来自CEA序列的345-354、386-397、571-579和629-645位残基相同的残基；并与CD55分子的148-167位残基相同序列的V区序列。将对应于抗体107AD5 VH链构架1的多数序列合并到本发明公开的一个变体中。特别优选按照图7的序列的组合物，所述组合物包含将文中描述的708VH3序列中的对应区用107AD5 VH构架1区代替的序列元件。
应当理解对于插入到经修饰708分子的VH链的CEA序列元件，是插入到与亲本分子存在CEA序列有显著同源性的区域。因此优选的图5所示VH组合物包含在VH链含有CDRH2区的区域处插入的CEA629-645位残基并且也包括在VH链含有CDRH3区的区域处插入的CEA386-397位残基。优选的VL链组合物提供了在VL链含有CDRL1和CDRL3区的区域处分别插入的CEA序列元件345-354和571-579位残基(图9)。包含CD55序列元件如148-167区的优选组合物包括在VH链包含构架1的远侧部分和整个CDRH1区域中插入所述CD55序列(图6)。
在此处术语“免疫原性”理解为在宿主动物及特别是“宿主动物”为人时，能引发、诱导或有助于体液反应和或T细胞介导的反应的能力。
在此处应用的“抗体”或“免疫球蛋白”是广义上的并特别包括了完整单克隆抗体、多克隆抗体、来自至少两个完整抗体分子的多特异抗体(例如双特异抗体)和抗体片段，只要它们显示所需要的生物学活性。该术语一般包括由连在一起的不同结合特异性的两个或更多抗体或其片段组成的异种抗体。
取决于它们恒定区的氨基酸序列，完整抗体可指定为不同“抗体(免疫球蛋白)类型”。完整抗体有5个主要类型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中一些可进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于抗体不同类型的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。根据本发明抗体优选的主要类型为IgG，更具体为IgG1和IgG2。
抗体一般为分子量约为150,000的糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中有变化。每条重链和每条轻链也有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端有可变结构域(VH)接着为许多恒定结构域。可变区包含含有抗原结合位点并负责抗体特异性的高变区或“CDR”区以及在抗体的亲和力/亲合力方面重要的“FR”区。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR” 的氨基酸残基(例如轻链可变域的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位残基及重链可变域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位残基；和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变域的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位残基及重链可变域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位残基；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))。“FR”残基(构架区)为除了如此处定义的高变区残基外的可变域残基。每条轻链在一端有一个可变域(VL)并在另一端有一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一个恒定域连在一起，并且轻链可变域与重链的可变域连在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成相互连结。来自任何脊椎动物物种抗体的“轻链”可根据它们的恒定域氨基酸序列分为两个明显不同类型称为kappa(κ)和lambda(λ)中的一种。
术语“互补决定区”(CDR)是指相对于抗体V区结构域的其余部分，其序列高变的抗体V区中的序列片段。抗原结合抗体的CDRs在决定抗体抗原相互作用中是决定性的。每个V区包含三个CDRs并且按规定来自VH的CDRs称为CDRH1、CDRH2和CDRH3。同样轻链CDRs称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。CDRs通过称为“构架”(FR)片段或结构域的相对不变序列的区域分散开。
在本发明中，对VH和VL链的CDRs及构架区均进行了修饰。一些修饰为分散的单个氨基酸的替代，而在其它情况下，已将新序列段插入到亲本V区序列中。
如此处所用的，VH表示长约110至125个氨基酸残基的多肽，它的序列对应于文中任何特定的VH链，与VL一起能组成免疫球蛋白分子。同样，VL表示长约95-130个氨基酸残基的多肽，它的序列对应于任何文中特定的VL链，与VH一起能共联合并组成完全的免疫球蛋白四聚体。全长免疫球蛋白重链分子量约为50kDa并在N末端通过VH基因编码及在C末端通过其中一个恒定区基因(例如γ)编码。同样，全长轻链分子量约为25kDa并在N末端通过V区基因编码及在C末端通过κ或λ恒定区基因编码。
本领域中术语“抗体”表示能结合、相互作用或此外与抗原连接的分子，并且应用的术语“抗原”是指能与抗体相互作用的物质。
在本发明上下文中容易认识到，构建的如以上定义及以下定义的经修饰免疫球蛋白序列是作为递呈特定免疫原性肽序列的运载工具并且没有预计或希望来自如此处公开的任何多肽序列组合形成的免疫球蛋白能作为抗原的结合实体。在除了抗原结合外的所有方面，如此处公开的分子保持了抗体的同样结构域结构和恒定区序列并因此继续认为是抗体。
如此处所用的术语“单克隆抗体”是指获自一群基本同质抗体的抗体，即组成该群体的单个抗体除了可小量存在的可能自然发生的突变外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一的抗原性位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体是有好处的因为它们可不污染有其它抗体而合成。制备单克隆抗体的方法包括Kohler和Milstein的描述(1975，Nature 256，495)及在“单克隆抗体技术，啮齿类和人杂交瘤的生产和特性”(1985，Burdon等人编辑，生物化学和分子生物学实验室技术，第13卷，Elsevier Science Publishers，Amsterdam)描述的杂交瘤方法，或可通过公知的重组DNA方法(参见，例如，US 4,816,567)进行制备。单克隆抗体例如也可用Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人J.Mol.Bill，22258，1-597(1991)描述的技术从噬菌体抗体库中进行分离。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体对应的序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体及这些抗体的片段对应的序列相同或同源，只要它们显示目的生物学活性(例如US 4,816,567；Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。制备嵌合抗体和人源化抗体的方法也是本领域已知的。例如，制备嵌合抗体的方法包括Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)在专利中描述的方法(US 4,816,397；US 4,816,567)。
本发明的免疫球蛋白可为其中的完整抗体或其片段。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含抗原结合或其可变区部分。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和Fc片段、双体、线性抗体、单链抗体分子和抗体片段形成的多特异抗体。“完整”抗体为包含抗原结合可变区以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1，CH2和CH3的抗体。优选地，完整抗体具有一个或多个效应子作用。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段包含单一抗原结合位点及CL和CH1区，以及残余的“Fc”片段，“Fc”片段的名称反映了它容易结晶的能力。抗体的“Fc”区通常包含CH2、CH3及IgG1或IgG2抗体主要类型的铰链区。铰链区为将CH1区与CH2-CH3区结合在一起的约15个氨基酸残基。胃蛋白酶处理产生有两个抗原结合位点并还能交联抗原的“F(ab’)2”片段。“Fv”为包含完全抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗体片段。该区由一条重链和一条轻链可变域紧密的、非共价结合的二聚体组成。正是在这种构象中每个可变域的三个高变区(CDRs)相互作用确定了VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。总之，六个高变区使抗体具有抗原结合特异性。然而，甚至单一可变区(或只包含抗原特异的三个高变区的半个Fv)有识别并结合抗原的能力，但比整个结合位点的亲和力低。Fab片段也包含轻链的恒定区及重链的第一个恒定区(CH1)。“Fab’”片段通过在重链CH1区的羧基末端加入几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。F(ab’)2抗体片段最初作为在Fab’片段之间有铰链胱氨酸的Fab’对而产生。也已知有抗体片段的其它化学偶联(参见例如Hermanson，生物偶联技术(BioconjugateTechniques)，Academic Press，1996；.US 4,342,566)“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含V及抗体的V结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。优选地，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含能使scFv形成抗原结合所需要结构的多肽接头。例如从Plückthun(单克隆抗体的药理学(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994))，WO93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等人(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)或Skerra和Plueckthun(1988，Science 240，1038)了解了单链FV抗体。
本发明的免疫球蛋白也可为双特异抗体。“双特异抗体”为有两个不同特异抗原结合位点的单一二价抗体(或其免疫治疗有效片段)。例如第一个抗原结合位点针对血管发生受体(例如整联蛋白或VEGF受体)，而第二个抗原结合位点针对ErbB受体(例如EGFR或Her 2)。双特异性抗体可通过化学技术(参见例如Kranz等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，5807)，通过“polydoma”技术(参见US 4,474,893)或通过重组DNA技术产生，所有这些技术本身是已知的。WO 91/00360，WO92/05793和WO 96/04305描述了其它方法。双特异抗体也可从单链抗体进行制备(参见例如，Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879；Skerra和Plueckthun(1988)Science 240，1038)。
本发明的免疫球蛋白也可为免疫偶联物。术语“免疫偶联物”是指抗体或免疫球蛋白或其免疫学有效片段分别地通过与非免疫学有效分子共价连接进行融合。优选该用于融合的部分为可糖基化的肽或蛋白质。所述非抗体分子可与抗体恒定重链的C末端或可变轻链和/或重链的N末端连接。所述用于融合的部分可通过接头分子连接，接头分子通常为包含3-15个氨基酸残基的肽。根据本发明的免疫偶联物由免疫球蛋白或其免疫治疗有效片段(针对受体酪氨酸激酶、优选针对ErbB(ErbB1/ErbB2)受体和整联蛋白拮抗肽或血管生成受体，优选整联蛋白或VEGF受体)及TNFα或实质上由TNFα和IFNγ或另外合适细胞因子组成的融合蛋白组成，后者的N末端与所述免疫球蛋白的C末端，优选其Fc部分连接。该术语也包括包含双特异或多特异免疫球蛋白(抗体)或其片段对应的融合构建体。
认为本发明的抗体分子作为疫苗制剂的活性(即免疫原性)组分发挥作用，其中术语“疫苗”描述了用于向受试者施用以诱导免疫反应的制剂。在本发明中免疫反应是治疗目的，虽然疫苗可用作肿瘤外科切除的辅助治疗或用于疾病或复发疾病的预防。
术语“T细胞表位”根据本发明的理解表示能结合MHC I类或II类，能刺激T细胞和/或也能结合(但不必是可测定地活化)T细胞与MHC I类或II类复合体的氨基酸序列。
文中及后附权利要求书中的如此处及附加的权利要求书中所用的术语“肽”为包括两个或更多氨基酸的化合物。氨基酸通过肽键(其中下面进行定义)连接在一起。有20种不同的参与肽生物学产生的天然存在氨基酸，并且它们的任何数目可以任何顺序连接形成肽链或肽环。肽的生物学产生中利用的所有天然存在氨基酸均为L-构型。合成肽可利用常规合成方法，利用L-氨基酸、D-氨基酸或两种不同构型氨基酸的多种组合进行制备。一些肽只包含几个氨基酸单位。短肽，例如低于十个氨基酸单位，有时称为“寡肽”。包含大量氨基酸残基例如达100或更多氨基酸残基的其它肽，称为“多肽”。按常规，“多肽”可认为是包含三个或更多氨基酸的任何肽链，而“寡肽”一般认为是特别类型的“短”多肽。因此，如此处所用的，可以理解任何引用的“多肽”也包括寡肽。此外，任何引用的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白质。氨基酸的每个不同排列形成不同的多肽或蛋白质。多肽的数目及由此可形成的不同蛋白质的数目实际上是无限的。
本发明提供了一系列经修饰VH及经修饰VL序列。如以前所述，IgG类型的抗体分子包含通过二硫键联合的两个H链和两个L链。应当理解原则上可以进行H链和L链的任何联合并且一条途径为在同一细胞中对有关抗体基因的共表达。对于本发明公开的多种H链和L链序列，没有打算对任何特别的H链和任何特别L链的组合进行限制，虽然特别优选的一套组合为H链1与L链1、H链2与L链2、H链3与L链2及H链4与L链2。可考虑其它组合并例如可包括以图3亲本708V区之一为特征的组合。
对于蛋白质衍生的抗原向MHC I类或II类分子的特异递呈，蛋白质必需在适当的区室进行正确加工以接下来释放和将肽递呈给MHC I类或II类分子。本发明分子的人恒定区结构域及特别是优选的IgG1同种型的存在使蛋白质进入抗原递呈细胞(APC)的机会增加到最大限度，在APC中蛋白质通过Fc(CD65)表面受体被摄取。一般的，如果蛋白质在细胞浆进行加工，有助于MHC I类肽的递呈，而如果蛋白质在内体区室进行加工，有助于MHC II类的递呈。外源蛋白质抗原经常引起较好的MHC II类介导的反应(特别是辅助性T细胞扩增)，但MHC I类介导的反应较弱。通过Fc(CD65)受体摄取代表一个特殊情况并导致均对I类和II类表位的最佳递呈[Durrant，L.G.(2001)，出处同上]。
MHC I类和MHC II类限制的组织特异性肽如产生自CEA蛋白质及可被T细胞识别的共同特征为它们对MHC肽结合沟的低亲和力[Pardoll，D.(1998)Nat.Medicine 4525-531]。因此，这些表位在相关术语中，以低效率向APC表面递呈并且它们的同种T细胞群不能形成对癌抗原自身肽的耐受。因此，非常需要提供在载体中可呈递癌抗原的疫苗制剂，所述载体能将呈递目标癌抗原的可能性达到最大并且递呈的可能竞争性肽的数目达到最小。在这点上，对本发明的分子存在的能结合MHC II类分子的肽进行分析并在本发明的一个实施方案中对这些有能力结合MHC II类的不需要的肽序列进行改变以使所述结合相互作用不再发生。
肽结合特定MHC II类分子用于向APC表面递呈的能力取决于许多因素，最显著的是它的一级序列。肽一级序列会影响肽的蛋白水解习性并影响它与MHC II类分子的肽结合裂(cleft)中的结合亲和力。APC表面的MHC II类肽复合体向能识别暴露的肽残基及MHC II类分子这两者所提供决定簇的特定T细胞受体(TCR)递呈了一个结合面。在本领域中，有鉴别能结合MHC II类分子的合成肽的方法，包括例如用于发现广泛反应DR限制性表位的方法[WO99/61916]，但由于加工途径或其它现象，这些肽不能在所有情况下特别是在体内作为T细胞表位。也提供了通过计算方法对实验确定的T细胞表位扫描而识别序列基序或备选地用计算技术预测MHC II类结合肽而检测T细胞表位的方法。WO02/069232提供了一个实施例，该实施例讲授了一个鉴别潜在结合人MHC II类DR同种异型亚型的多肽序列的计算threading方法。
本发明的特别目的是提供这样的多肽疫苗分子，其中针对疫苗的免疫反应最大集中于目的T细胞表位组并且减少了不需要的潜在T细胞表位的数目。可能应用以前公开的任何方法[WO98/59244；WO98/52976；WO00/34317，WO02/069232]鉴定708衍生肽与MHC II类分子的结合特性。实际上，本发明具体体现的组合物来源于利用WO02/069232中概括方案的软件工具进行了分析之后。简而言之，该软件在肽MHC II类结合相互作用水平上模拟抗原递呈的生物学过程以提供任一给定肽序列的结合分值。该分值由人群中现存的许多主要MHC II类同种异型来确定。由于这个方案能检验任一蛋白质序列，可预测氨基酸替代、添加或缺失在肽与MHC II类结合沟相互作用的能力方面引起的后果。因此可设计包含数目降低的能与MHC II类相互作用肽并因此作为免疫原性T细胞表位的新序列组合物。
得到在此处公开的组合物的方法因此包括第一，确定不需要的MHCII类结合肽，第二，通过氨基酸替代消除不需要的MHC II类结合序列使序列不能再与MHC II类系统结合，以及第三，对经修饰序列的任何继续结合MHCII类分子的能力或在修饰期间可能又引入的存在的任何MHC II类配体进行再分析。
因此MHC II类表位的去除涉及氨基酸替代以产生去除不需要T细胞表位的经修饰变体。氨基酸替代在预计可达到基本上降低或消除不需要T细胞表位的肽序列的适当位点进行。“适当位点”等同于MHC II类结合沟内提供的一个结合袋中氨基酸残基的结合。最优选在肽的所谓P1或P1锚定部位处改变与MHC结合裂中第一个袋的结合。对肽的P1锚定残基与MHC II类结合裂中第一个袋之间的结合相互作用的质认为是整个肽总体结合亲和力的主要决定因素。在肽的此部位适当的替代是将其替换为较不易与袋相匹配的残基，例如，替代为更亲水的残基。也考虑了肽中等同于在MHC结合裂中其它袋区结合位置处的氨基酸残基并落入本发明的范围。
如本领域技术人员清楚的，可进行多次备选替代以达到去除不需要表位的目的。然而产生的序列可与此公开的特异组合物仍有广泛同源性并因此归入本发明的范围。一般得到与本发明特异序列比它们的最小同源区有约70％或更高同源性并且又保持同样可操作性的序列。这些序列同样归入本发明的范围。
本发明公开了经修饰的包含与CEA分子区有同源性序列段的V区序列。在该同源性存在处，有亲本708抗体序列的本质特征。本发明提供了708亲本序列的经修饰形式并且在这方面提供了包含残基替代的抗体构架域区序列，所述残基替代是为了消除或降低施用于人受试者的分子的不需要免疫原性活性。不需要免疫原性活性涉及来源于亲本小鼠V区的序列元件并且不包括与人CEA、人CD55或有意改造入序列的105AD7抗体元件同源的序列元件。如此处定义的不必要或不需要表位可通过不需要序列元件与MHC II类分子结合的能力进行测定或通过在MHC II类分子内递呈刺激T细胞或与可结合人T细胞或T细胞受体复合物结合的可溶性MHCII类复合物结合的能力进行测定。
在本发明的方案下提供了4条不同的H链V区序列及2条不同的L链V区序列。本公开对可提供组合完整抗体分子的H链与L链的可能组合没有提供限制。完整抗体分子的组合可通过重组DNA技术及本领域公知的纯化和操作抗体的方法获得。必要的技术在著作中进行了充分解释，例如“分子克隆实验室手册”(“Molecular CloningA LaboratoryManual”)第二版(Sambrook等人，1989)；“寡核苷酸合成”(“Oligonucleotide Synthesis”)(M.J.Gait，编辑1984)；“动物细胞培养”(“Animal Cell Culture”)(R.I.Freshney，编辑，1987)；“酶学方法”(“Methods in Enzymology”)(Academic Press，Inc.)；“实验免疫学手册”(“Handbook of Experimental Immunology”)(D.M.Weir & C.C.Blackwell，编辑)；“哺乳动物的基因转移载体”(“Gene TransferVectors for Mammalian Cells”(J.M.Miller & M.P.Calos，编辑，1987)；“分子生物学最新方法”(“Current Protocols in Molecular Biology”)(F.M.Ausubel等人，编辑，1987)；“PCR聚合酶链反应”(“PCRThePolymerase Chain Reaction”)(Mullis等人，编辑，1994)；“免疫学最新方法”(“Current Protocols in Immunology”)(J.E.Coligan等人，编辑，1991)。
本发明优选的分子可通过几个途径中的任何一个进行制备，但最优选利用常规的重组方法进行。用在此处提供的蛋白质序列及信息推导编码任何优选抗体V区的多核苷酸(DNA)是相对容易的方法。这可例如用计算机软件工具诸如DNSstar软件包[DNAstar Inc，Madison，Wl，美国]或类似工具达到。有编码本发明优选多肽或其重要同源物能力的任何这些DNA序列均可考虑作为本发明的实施方案。
作为一般方案，任何VH或VL链基因可用基因合成进行制备并克隆入合适的表达载体。接下来将表达载体导入宿主细胞并对细胞进行筛选和培养。抗体分子易于从培养基进行纯化并制成用于治疗性施用的疫苗制剂。
通过非限制性实施例，一个此方案涉及用系列合成寡核苷酸进行基因合成的方法。基因用连接酶链反应(LCR)进行装配，其中特征为互补末端的寡核苷酸退火，然后通过用聚合酶链反应(PCR)进行扩增和填平。PCR通过加入增高浓度的侧翼寡核苷酸作为引物进行驱动。PCR产物通过来自包含5’和3’免疫球蛋白基因侧翼区的载体进一步PCR装配进全长抗体基因中并亚克隆到表达载体中用于完整抗体的表达。装配的VH和VL基因可作为突变发生的模板并构建多个变体抗体序列诸如任何在此处公开的序列。虽然易于应用其它方法和系统，但用如Higuchi等人描述的“重叠延伸PCR”策略[Higuchi等人(1988)Nucleic Acids Res.167351]尤其方便。
包含可变区盒的全长免疫球蛋白基因用重叠PCR进行装配。简单地说，载体M13-VHPCR1与M13-VKPCR1[Orlandi等人(1989)，PNAS，893833-7]的DNA用作模板以产生用于每一目的VH及VL链的另外两个重叠PCR片段，所述重叠PCR片段包括有小鼠重链免疫球蛋白启动子并编码前导信号肽的5’侧翼序列以及包括剪接位点及内含子序列的3’侧翼序列。这样产生的用于每一VH和VL的DNA片段用所需要的侧翼引物在PCR中进行联合，以获得全长DNA序列。
将5’和3’侧翼序列完全的重链基因克隆入表达载体pSVgpt[Reichmann等人(1988)Nature，332323]中，所述表达载体pSVgpt包括人IgG1恒定区结构域[Takahashi等人(1982)Cell，29671]及用于在哺乳动物中选择的gpt基因。将5’和3’侧翼序列完全的轻链基因克隆入表达载体pSVHyg[Reichmann等人，出处同上]中，所述表达载体pSVHyg中gpt基因被潮霉素抗性基因(hyg)代替并包括人κ恒定区结构域[Heiter等人(1980)Cell，22197]。对于这两个载体，完全装配的VH或VL基因作为HindIII/BamHI片段进行亚克隆，所述HindIII/BamHI片段通过凝胶电泳进行纯化并用公知的方法和试剂系统进行处理。
重链和轻链表达载体用电穿孔共转染到不产生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤NS0中，所述NS0获自欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)。对表达gpt基因的克隆用添加10％(v/v)胎牛血清及抗生素(例如来自Gibco，Paisley，英国)及0.8μg/ml霉酚酸和250μg/ml黄嘌呤(Sigma，Poole，英国)的Dulbecco改良的Eagles培养基(DMEM)进行筛选。由转染细胞克隆产生的人抗体通过用于人IgG的ELISA易于进行检测[Tempest等人(1991)BioTechnology 9266]。将分泌抗体的细胞系进行扩增并将抗体通过蛋白A亲和层析进行纯化[Harlow E.& Lane D.；出处同上]。经纯化抗体的浓度用检测目的抗体的人κ恒定区的ELISA进行确定。
根据本发明的分子可在单一疗法中单独施用或与其它药学有效药联合施用。其中所述药物可包括免疫治疗剂或具有细胞毒性的有效标记放射性同位素的化学治疗剂或其它细胞毒性剂如细胞毒性肽(例如细胞因子)或细胞毒性药等。如此处所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语用于包括放射活性同位素、化学治疗剂以及毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶学活性毒素或其片段。该术语也可包括细胞因子家族的成员，优选IFNγ以及也有细胞毒性活性的抗肿瘤剂。术语“化学治疗剂”或“抗肿瘤剂”根据本发明的理解是指作为如上说明的“细胞毒性剂”类的成员，并包括发挥抗肿瘤作用的化学剂，即直接对肿瘤细胞例如通过抑制细胞作用或细胞毒性作用，并且不是间接通过如生物学反应修饰的机制来防止赘生性细胞的发展、成熟或扩散。根据本发明合适的化学治疗剂优选天然或合成化合物，但不排除生物学分子如蛋白质、多肽等。在商业用途、临床评估和临床前研发中可获得许多抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂在本发明中可包括通过与TNFα及如上引用的抗血管发生剂，任选与其它因子如EGF受体拮抗剂联合治疗用于治疗肿瘤/瘤形成。应当指出化学治疗剂可任选与上述药联合一起施用。化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如，氮芥、乙烯亚胺化合物、烷基磺酸酯和有烷基化活性的其它化合物如亚硝脲、顺氯氨铂、达卡巴嗪；抗代谢药，例如，叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂抑制剂，例如，长春花属生物碱及鬼臼毒素衍生物；细胞毒性抗生素和喜树碱衍生物。优选的化学治疗剂或化学治疗包括阿米斯丁(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、双氯乙基甲胺(氮芥)、链唑霉素、环磷酰胺、卡氮芥(BCNU)、罗氮芥(CCNU)、阿霉素(阿得利亚霉素)、阿霉素脂质体(doxil)、吉西他滨(gemzar)、柔红霉素、柔红霉素脂质体(daunoxome)、甲基苄肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇(taxol)、多西紫杉(taxotere)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、碳铂、克拉利平、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、达卡巴嗪、氟尿嘧啶、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、去甲柔毛霉素、美司钠、α干扰素、β干扰素、依立替康、米托蒽醌、拓扑替康、醋酸亮丙瑞林、甲地孕酮、苯丙氨酸氮芥、巯基嘌呤、光辉霉素、邻对滴滴涕、天门冬酰胺酶、喷司他丁、哌泊溴烷、光辉霉素、链唑霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替哌、尿嘧啶芥、长春烯碱、苯丁酸氮芥与其组合。根据本发明最优选的化学治疗剂为顺铂、吉西他滨、阿霉素、紫杉醇(taxol)、博来霉素。
用经修饰的抗体组合物治疗性治疗人的方法是本发明的又一方面。对于个体的施用，生产的任何经修饰的抗体组合物优选至少80％纯度并且不含热原和其它污染物。还应理解经修饰抗体蛋白质的治疗性组合物可与本领域通常知道的佐剂和载体物质联合应用。这些物质自身不提供免疫原性表位。公知的佐剂包含矿物油乳剂并且称为弗氏佐剂，但同样可考虑其他制剂例如EP-A-0745388、EP-A-0781559、US，5,057,540；US，5,407,684；US，5,077,284；US，4,436,728；US，5,171,568和US，4,726,947或类似制剂。疫苗制剂优选与可药用赋形剂施用。这些赋形剂可作为稀释剂但可包括稳定剂、湿润及乳化剂、盐、包封剂、缓冲剂和皮肤穿透促进剂。在Remington′s药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Alfonso R.Gennaro，编辑，第18版，1990)中描述了实例。也可考虑将脂质体胶囊化作为制造用于治疗用途蛋白质的方法并且该用途也可包括包含生物学反应调节剂如GM-CSF和或IL-2或其它蛋白质的治疗方案。
认识到为引发免疫反应或治疗CEA相关肿瘤的个体，疫苗制剂肠胃外施与个体，并可包括皮内、肌内或皮内施用。术语“癌”和“肿瘤”是指或是描述哺乳动物中以不受调节的细胞生长为显著特征的生理疾病。通过根据本发明的分子和药物组合物，可对肿瘤优选CEA相关肿瘤进行治疗，其中所述肿瘤诸如乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头和颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈及肝脏的肿瘤。根据本发明优选结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和乳腺癌。
根据本发明的分子通过药物组合物向个体施用。本发明的“药物组合物”可包含降低或避免与本发明联合治疗(“辅助治疗”)相关副作用的药剂，包括，但不限于这些药剂，例如降低抗癌药毒性作用的药物，例如骨吸收抑制剂、心脏保护剂。所述辅助剂预防或降低与化学治疗、放射治疗或手术相关的恶心和呕吐发生率，或降低与施用骨髓抑制性抗癌药相关的感染发生率。辅助剂是本领域公知的。
根据本发明的免疫球蛋白剂优选与佐剂如BCG和免疫系统刺激剂联合施用。
施用的疫苗制剂的量取决于几个因素，例如患者的疾病和施用途径。非限制性实例剂量方案为约0.1mg至约20mg，并且剂量方案可每两周进行四次注射，接着按需要每个月进行注射。维持剂量取决于正在治疗个体的疾病和反应。
认为本发明的疫苗制剂特别用于作为癌常规外科手术的治疗辅助药并因此作为降低肿瘤再现及临床复发的可能性。
疫苗施用的效果包括临床试验以确定癌的进程，例如检测炎性指示物、乳房造影法、放射性闪烁显象术及本领域公知的任何其它临床手段。
特别优选确定接受本发明疫苗患者的细胞免疫反应。特别优选的测定法集中于特异性T细胞活性并包括例如测定T细胞增殖。在该测定法中，外周血单核细胞(PBMC)获自全血样本。细胞在存在合成肽如来自人CEA或人CD55的条件下进行培养或备选地用多种浓度的全CEA蛋白质或经辐照的CEA表达细胞进行攻击。优选地，刺激细胞与应答细胞自体同源。刺激指数(SI)一般用3H-胸苷的掺入作为细胞增殖的标记。在此测定法中如果测定的SI值至少在2.0优选2.5或更大，则可判定阳性CEA或CD55诱导的增殖。对于此测定法，SI＝CPM试验培养物/CPM未处理的对照培养物。
对细胞毒性T细胞形成提供“帮助”的Th1 T细胞的刺激，可通过在第8-10天的培养上清中测定γ干扰素的产生进行测定。γ干扰素的产生易于用商业上可获得的基于ELISA的系统进行测定。
CEA或CD55特异性细胞毒性T细胞的活性也是特别有用的信息。该类型特别合适的测定法由Kantor等人[Kantor，J.等人(1992)Cancer Res.526917-6925 & JNCI(1992)841084-1091]和Kwong等人[Kwong，Y.等人(1995)JNCI 87982-990]均有描述。该测定法涉及测定从标记的表达CEA的靶细胞释放到培养基中的51Cr并且测定特异释放到培养基中的51Cr与单独培养的标记靶(阴性对照)和用去污剂裂解靶(阳性对照)的百分比。
作为又一非限制性实例，现在描述了用于衍生本发明优选蛋白质序列的方法嵌合708的产生以前已进行描述(Durrant，L.G.，等人(2001)，Int.J.Cancer.92414-420)。用WO98/52976描述的方法对可变区蛋白质序列中不需要的T细胞表位进行检查并设计序列变体。对人CEA蛋白质序列[Schrewe，H.等人(1990)，Mol.Cell.Biol.102738-2748]，人CD55蛋白质序列[Caras，I.W.等人(1987)Nature 325545-549]及抗体107AD5可变区序列[WO97/32021]进行另外的分析。用商业上可获得的软件包(例如，“DNAstar”，DNASTAR Inc，Madison，Wl，美国)进行同源性比较分析，并如在其它处描述的[WO98/59244；WO98/52976；WO00/34317；Rammensee，H.G.等人(1999)出处同上]进行表位分析。对有潜力作为MHCII类结合配体的肽序列进行分析的方案在以前已进行详细描述[WO02/069232]。用此方法，在抗体708V区结构域中已鉴别了针对一个或多个同种异型的多个MHC II类配体。将去除了MHC II类配体的变体序列进行编辑。这通过反复几轮的氨基酸替代及确定表位去除的再分析达到。在图4-9中显示了目的组合物的蛋白质序列。
权利要求
1.衍生自亲本抗独特型抗CEA抗体并包含来自人源的恒定区及人工设计的可变区的免疫球蛋白分子或其片段，所述人工设计的可变区包含来自人肿瘤抗原CEA(癌胚抗原)的多于4个连续氨基酸残基的一个或多个序列段。
2.根据权利要求1的免疫球蛋白分子，其中所述序列段之一包含5-20个连续氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2的免疫球蛋白分子，其中至少一个所述序列段为所述免疫球蛋白的重链和/或轻链的互补决定区(CDR)组分或与所述CDR邻近的构架区邻近残基重叠。
4.根据权利要求3的免疫球蛋白分子，其中所述组分形成所述CDR的30至100％氨基酸残基。
5.根据权利要求3或4的免疫球蛋白分子，其中所述CDR为所述免疫球蛋白重链的CDR。
6.根据权利要求3的免疫球蛋白分子，其中每条重链和/或轻链的至少两个CDR完全由CEA衍生的序列段组成。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的免疫球蛋白分子，其中所述亲本抗独特型抗体为小鼠抗体708。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的免疫球蛋白分子，其在可变区内额外包含来自人CD55抗原或抗独特型抗CD55抗体高变区的5至25个连续氨基酸残基的序列段。
9.权利要求8的免疫球蛋白分子，其中所述抗独特型抗CD55抗体为小鼠抗体105AD7。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的免疫球蛋白分子，其中在可变区内对于针对CEA阳性人癌细胞的免疫反应没有贡献的其它潜在MHC II类表位已通过氨基酸替代去除。
11.根据权利要求1至10中任意一项所述的免疫球蛋白分子，其在可变区内额外包含为MHC I类表位的CEA衍生序列段。
12.根据权利要求11的免疫球蛋白分子，其中所述CEA衍生序列段为TLLSVTRNDV和YLSGANLNL。
13.根据权利要求11或12的免疫球蛋白分子，其中所述CEA衍生序列段是所述免疫球蛋白轻链的一个或多个CDR的部分，或所述CEA衍生序列段形成所述免疫球蛋白轻链完整的一个或多个CDR。
14.根据权利要求1至12中任意一项所述的免疫球蛋白分子，其在可变区内额外包含对CEA阳性人癌细胞的免疫反应有贡献的MHC II类表位的CEA衍生序列段。
15.根据权利要求1至13中任意一项所述的免疫球蛋白分子，其包含选自图4至7中描述的任一序列的可变重链。
16.根据权利要求1至13中任意一项所述的免疫球蛋白分子，其包含选自图8或图9描述的任一序列的可变轻链。
17.根据权利要求1至13中任意一项所述的免疫球蛋白分子，其包含选自图4至7中描述的任一序列的重链及选自图8或图9描述的任一序列的轻链。
18.根据权利要求1至11中任意一项所述的免疫球蛋白分子，其中可变重链和/或轻链包含与选自以下的序列段相同的一个或多个序列段(i)人CEA的345-354；(ii)人CEA的387-396；(iii)人CEA的571-579；(iv)人CEA的629-645；(v)人CD55的148-167。
19.药物组合物，其包含生物学有效量的权利要求1至18中任意一项所述的免疫球蛋白分子、佐剂及任选地可药用载体、稀释剂或赋形剂。
20.上述权利要求中任意一项所述的免疫球蛋白分子或药物组合物的用途，用于制备对患CEA阳性实体瘤或转移瘤的人个体进行疫苗接种的药物。
21.权利要求20的用途，其中所述疫苗接种在所述个体中引起对CD8和/或CD4阳性T细胞的刺激提高。
22.用于产生适用于治疗患CEA(癌胚抗原)阳性实体瘤或转移瘤的人个体的基于经人工设计免疫球蛋白分子的疫苗分子的方法，所述方法包括下列步骤(i)选择非人抗独特型抗CEA抗体，(ii)将非人恒定区用人恒定区替代，及(iii)用衍生自CEA的序列段部分或完全替代一个或多个高变区(CDR)，由此可能包括与所述CDR邻近的构架残基。
23.权利要求22的方法，其还包括选自以下的一个或多个步骤(iv)将可变区内的序列段用来自CD55抗原或抗独特型抗CD55抗体高变区的序列段替代，(v)将可变区内的序列段用对CEA阳性人癌起细胞反应的MHC I类和/或MHC II类表位的序列段替代，(vi)去除可变区内对CEA阳性人癌细胞的免疫反应无贡献的潜在MHC II类表位。
24.权利要求22或23的方法，其中所述非人抗独特型抗CEA抗体为小鼠抗体708。
全文摘要
本发明提供了适用作针对CEA阳性肿瘤的抗独特型疫苗的分子，优选地为经设计的免疫球蛋白。所述分子对CEA荷瘤细胞均可诱导MHC I类和MHC II类介导的免疫反应，以产生有效且持久的宿主抗肿瘤反应。本发明提供了有改进疫苗特性的抗独特型抗－CEA抗体，优选地为小鼠抗体708的经修饰形式。该修饰涉及将来自例如CEA、CD55抗原和CEA癌特异MHC表位的序列段导入到所述抗体分子的可变区中。
文档编号C07K16/28GK1646567SQ03807864
公开日2005年7月27日 申请日期2003年4月7日 优先权日2002年4月9日
发明者G·卡特, F·J·卡尔 申请人:默克专利有限公司