专利名称：：制备抗独特型抗体的方法制备抗独特型抗体的方法单克隆抗体(MAb)治疗在癌症、自身免疫疾病、移植排斥和其他病症治疗中的应用在最近几年日益广泛。特别是分子工程技术可将鼠类MAb转变为人源化或完全的人类分子，由此在患者治疗中减少针对该治疗剂的不良免疫反应(人抗人抗体-HAHA)。因此，用治疗性MAb的成功治疗事件显著增加，这主要是因为治疗性MAb减少或消除了免疫原性，增加了血清半衰期，并且提高了效应子功能。在这种情况下，开发出易于从所治疗患者血清中的内源IgG分子库中鉴别出治疗性免疫球蛋白(IgG)的合适分析方法显得极为关键。因此，需要对临床给予治疗性MAb进行药物代谢动力学分析、药物动力学分析、生物分布分析以及免疫应答诱导分析的工具。抗独特型抗体(抗-ID抗体)特异性结合其他抗体的可变区，因此可用于在药物代谢动力学研究中检测治疗性MAb，并且在治疗个体中有助于定量人抗人抗体(HAHA)反应。目前，这类抗独特性抗体是通过用目的治疗性抗体免疫实验动物，然后对独特型结合MAb的存在进行筛选而制备的。遗憾地是，治疗性MAb在实验动物中引发的免疫应答主要针对人抗体Fc部分，由此抗独特型抗体稀少且难以获得。而且，通过多克隆血清的亲和纯化方法从动物产生抗独特型抗体有许多不足，例如高百分比非独特型结合抗体、对正常免疫球蛋白低产量免疫吸附，以及每批制备物质量存在差异。因此，本发明提供了转基因非人动物在制备目的抗体的抗独特型抗体中的应用，其中该非人动物为外源抗体转基因动物，其中该目的抗体与该外源抗体具有相同同种型。这类外源抗体转基因动物表现出对与该外源抗体所有相同的同种型抗体Fc部分的耐受性，由此允许对该外源抗体相同同种型抗体的可变区进行免疫应答，从而产生不同的独特型抗体。EP05105946.7中已记载外源抗体非人转基因动物。然而，其没有公开本文中记载的应用。具体地，本发明提供了一种制备抗独特型抗体的方法，其包括a)产生外源抗体的转基因非人动物，b)利用该转基因非人动物诱导针对目的抗体的免疫应答，目的抗体借此与外源抗体具有相同种类的特异性同种型，以及e)由此产生直接针对目的抗体独特型部分的抗体。优选地，该方法进一步包括另一步骤d)分离该抗独特型抗体。分离抗体的方法，特别是分离来自体液(例如血液)的抗体的方法为本领域已知。更优选地，纯化抗独特型抗体。合适的纯化方法是本领域技术人员已知的。本文所用的术语"外源抗体"是指含有源自来源生物(例如人类)恒定区的抗体，将该抗体的编码DNA导入宿主生物(例如小鼠)，由此该宿主生物表达该抗体。来源生物与宿主生物不属于林奈分类系统同一物种。物种为一组实质或潜在的远交种群(interbreedingpopulation)。外源抗体可以为治疗性抗体。优选地，外源抗体为人类、人源化或嵌合抗体，其中至少嵌合抗体恒定区为人源的。更优选地，外源抗体为免疫球蛋白G(IgG)。进一步优选地，抗体为抗人淀粉状蛋白p肽或其变体的抗体。最优选，抗体为抗A卩IgGl。抗ApigGl在专利申请WO03/070760中有详细记载，其内容在此整体并入作为参考。本文所用的术语"变体"或"抗体变体"是指结构特性、制备方法、配制或存储条件与标准抗体不同的抗体。结构变体可包括一级蛋白质结构、二级蛋白质结构和三级蛋白质结构改变(即构象改变)，糖基化改变以及氨基酸化学修饰的改变。进一步地，结构变体为改变的结构域间构建体(VL/VL，VH/VH)、二聚体、寡聚体以及较大的聚集体。本文所用的术语"目的抗体"是指其恒定区与外源抗体恒定区属于相同同种型的抗体。抗体为"Y"形分子，其由两条重链和两条轻链组成。重链与轻链都有不同的型和亚型。每重链和每轻链都有恒定区和可变区，其中重链恒定区体积较大。术语"恒定区"或"C区"是指这样的抗体分子区，该区域与相同物种生物产生的不同特异性抗体的相应区域几乎完全相同。恒定区在相同种类抗体(同种型)中恒定，其负责特定免疫球蛋白亚类的效应子功能。Fc片段是指木瓜蛋白酶裂解抗体所产生的抗体片段，其包括大部分的恒定区。本文所用的术语"可变区"是指抗体分子结合特异性抗原的区域。它由重链和轻链的抗原结合位点组成。可变区在不同B细胞免疫球蛋白之间是不同的，但是在同一B细胞所产生的所有免疫球蛋白之间是相同的。可变区通过B细胞成熟期间发生的基因重组过程由体细胞产生。该过程为重排过程，该重排过程产生大量可结合任意给定抗原的多样性，由此能使免疫系统识别并中和外源和病原结构所导致的大量抗原负载(antigenicburden)。因此，抗体库由具有不同V区的丰富免疫球蛋白所组成，但该免疫球蛋白具有相同的Fc部分。术语"结合抗原片段"或"Fab片段"为含有可变抗原结合区的抗体片段，其通过木瓜蛋白酶裂解抗体产生。本文所用的术语"独特型区，，是指每类抗体特异的抗体可变区部分。本文所用的术语"抗独特型抗体"是指结合另一抗体独特型区的抗体。本文所用的术语"免疫应答"是指免疫系统对出现的抗原的反应。其涉及能结合抗原的抗体的产生。术语"同种型"是指抗原决定区，其区别在于重链的类和亚类、轻链的型和亚型。不同同种型抗体不仅可变区不同，而且恒定区也不同。因此例如，同物种IgG和IgM抗体属于不同同种型。导入另一物种的某物种抗体将优选^"导主要针对同种型免疫原性区域(同种型决定区)的抗异种抗体的产生。本发明的优选实施方案是制备抗人治疗性抗体的抗独特型抗体的方法，其包括a)产生人IgG抗体的转基因非人动物；b)在该转基因动物中诱导针对该治疗性抗体的免疫应答，以及c)产生对该治疗性抗体独特型区特异的抗独特型抗体。优选地，该方法进一步包括另一步骤d)分离抗独特型抗体。转基因非人动物可为任何非人动物。优选的非人动物为哺乳动物。更优选地，非人动物为啮齿类，如小鼠或大鼠。产生转基因非人动物的方法是本领域众所周知的。合适的方法在HoganB.，BeddingtonR.，CostantiniF.&LacyE.Manipulatingthemouseembryo.Alaboratorymanual.第2版(1994).ColdSpringHarborLaboratoryPress中有记载。制备表达外源抗体的非人转基因动物的优选方法包括a)将包含编码外源抗体的DNA的基因构建体导入非人受精卵或非人胚胎干细胞，b)从该受精卵或胚胎干细胞构建转基因非人动物，从而c)产生表达外源抗体的转基因非人动物。例如，转基因动物可通过下列步骤产生将上述DNA构建体注射至受精卵前核，转移该已注射的受精卵至假孕代孕母体，将卵母细胞所产生起始动物伺养至野生型动物，检测这些饲养动物后代是否存在合成的DNA转基因构建体，饲养半合子动物，任选构建纯合转基因动物。备选地，转基因动物可通过下列方法构建将上述基因构建体导入胚胎干细胞，然后筛选基因组中存在转基因的胚胎干细胞克隆，确认转化的胚胎干细胞克隆存在转基因，将确认的重组胚胎干细胞注射至野生型动物胚泡，将这些注射的胚泡转移至假孕代孕母体，祠养胚泡所产生的嵌合体至野生型，检测该饲养动物后代是否存在转基因，祠养半合子动物，任选构建纯合转基因动物。本发明中所用的非人转基因动物也可为上述方法之一所产生的非人转基因动物子代。子代可从饲养该非人转基因动物获得，其中该子代保留了该转基因动物的相同表现型。受精卵或胚胎干细胞可来自任何非人动物。优选地，受精卵或胚胎干细胞来自啮齿类。更优选地，受精卵或胚胎干细胞来自小鼠。为了构建转基因小鼠，受精卵或胚胎干细胞包括但不限于来自C57BL/6J、CBA/、BALB/c、DBA/2和SV129受精卵或胚胎干细胞(Seong，E等人(2004)TrendsGenet.20,59-62;Wolfer，D.P.等人，TrendsNeurosci.25(2002):336-340)。转基因非人动物中抗体的表达可以是组成型或诱导型。优选地，抗体表达为组成型。可通过下列方法诱导动物针对抗体的免疫应答，例如包括将该抗原皮下、静脉、损伤区、肌内或腹膜内(i.p.)注射或将该抗原口服给药(p.o.)。为了处理转基因非人动物，目的抗体可稀释或乳化于适于给予转基因非人动物的药学上可接受的载体。载体可为液体载体。合适的载体是本领域技术人员公知的，例如，盐溶液。优选地，载体为复水凝胶(Rehydrage)國HPAo分离所产生的抗独特型抗体的方法是本领域技术人员公知的。优选的方法包括a)从免疫外源抗体转基因非人动物获取血液样品，b)制备血清，例如通过凝固，和c)分离和纯化抗独特型抗体，通过层析法，例如亲和层析、离子交换层析和/或分子大小排阻层析。本文记载的非人转基因动物也可用于制备针对目的抗体的抗独特型单克隆抗体。制备单克隆抗体的方法是本领域技术人员周知的。该方法例如可为下列方法，其包括a)分离外源抗体转基因非人动物的脾细胞，b)制备骨髓瘤细胞，和c)将该脾细胞与该骨髓瘤细胞融合。由此产生的杂交瘤细胞可产生单克隆抗独特型抗体。表达外源抗体的转基因动物获得对该特定抗体的免疫耐受性。给定的转基因抗体，例如人抗ApigGl，可传递对相同同种型所有抗体Fc部分的耐受性，因而允许针对其他抗体V区的免疫应答。本发明方法可用于制备特异性识别治疗性抗体的抗体。这类抗独特型抗体在药物动力学研究中，以及在用相应治疗性单克隆抗体治疗个体的临床人抗人抗体(HAHA)反应研究中相当有用。此外，如上所述转基因小鼠所产生的抗独特型抗体可模拟抗原决定区，因此可作为替代抗原用于诊断目的，例如在抗原4吏用,皮限制的情况下应用。该应用包括竟争性免疫分析或直接血清学分析。用"内影"抗独特型抗体替代传统抗原的优点包括易于制备、在抗原有毒或因其他原因有危险情况下可安全使用、易于纯化、标记连接方法成熟、以及可能连接至固相而没有免疫反应损失。多种自身免疫疾病特征在于存在自身抗体。在确定自身抗体具有的独特型之后，上述转基因小鼠可用于制备抗独特型抗体，以诊断抗体介导的和自身抗体相关的自身免疫疾病。已证明在诸如重症肌无力、桥本甲状腺炎、类风湿性关节炎以及系统性红斑狼疮的疾病中出现特异性ID表达升高(IsenbergDA,WilliamsW，AxfordJ，等人，"ComparisonofAnti-DNAAntibodyIdiotypesinHumanSera,"JAutoimmunity,3:393-414，1990)。用作替代抗原以诊断人类传染病是抗独特型抗体的另一有用应用。现在本发明中概括记载的内容结合特定实施例和下列附图将能更容易理解，该实施例包含在本文中只是为了说明本发明，而不期望对本发明构成任何限制，除非本文另有说明。附图l显示了本方法的示意图。用例如单克隆人IgG抗体免疫的野生型小鼠将产生主要针对该单克隆抗体同种型部分的抗体。这些抗体可交叉识别所有人IgG。用例如单克隆人IgG抗体免疫的单克隆人IgG抗体转基因小鼠产生主要针对免疫IgG可变区(抗体独特型部分)的抗体，由此降低与其他人IgG的交叉识别。1)=免疫；2)=免疫应答；A)=单克隆人IgG抗体；8)=野生型小鼠，C)=所产生的主要针对单克隆抗体(A)同种型部分的抗体，CI)=所产生抗体(C)的识别位点位于单克隆人抗体(A)的同种型部分；D)=单克隆人IgG抗体(A)转基因小鼠；E)=所产生主要针对单克隆抗体(A)独特型部分的抗体，El)=所产生抗体(E)的识别位点位于单克隆人抗体(A)的独特型部分。图2显示了克隆至表达载体pHSE3，用于转基因表达的人AP特异性人Igyl基因的编码序列。PCR扩增所用引物位置和名称显示在相应序列上方或下方。前导序列以斜体显示。终止密码子以粗体显示。图3显示了克隆至表达载体pHSE3，用于转基因表达的人A卩特异性人IgK基因的编码序列。PCR扩增所用引物位置和名称显示在相应序列上方或下方。前导序列以斜体显示。终止密码子以粗体显示。图4显示了抗A卩IgGl(-Mab-ll)转基因小鼠的血清分析示意图。对人K轻链和人y重链进行特异性的夹心ELISA检测。MS:鼠血清、hlgGl:重组人免疫球蛋白yl同种型、F2F:起始小鼠2F、Neg:PCR阴性同步(littermate)对照、Tg5M+:转基因小鼠5M+、Tg7M+:转基因小鼠7M+。转基因小鼠表达同一分子的两条抗体链。图5显示了分子大小排阻层析图镨A)分子量标准、B)Mab-ll安慰剂、C)Mab-ll。没有检测到聚集体或片段。装置、工作条件和方法记载在实施例3中。图6显示了离子交换层析图语Mab-ll安慰剂(左边)，Mab-ll(右边)。装置、工作条件和方法记载在实施例3中。图7显示了Mab-ll和还原性/羧甲基化Mab-ll(RAMab-ll)在2-4%Bis-Tris凝胶上、非还原条件(A)和还原条件(B)下SDS-PAGE分析的示意图。染色用考马斯亮蓝染料。M:标准参照物、泳道1-3:Mab-ll、泳道4-7:RA画Mab國ll。图8显示了还原性/烷基化Mab-ll(RAMab-ll)LC/MS分析示意图。A)HPLC层析镨(C8RP-HPLC，UV-示踪，214nm)，峰代表轻链和重链；B)去叠加质^脊；C)B)中高分子量(HMW)质i普峰放大区。所检测质量显示在表3中。图9显示了如实施例5中所记载制备和分离的全长抗体、纯化Fab和Fc片段的SDS-PAGE图。左边数字表示分子量标准参照物条带的位置(单位kDa)。用考马斯亮蓝染料染色。SDS-PAGE在非还原条件下进行。M:分子量标准参照物、1:Humira，全长抗体、2:Humira,Fab國片段、3:Humira，Fc片段、4:Synagis，全长抗体、5:Synagis，Fab國片段、6:Synagis，Fc片段、7:Mab國ll，全长抗体、8:Mab國ll，Fab-片段、9:Mab-ll，Fc片段。将抗体和片段稀释于MES緩冲液，每种样品上样量为2吗。图10显示了第0天用Mab-ll免疫的野生型(WT)和Mab-ll转基因(TG)动物血清中第7天、12天、21天和35天的抗Mab-ll反应的ELISA示意图。该图分别显示了5WT和5TG小鼠免疫的平均值。该结果以免疫前血清O.D.的倍数表示。图11显示了(A)野生型小鼠和(B)Mab-ll转基因小鼠血清抗Humira反应的ELISA示意图，该图以免疫前血清O.D.的倍数表示。5只野生型(WT)和5只转基因(TG)小鼠在第0天用Humira免疫。在第7天、12天和21天检测抗Humira抗体滴度。图12显示了用Humira免疫21天后，5只野生型小鼠血清库中Humira、Synagis和Mab-ll的Fab-和Fc-片段血清反应性的ELISA示意图。结合以对照(免疫前的野生型)血清O.D.的倍数表示。图13显示了用Humira免疫21天后，5只Mab-ll转基因小鼠血清库中Humira、Synagis和Mab-ll的Fab-和Fc-片段血清反应性的ELISA示意图。结合(免疫前的野生型)以对照血清O.D.的倍数表示。实施例实施例中所涉及市售试剂按制造商使用说明使用，除非另有说明。实施例l:产生人免疫球蛋白转基因小鼠构建Mab-ll构建体使用免疫球蛋白(Ig)重链(H)同种型编码cDNA(SEQ.ID.NO:l)和人A卩肽特异性轻链(L)同种型k编码cDNA(SED.ID.NO:2)[Bardroff,M.e.a.，Anti-amyloidbetaantibodiesandtheiruse.EP03001759EP，2003。该抗ApIgGl抗体也称为Mab-ll。用表1中的引物在PCR反应中扩增cDNA。5'引物含有Sall(或相容的Xhol)位点，3，引物含有BamHI(或相容的BglII)位点，其可定向插入pHSE3"载体[Pircher，H.，等人，TcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVbeta8.1chaintransgenicmice.EmboJ，1989.8(3》第719-27页。PCR扩增的cDNA先用两种限制酶Sail和BamHI酶切，然后将其分别插入载体pHSE3，的相应位点。IgcDNA在pHSE3，中表达由鼠MHCI类基因H-2k的启动子驱动，并由位于克隆基因3，端的鼠IgH基因增强子增强[Pircher，H.，等人，TcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVbeta8.1chaintransgenicmice.EmboJ，1989.8(3》第719-27页。该表达载体可确保在转基因小鼠T和B'淋巴细胞中高水平产生相应插入基因产物([Pircher，H"等人，TcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVbeta8.1chaintransgenicmice.EmboJ，1989.8(3):笫719-27页]，结果未公布)。然后将包含(从5，至3，)H-2k启动子、插入的cDNA、poly-A、剪接位点以及IgH基因增强元件的全长表达框用限制酶Xhol从载体剪切，并琼脂凝胶纯化，制成合适浓度，以微注射受精的小鼠卵母细月包(2ng/ml于10mMTrisHCl/0.1mMEDTA，pH7)。cDNA的编码能力可通过抗ApIgH和L基因的全长编码cDNA的测序进行确认(参见图2和3)。引物名称序列限制位点(粗体)SEQ.IDGl,llSalfor(5，刷5，-ACGTGTCGACGCCGCCACCATGAAACACCTG-3'Sail(GTCGAC)3Gl.llBamreV(3，鹏5，國ACGTGGATCCTCATTTACCCGGAGACAG-3'Bamffl(GGATCC)4K.llXhofor(5，IgL)5，-ACGTCTCGAGGCCGCCACCATGGTGTTGCAG-3"XholCCTCGAG)K.llBglrev(3,IgL)5，-ACGTAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG國3'BglII(AGATCT)6表l:克隆引物的序列。产生抗ApIgGl转基因小鼠用1:1混合的纯化IgH和L基因(上述部分记载的)编码Xhol片段对C57BL/6雌性供体受精卵母细胞进行微注射以获得双转基因动物。用特异性引物扩增尾部活组织检查制备的基因组DNA，以从这些微注射胚胎所产生的幼仔中筛选转基因的存在。所用引物示于表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2:检测转基因的引物序列。用1pl(约100ng)尾活组织检查总DNA进行PCR反应，PCR反应在下列条件下进行卯。C1分钟，30x[94'C10秒；64tl30秒；72'C90秒，72C7分钟。约660bpPCR扩增DNA片段，最后在1.5%琼脂凝胶中可见，其分别对应于转基因IgH基因和转基因IgL基因。实施例2:转基因小鼠的表现型特征血清分析尾静脉穿刺Wi。室温过夜凝固。500xg离心IO分钟分离血清，20'C冷冻至下一步分析。为确定转基因小鼠是否表达全长人抗体，建立ELISA系统。用多克隆山羊抗人k链特异性抗体(SigmaK3502)俘获人抗体。用偶联过氧化物酶的单克隆小鼠抗人Y链特异性抗体(POD,SigmaA0170)进行检测。如图4所示，转基因鼠表达全长人免疫球蛋白。用人IgGl抗体HUMIRA(Abbott)免疫分析抗近缘抗原的反应。10jigHUMIRA用200jil复水凝胶HPA(Reheis)乳化。第0天腹膜(i.p.)免疫动物，第7天、12天、21天和35天尾静脉穿刺^U6l,制备血清，ELISA分析抗HUMIRA滴度，该ELISA用HUMIRA包被maxisorp平板(Nunc)俘获抗HUMIRA抗体并用小鼠抗IgG(BDPharmigen)检测该抗体。如图11所示，野生型和转基因小鼠都显示出抗近缘人IgGl抗体HUMIRA的反应。实施例3:Mab-ll(也称为抗A卩IgGl)的制备、纯化和表征用实施例1该转基因相同序列IgGl的编码cDNA转染的中国仓鼠卵巢细胞在无血清条件下产生Mab-ll。Mab-ll从培养上清液的分离和纯化所有步骤仅用钢化玻璃器皿在无内毒素条件下进行，包括柱在内的所有装置用0.5MNaOH进行灭菌处理，无菌过滤(0.22)所有緩冲液。仅使用新鲜的凝胶材料。作为第一个纯化步骤，用MabSelect凝胶(Amersham)进行A蛋白亲和层析。预电泳之后，将柱用25mMTris/HCl、25mMNaCl、5mMEDTA，pH7.1平衡，并将CHO细胞培养物的滤过上清液上样至凝胶。用100mMHAc,pH2.9洗脱A蛋白结合的抗体。为灭活病毒，用HAc调整洗脱液至pH^3.6，然后室温下温育15分钟，然后用1MTris调整pH至pH4.0。作为第二个纯化步骤，用SP-Toyopearl650M(Tosoh)为基质进行离子交换层析(阳离子交换层析)。预电泳后，将步骤1的洗脱级分上样至凝胶，用緩冲液A平衡(50mMHAc，pH5.0)，然后用0-100%緩冲液B(50mMHAc，1MNaCl，pH5.0)梯度洗脱。收集洗脱的蛋白质级分，超滤浓缩，并调整至pH7.5,用IEX和SECHPLC进行分析。作为第三个纯化步骤，用Q-SepharoseFF凝胶(Biorad)作为固定相，用25mMTris/HCl、80mM乙酸钠，pH7.5作为流动相，进行分子大小排阻层析(流通阴离子交换层析)。按UV信号分离流出级分。緩冲液至Mab-ll安慰剂(不含Mab-ll的緩冲液)的转换以及浓度调整用10kDa膜在Amicon搅拌杯(Amicon)中进行，其中该Mab-ll安慰剂含有20mM组氨l140mMNaCl，pH5.5。最后，将溶液用0.22jimMillex-GV无菌滤膜(Millipore)过滤，于-80'C等份储藏。抗ApIgGl(Mab-ll)的表征用SDS-PAGE、大小排阻层析、离子交换层析检测所纯化Mab-llIgGl蛋白的完整性和异质性，用下述还原性和羧甲基化Mab-ll抗体的LC/MS分析进行一级序列的确认。大小排阻层析用JascoPU-980HPLC系统的大小排阻层析分析纯化的Mab-ll样品。在以0.2MK2HP04、0.25MKC1，pH7.0作为流动相的TSK-GelG3000SWXL，7.8x300mm，5jim柱(ToshoBiosciences)中进行样品层析。流速i更置为0.5ml/分钟。用与Merck-HitachiD-2500记录系统相连的JascoUV-975检测仪在220nm处监测吸光度。平衡柱直至获得稳定基线。按凝胶过滤标准物(BioRad，151-1卯1，包括670kD牛甲状腺球蛋白、158kD牛IgG、44kDOVA、17kD马(eq.)肌红蛋白以及1.35kD维他命B12)、Mab-ll安慰剂(阴性对照无Mab-ll的緩冲液)、Mab-ll样品顺序注射。注射量对应约50吗样品。示意性大小排阻层析图谱如图5所示。滞留时间对称J^相应于155-160kba。没有检出聚集体或片段。离子交换层析用JascoPU-980HPLC系统的离子交换层析分析纯化的Mab-ll样品。20分钟内用0%B-52%B梯度在MonoS5/50GL柱(AmershamBiosciences)上对样品进行层析(固定相A:50mM丙二^/丙二盐于水中，pH5.3;流动相B:1M乙酸钠于固定相A中，pH5.3)。流速设为1ml/min。用与Merck-HitachiD-2500记录系统相连的JascoUV-975检测仪在280nm处监测吸光度。将柱用固定相A平衡直至获得稳定基线。按Mab-ll安慰剂、Mab-ll样品顺序注射。Mab-ll注射量大约为50fig。示意性离子交换层析图镨(IEC)如图6所示。结果>95%Mab-ll样品在高滞留时间、以没有可分辨肩峰的单峰洗脱。约5。/。在短滞留时间洗脱。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳将纯化的Mab-ll和还原性/羧甲基化Mab-ll(RAMab-ll，制备参见下文)样品用XcellMini-cellIIGel系统(Invitrogen)进行SDS國PAGE分析。将预稀释样品与还原性或非还原性样品緩冲液混合至2-8jig/20jil浓度。还原性样品緩冲液按制造商建议将NuPAGELDS样品緩冲液(Invitrogen)与NuPAGE还原剂(Invitrogen)混合而制备。样品在还原性样品緩沖液中70'C温育10分钟。样品和标准物上样至10孔梳、1.0mm厚的NuPAGE4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen，弁NP0301BOX)上。使用覆盖范围200-2.5kDa的Mark12TM分子量标准参照物(Invitrogen,弁LC5677)作为标准物。用NuPAGEMOPSSDS电泳緩冲液(Invitrogen)在200V凝胶电泳l小时。凝胶用StainEaseGel染色盘(Invitrogen)染色过夜，用光密度测定法扫描并分析。根据同一凝胶上标准参考物的标准样品线计算蛋白浓度。结果非还原条件下SDS-PAGE:全长Mab-11,条带对应于IgG的期望分子量；RAMab-ll，两条带对应于IgGlH-和IgGlL-链分子量。未检出全长或部分还原性Mab-ll。还原条件下SDS-PAGE:全长Mab-11和RAMab-ll两者都有，两条带对应于IgGlH-和IgGlL-链分子量。未检出聚集体或片段(参见图7)。质谱用LC/MS分析确定一级结构.还原性和羧甲基化Mab-11抗体以Lundell和Schreitmfiller所记栽方法(Samplepreparationforpeptidemapping—Apharmaceuticalquality-controlperspective.AnalBiochem.1999年1月1日；266(1):31-47)进行制备。使用梯度系统(A:水0.1%甲酸、B:乙腈0.1%甲酸)在AgilentPoroshellC8-反相柱(0.5x75mm)上进行分析性RP-HPLC分析。接着将层析流以正态、锁闭喷射质量校正(lockspraymasscorrection)状态进入ESI画Q画TOF质i普(Micromass/WatersQ-TOFUltima,Manchester,UK)的ESI离子源。蛋白图语用MasslynxMaxEntl模块去叠加。RA-Mab-11的LC/MS分析示于图8中，观测质量和计算质量如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>M+H十23845DaMab-ll;L链，还原性和羧曱基化的(23844Da)51770DaMab-ll;H链-G。，Pyro-Glu，-Lys，还原性和羧甲基化的(51770Da)51932DaMab國ll;H链國G!，Pyro-Glu，画Lys，还原性和羧甲基化的(51932Da)52094DaMab-ll;HM-G2，Pyro-Glu,-Lys，还原性和羧曱基化的(52094Da)表3:RA-Mab-11的LC/MS分析;Sjt见测质量的分布(参见图8)。L-链=轻链，H-链-重链，Go，Gi，G2-H链糖基化，Pyro-Glu=含焦谷氨酸的M酸序列，-Lys=H链氨基酸序列上1个赖氨酸缺失。检测质量与H链有一个Pyro-Glu和一个Lys缺失的Mab-ll—级序列抗体的还原性/羧甲基化H-和L-链理论期望质量相匹配。H-链以G。，&糖基化为主，G2糖基化仅占小部分。实施例4:耐受性免疫分析将转基因和野生型同窝对照小鼠(N-5/每实验)用乳化于200pl复水凝胶-HPA(Reheis)的10jig重组Mab誦ll进行腹膜(i.p.)免疫。第7、12、21和35天，尾静脉穿刺取血。血清通过如上所述凝固制备，用ELISA检测血清抗Mab-ll滴度。室温下将Mab-ll以0.2吗/孔包#7不包被maxisorp平板(Nunc)。洗涤后，将孔用PBS/0.1。/。(v/v)Tween-20/0.1。/。(w/v)BSA封闭，然后加入1:100稀释血清在定轨摇床上振荡温育1小时。按制造商建议用1:100稀释的APK-标记的抗小鼠IgG(BDPharmingen)检测抗体结合。ELISA分析显示野生型动物中可产生抗Mab-ll强免疫应答，而hlgGl-转基因动物不能对重组Mab-ll产生强免疫应答(图10)。因此，Mab-ll转基因小鼠可耐受以外源方式提供的转入其的抗体转基因产物。实施例5:Humira、Synagis和Mab-ll的Fab-和Fc-片段的产生和分离将单克隆抗体Humira、Synagis⑧(Palivizumab，ABBOTTAG，存2422260A)和Mab-ll用木瓜蛋白酶消化，产生Fab-和Fc-片段，该片段用离子交换层析(IEC)分离。简而言之，用葡聚糖凝胶TMG-25MPD10柱(AmershamBioscience)将抗体制剂緩冲液转换为0.1MTris，4mMEDTA，1mM半胱氨酸，pH7.4，然后稀释至浓度为3-5mg/ml。加入木瓜蛋白酶(RocheDiagnostics)至0.01mg/ml的终浓度。37。C温育2小时后，用Amicon超离心过滤设备(MiIlipore)lOkDa超滤，将緩冲液转换为20mML-组氨酸，pH5.5。用PL國SCX1000A，8um,4.6x150mm(PolymerLabs)或MonoSTM5/50GL柱(AmershamBiosciences),分别以50mM3-(N誦吗啉代)丙磺酸(MOPS)(Applichem)pH6.7至50mMMOPS中的1M乙酸钠，pH7.0的梯度，或10mM2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)pH6.0至10mMMES、0.2MNaCl，pH6.0的梯度，用制备性IEC进行Fab-和Fc-片段分离。收集含有蛋白质的级分，用10kDa超滤(AmiconUltra,参见上文)将緩冲液转换为20mML画组氨酸、140mMNaCl、0.01%Tween,pH5.5。用实施例3所述的非还原条件SDS-PAGE鉴定所浓缩的级分。结果如图9所示。实施例6:产生抗独特型抗体将Humira(Adaliinumab，ABBOTTAG,#04H-640-E694-l)用作Mab-ll相同同种型的独特型抗体的实例。Humira为治疗类风湿性关节炎的TNF特异性治疗单克隆人抗体。Mab-ll和Humira都是IgGl抗体，它们Fc部分和Fab恒定区的一级序列相同或几乎相同。将IO吗HUMIRA乳化于200jil复水凝胶HPA(Reheis)。第0天腹膜(i.p.)免疫动物，第7、12、21天尾静脉穿刺取血，制备血清，ELISA检测抗HUMIRA滴度。用HUMIRA包被maxisorp平板(Nunc)用以俘获,用上述抗小鼠IgG(BDPharmigen)进行检测。如图11所示，野生型(A)和转基因小鼠(B)都对HUMIRA产生强免疫应答。实施例7:评测抗Humira血清对独特型抗体的交叉反应性为评测Humira免疫的WT和TG小鼠血清中抗Humira抗体的特异性，用Fc部分和Fab恒定区一级序列相同或几乎相同的Humira、Mab-11和Synagis作为独特型人IgGl的实例，进行ELISA。Synagis(Palivizumab，ABBOTTAG，#2422260A)是用于治疗RSV感染的单克隆人源化IgGl。Humira,Mab-11和Synagis的Fab和Fc片段按实施例5记载的方法制备并分离，并在室温下以0.2照/孔包被maxisorp平板(Nunc)。洗涂后，将小孔用PBS/0.1%(v/v)Tween-20/0.1%(w/v)BSA封闭。加入用Humira免疫的五只转基因小鼠和五只野生型小鼠的1:100稀释血清库，在定轨摇床上振荡温育l小时。按制造商建议，用1:100稀释的APK-标记抗小鼠IgG(BDPharmingen)检测抗体的结合。ELISA分析显示，血清抗体与测试抗原的结合存在显著差异。对于野生型动物，观察到对所有测试抗体的Fab-和Fc-片段均产生强免疫应答。因此，野生型动物中所产生的免疫应答主要针对人IgGl恒定区，这解释了观察到的对所有测试抗体Fab和Fc部分的强烈交叉识别(图12)。相反地，对于Humira免疫的Mab-11转基因小鼠，检测到针对HumiraFab部分的强抗体应答，而对Humira的Fc和Fab以及所有其他测试独特型抗体Fc部分的结合仅为背景水平(图13)。因此，可以得出结论人抗体Mab-11转基因动物可产生主要针对免疫独特型抗体的可变、独特型特异区的免疫应答。本文也显示，本发明的IgGl转基因鼠对转基因表达的IgGl抗体耐受，而当用相同IgGl同种型的不同人抗体^b^时，可产生强免疫应答。产生的免疫应答仅针对用于激发的人IgGl分子的V区，而Fc区被巧妙忽略。人抗ApigGl转基因小鼠的特性可使其成为迅速、有效产生抗独特型单克隆抗体的有价值的工具。序列表〈110〉弗哈夫曼-拉罗切有限公司〈120〉制备抗独特型抗体的方法〈130〉23856<160〉10<170〉Patentln版本3.3〈210〉1<211>1562〈212〉DNA〈213〉人(Homosapiens)〈400〉1gcgccaccatgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcc60tgtcccaggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgc120gtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgcc180aagcccctgggaagggtctagagtgggtgagcggtattaatgctgctggttttcgtactt240attatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccc300tgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtg360gtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaag420gcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac480cctcctccaagagcacctctgggggcacagcagccctgggctgcctggtcaaggactact540tccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacacct600tcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccct660ccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacca720aggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcc780cagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca840ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaag900accctgaggtcaagttcaacagccgcgggaggagcagtacaccaggactggctgaatggccccccatcgagaaaaccatcccctgcccccatcccgggataaggcttctatcccagcgacactacaagaccacgcctccctcaccgtggacaagagcaggaggctctgcacaaccactaccacggccggcaagcccccgcaccccgtgtacatacttcccgg<210〉2〈211〉715〈212〉DNA〈213〉人〈400〉2cgccaccatggtgttgcagactacggggatatcgtgctgatgcgaccctgagctgcagaggcagaaaccaggtcaagcacggtcccggcgcgttttagcgcctggaacctgaagactttgctttggccagggtacgaaagcttcccgccatctgatgagctaacttctatcccagagaggtaactcccaggagagtgtcatggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa%0aacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgc1020aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccag1080tccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca1140gagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtca1200atcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaaca1260gtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagc1320tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatg1380acacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtgc1440tccccaggctctcggggtcgcgcgaggatgcttggcacgt1500aggcacccagcatggaaata犯gcacccagcgcttccctg15601562cccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgc60cccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacg120cgagccagtatgttgatcgtacttatctggcgtggtacca180cgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactgg240gctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcag!300cgacttattattgccagcagatttattcttttcctcatac360ttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcat420agttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaa480ccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcggg540cagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcag600caccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcac660cca/tcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc犯caggggagagtgttag715<210>3<211>31<212>腿<213>人工的<220><223〉人工序列的描述Gl.llSalfor,人抗AeIgGl重链5'末端引物〈400>3acgtgtcgacgccgccaccatgaaacacctg31<210>4<211>28<212>DNA<213>人工的<220><223>人工序列的描述Gl.11Ba虹ev，人抗APIgGl重链3'末端引物〈400>4acgtggatcctcatttacccggagacag28<210>5<211〉31<212>DNA〈213〉人工的〈220><223>人工序列的描述K.11Xhofor,人抗APIgGl轻链5'末端引物〈400>5acgtctcgaggccgccaccatggtgttgcag31<210〉6〈211〉29<212>腿〈213>人工的<220>〈223>人工序列的描述K.11Bglrev,人抗APIgGl轻链3'末端引物<400>6acgtagatctctaacactctcccctgttg29<210〉7〈211〉27<212〉DNA<213>人工的<220><223>人工序列的描述5H2KP，人抗APIgGl重链基因PCR引物<400〉7atgaattcacagtttcacttctgcacc27〈210>8<211>20<212>腿<213>人工的〈220><223>人工序列的描述G1.0501,人抗IgGl重链基因PCR引物<■>8tgtactccttgccattcagc20<210>9<211>27<212>薩<213>人工的〈220〉<223>人工序列的描述5H2KP,人抗APIgGl轻链基因PCR引物<400>9atgaattcacagtttcacttctgcacc27<210>10<211>20〈212>醒<213>人工的<220><223>人工序列的描述K.44,人抗AeIgGl轻链基因PCR引物〈400>10gctcatcagatggcgggaag20权利要求1、转基因非人动物在制备针对目的抗体的抗独特型抗体中的应用，其中所述非人动物为外源抗体转基因动物，并且其中所述目的抗体与所述外源抗体具有相同同种型。2、权利要求1的应用，其中所述外源抗体和目的抗体为人抗体或人源化抗体。3、权利要求1或2的应用，其中所述外源抗体和目的抗体为IgG抗体。4、制备针对目的抗体的抗独特型抗体的方法，其包括a)产生外源抗体转基因非人动物，b)在所述转基因非人动物中诱导针对目的抗体的免疫应答，其中目的抗体与外源抗体具有相同同种型，以及c)制备直接针对目的抗体独特型部分的抗体。5、权利要求4的方法，其中所述方法包括另一步骤d)分离抗独特型抗体。6、权利要求4或5的方法，其中所述外源抗体和目的抗体为人抗体或人源化抗体。7、权利要求4-6中任一项的方法，其中所述外源抗体和目的抗体为IgG抗体。8、与本文前述记载实质上相同、特别是参考前述实施例的方法和应用。全文摘要本发明涉及外源抗体转基因非人动物在制备抗独特型抗体中的应用，以及制备抗独特型抗体方法，该方法包括a)产生外源抗体转基因非人动物，b)在该转基因非人动物中诱导针对目的抗体的免疫应答，其中目的抗体含有与外源抗体相同种类的特异性同种型，以及c)制备针对目的抗体独特型部分的抗体。文档编号C07K16/18GK101186651SQ200710194470公开日2008年5月28日申请日期2007年11月6日优先权日2006年11月6日发明者A·伊格莱希亚斯,H·贝克,M·措赫尔,T·施莱特米勒申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司