卵巢癌抗独特型微抗体的生产方法

专利名称：卵巢癌抗独特型微抗体的生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产卵巢癌抗独特型微抗体的方法，以及有关的工程细胞的构建、卵巢癌抗独特型微抗体表达和纯化工艺。
背景技术：
1974年Jerne根据现代免疫学对抗体分子独特型的认识，在Burnet“克隆选择学说”的基础上提出了著名的免疫网络学说。该学说认为，任何抗体分子或淋巴细胞的抗原受体上都存在着独特型，它们可被机体内另一些淋巴细胞识别而刺激诱发产生抗独特型。以独特型同抗独特型的相互识别为基础，免疫系统内构成“网络”联系，在免疫调节中起重要作用。根据免疫网络学说，抗独特型抗体(anti-Id或Ab2β)(抗原刺激机体后产生抗体，这种抗体Ab1再次刺激机体产生抗抗体Ab2，抗抗体分为三种，其中一种为抗独特型抗体，抗独特型抗体中的Ab2β具有模拟抗原的作用)。具有模拟原始抗原诱导机体产生针对始动抗原的特异性抗体或细胞免疫应答，因而可抑制Ab1与相应抗原的结合反应。Ab2β具有与外来抗原相似的氨基酸排列顺序或空间构型，它能够在体内模拟始动抗原的作用，应用Ab2β的这一特性，可有目的地制备Ab2β，将其作为抗原的替代物用于基础和临床医学研究。同时，Ab2β不仅可激发针对外来抗原或自身抗原Ab1产生前体细胞，使机体对入侵到体内的抗原迅速发生免疫应答，而且与记忆细胞的存在有关。当抗原被其诱发的免疫应答清除后，由于记忆细胞识别抗原受体具有更高的亲和力，因而Ab2β替代原始抗原可能足够刺激记忆细胞的增殖和存活。对Ab2β自模拟抗原的机制研究表明，Ab2β不仅具有模拟抗原的作用，同时又是重要的免疫调节因子，参与免疫反应的调节
(1)Ab2β可以通过模拟抗原的序列或结构，激活特异的细胞克隆，从而扩大对特定抗原的体液免疫反应。
(2)机体还可将Ab2β以抗独特型肽的形式提呈给T细胞，使CD4+T细胞大量增殖，参与细胞免疫，有实验表明此种反应有可能不受MHC限制。
由于鼠源化抗体蛋白在人体内诱发免疫反应而限制了其在人体内的应用。因此，从80年代中期人们就开始研究用基因工程的方法对鼠单抗进行改造或人源化。其中小分子抗体是重要的方法之一。1993年，意大利学者Pessi首先在其文章中使用了微抗体(minibody)一词，来命名一种人工合成的仅有61个残基，但又具有结合金属活性的抗体。有研究者在荷瘤小鼠进行了完整的IgG，F(ab’)2，scFv，和微抗体的免疫显像效果和治疗效果的比较研究，结果发现微抗体的显像效果最好，而在治疗效果中以完整IgG和微抗体为佳。
卵巢肿瘤是妇科常见肿瘤，占女性生殖器官肿瘤的32％。它可发生于任何年龄，从婴幼儿到老年均可见到，但生育年龄的发病率最高。由于卵巢位于盆腔内，发病初期很少有症状，其恶性肿瘤极易扩散并出现腹水。目前国内外尚缺乏实用的早期诊断方法，而一旦发现，往往已属晚期。尽管对于卵巢癌的治疗近年来已有了长足的进展，但卵巢癌5年生存率仍徘徊在30％左右，病死率超过宫颈癌和宫体癌之和，严重危害广大妇女的健康。美国National CancerInstitute 1999年的统计数据表明，卵巢癌的发病率是女性癌症发病率的第五位。其中白种女性、日本、西班牙和菲律宾中发病最高的年龄段为30-54岁。
由于目前已发现的肿瘤抗原极少，且难以大量制备。因而利用Ab2β的特性制备肿瘤疫苗倍受重视，称为″抗独特型疫苗″。Wagner等用抗独特型抗体ACA125作为疫苗治疗了16例晚期或复发的上皮性卵巢癌。这些患者接受了3至9次的ACA125免疫治疗，其中9例患者诱导产生了Ab3(Ab2β注入荷肿瘤的动物或病人可诱导出称之为抗-抗-独特型抗体的Ab3)和特异性的细胞免疫反应，3例患者IFN-y升高。这些患者的平均无进展生存期为11个月，而Ab3阴性组为8个月。Remartz等用ACA125对45例晚期或复发的卵巢癌患者进行主动免疫治疗，患者外周血T淋巴细胞内IFN-r，，IL-2，IL-4增加。
COC166-9鼠单克隆抗体对卵巢上皮癌具有较好的特异性，免疫组织化学染色证实80％卵巢上皮癌染色阳性，而与其他恶性组织交叉反应较少，在已检测过的正常组织中尚未发现交叉反应。用COC166-9免疫同系小鼠，制备出来的抗独特型抗体6B11具有模拟卵巢癌抗原OC166-9的功能，可在体内外诱导产生特异性抗卵巢癌体液免疫和细胞免疫反应。我们将6B11scFv(单链可变区)与带有人IgG1铰链区的重链CH3片段融合构建小分子抗体基因，即抗独特型微抗体(anti-Idminibody)基因，并进行表达。由于该抗体，通过与CH3融合，增加了分子量和稳定性，实现了部分人源化。在体内应用时，具有scFv片段和其他融合蛋白无法比拟的优越性。
但由于6B11VLVHhC基因是真核生物基因，目前公开的6B11VLVHhC基因5′端起始序列的G和C含量较高，含有较多的大肠杆菌的稀有密码子，在大肠杆菌中的表达量很低，不适宜大规模生产。
本发明系统提供了一种高效生产卵巢癌抗独特型微抗体的方法。通过优化编码卵巢癌抗独特型微抗体的核苷酸序列，优化表达载体/宿主菌组合，同时改进发酵工艺，提高卵巢癌抗独特型微抗体的表达水平。同时简便纯化工艺，获得高表达、高得率、极具产业化价值的一种卵巢癌抗独特型微抗体生产方法。

发明内容
本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产卵巢癌抗独特型微抗体的方法。
本发明的另一目的就是提供卵巢癌抗独特型微抗体的编码序列和用于该方法的表达载体及工程细胞。
在本发明的第一方面，就是提供了一种编码卵巢癌抗独特型微抗体的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一优选例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，就是提供了一种表达载体与宿主菌的优化组合，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的表达载体是pTrcHisA/6B11VLVHhC。
在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求3所述的表达载体。
在本发明的第四方面，提供了一种生产卵巢癌抗独特型微抗体的方法，该方法包括步骤a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出卵巢癌抗独特型微抗体；b)分离纯化出表达的卵巢癌抗独特型微抗体。
在本发明的另一优选例中，所述的步骤(a)的培养条件包括(i)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，总浓度0.1-3％；无机氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等铵盐，浓度0-1.5％。
(ii)无机盐包括磷酸盐、枸盐酸盐、Mg2+盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg2+盐0-5mM。
(iii)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。
(iv)根据M9培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳地，碳源选自下组甘油浓度为0.1-3％；乳糖浓度为0.1-3％；葡萄糖浓度为0.1-1.5％。
在本发明的另一优选例中，所述的步骤(b)的分离条件包括(vi)对发酵样品通过离心和/或过滤方式取出发酵上清液，获得菌体；(vii)破碎细胞，获得破菌液；(viii)对破菌液进行离心以去除破菌上清液，获得沉淀；(ix)将沉淀进行变复性；(x)通过盐析和/超滤进行初步层化后，或直接通过层析纯化方法，从而得到纯度达到95％的纯品。


图1显示了表达质粒pTrcHisA/6B11VLVHhC的构建过程。
附图2是人卵巢癌抗独特型微抗体基因6B11VLVHhC的PCR扩增与电泳鉴定，其中泳道1为1kb DNA Ladder，泳道2为6B11VLVHhC基因的PCR产物。
具体实施例方式
本发明人通过深入而广泛的研究，通过基因编码序列的优化设计，将卵巢癌抗独特型微抗体编码序列转入大肠杆菌，从而实现了高水平表达，在此基础上完成了本发明。
在另一优选例中，通过表达质粒和宿主菌的优化组合，进一步提高了卵巢癌抗独特型微抗体的表达水平。
在另一优选例中，还通过发酵工艺的优化，不仅提高了卵巢癌抗独特型微抗体表达量，而且简化了分离纯化工艺。
外源基因的高水平表达，至少涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，也受其所处的环境条件的影响，本研究通过优化选择多种表达载体，如pBADHisA、pBAD/gIIIA、pTrcHisA等，获得表达载体/宿主菌的优化组合。将修饰后的6B11VLVHhC插入不同的表达载体，转化大肠杆菌，通过表达实验结果，优选载体pTrcHisA-宿主菌JF1125组合，实现了在大肠杆菌中的高效表达，表达量占细胞总蛋白的50％左右。质粒pTrcHisA拷贝数高，带有trc启动子、rrnBanti-termination region及rrnB转录终止子，可使外源基因得到高效稳定表达；同时，宿主菌JF1125在发酵过程中不易受到微生物的侵染。
为大规模获得卵巢癌抗独特型微抗体，需要在发酵罐中进行表达培养。本发明研究了中试发酵工艺，优化后的表达水平达到1500mg/L。
经过本发明的反复实验，优化后的表达条件如下(1)培养基高密度改良M9培养基。
(2)发酵条件培养温度28～40℃，更佳为30～37℃；pH6.0～8.0，更佳为6.5～7.5；诱导剂IPTG浓度为0.1～2mM，更佳为0.2～1mM。
在发酵表达后，对表达的卵巢癌抗独特型微抗体包涵体蛋白进行分离。通常，发酵样品先以离心、过滤等方式去除发酵液上清，获得菌体。缓冲溶液悬浮菌体后，以超声波破碎、高压机械破碎等方式进行完全破菌，获得破菌液。然后对破菌液进行离心以去除破菌上清液，获得沉淀。沉淀含目的蛋白质卵巢癌抗独特型微抗体。对破菌沉淀进行变复性，获得的有活性的卵巢癌抗独特型微抗体再进行下步纯化。纯化一般包括两个步骤，第一步采用盐析和/或超滤进行初步纯化，第二步采用层析纯化方法。适用于本发明的层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
经不同变复性和层析过程比较，优化的纯化方法包括1.采用高压压榨破碎菌体的方式，获得粗包涵体。
2.采用含有一定变性剂条件下的洗涤液纯化包涵体，获得纯度大于85％的包涵体。
3.采用含有高浓度的变性剂溶解包涵体。
4.采用稀释复性的方式，复性微抗体蛋白，获得有活性的微抗体目的蛋白。
5.采用超滤的方式替换缓冲体系，使样品适合进行层析纯化。
6.采用一步阴离子交换层析的方式，并且选择一定的梯度洗脱的方式，获得纯度大于95％的微抗体纯品，同时去除了核酸等其他杂质。
经过上步纯化，可得到卵巢癌抗独特型微抗体纯品，纯化得率40％以上，纯度95％以上，纯品得率约500mg/L发酵液。
纯化后卵巢癌抗独特型微抗体可用常规技术制成各种剂型。
在本发明的一个实例中，提供了卵巢癌抗独特型微抗体基因的获得及表达质粒的构建，优化后的基因使得表达卵巢癌抗独特型微抗体的表达量提高。
在本发明的另一个实例中，经过表达载体和宿主菌的组合优化，进一步提高了卵巢癌抗独特型微抗体的表达量。
在本发明的另一个实例中，经过发酵工艺的优化，进一步提高了卵巢癌抗独特型微抗体的表达量。
在本发明的另一个实例中，经过纯化，可得到纯品500mg/L。
纯化后原液加入适当辅料，制成卵巢癌抗独特型微抗体的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明，该粉针剂稳定。
中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得卵巢癌抗独特型微抗体纯品500mg。适合产业化生产。
本发明的优点在于(1)优化后的卵巢癌抗独特型微抗体基因非常适合在大肠杆菌中表达，具有高表达、高稳定的特点。
(2)优化的表达载体和宿主菌的组合进一步提高了表达量，通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平达到1500mg/L。
(3)变复性工艺简单，蛋白复性率高。
(4)纯化工艺简便，回收率高，使得大规模生产卵巢癌抗独特型微抗体成为可能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1目的基因的获得及表达质粒的构建目的基因的获得人卵巢癌抗独特型微抗体基因来源于北京人民医院妇科肿瘤研究中心，我们设计了引物对之进行优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO1所示。设计一对引物，用PCR的方法对未优化的基因5′端序列进行定点修饰，同时引入NcoI、EcoRI酶切位点。
表达质粒的构建选择大肠杆菌JF1125作为宿主菌，并对该菌株进行了改造，将构建好的表达质粒pTrcHisA/6B11VLVHhC转化大肠杆菌JF1125。从含100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB平板上分别挑取单克隆(JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC)，接种到3ml LB液体培养基中，37℃恒温摇床上300rpm振荡过夜，接种于于20mL LB(氨苄青霉素浓度为100μg/ml和34μg/ml氯霉素)培养液中，在37℃，250rpm条件下培养至OD600＝0.5-1.0，此时细胞处于对数生长期；无菌条件下加入IPTG至终浓度为1mM，继续在37℃，250rpm条件下诱导表达，3小时后取样，SDS-PAGE检测表达情况。结果表明在41KD附近有一表达条带，分子量与微抗体的理论分子量基本一致。
实施例2表达载体和宿主菌的优化组合选择大肠杆菌JF1125作为宿主菌，并对该菌株进行了改造，将构建好的表达质粒pTrcHisA/6B11VLVHhC、pBADHisA/6B11VLVHhC，pBAD/gIIIA/6B11VLVHhC分别转化大肠杆菌JF1125。从含100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB平板上分别挑取单克隆，接种到3ml LB液体培养基中，37℃恒温摇床上300rpm振荡过夜，接种于于20mL LB(氨苄青霉素浓度为100μg/ml和34μg/ml氯霉素)培养液中，在37℃，250rpm条件下培养至OD600＝0.5-1.0，此时细胞处于对数生长期；然后在无菌条件下向菌株JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC的培养液加入IPTG至终浓度为1mM、菌株JF1125/JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC和JF1125/JF1125/pBAD/gIIIA/6B11VLVHhC培养液中加入阿拉伯糖至终浓度0.002％，继续在37℃，250rpm条件下诱导表达，3小时后取样，SDS-PAGE检测表达情况。
根据SDS-PAGE图谱扫描结果如下

通过实验比较，采用菌株JF1125/pTrcHisA/6B11VLVHhC获得的人卵巢癌抗独特型微抗体表达量最高，效果明显。
实施例3卵巢癌抗独特型微抗体发酵配制LB发酵种子液300ml和M9发酵培养基2.7L，配制50％葡萄糖与5％CA补料100ml。放在250ml三角烧瓶中。消毒。种子液冷却后接种。达到OD 0.6～1后，停止培养，接种上罐。控制温度37℃，pH＝7.0，培养至OD到3.0，加入0.6g IPTG进行诱导，3小时后收罐，期间流加补料维持菌生长。离心收集菌体，SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白表达水平达到50％。
实施例4卵巢癌抗独特型微抗体纯化


经过以上纯化工艺，最后可得蛋白纯品500mg/L。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新生源医药研究有限公司<120>卵巢癌抗独特型微抗体的生产方法<160>2<210>1<211>1143<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)…(1143)<223>优化的人卵巢癌抗独特型微抗体基因<400>1ATGGGAGATA TCGAACTTAC TCAATCACCG CTGTCCCTGC CTGTCAGTCT50TGGAGATCAA GCCTCCATCT CTTGCAGATC TAGTCAGAAC CTTGTACACA100GTAATGGAAA CACCTATTTA CATTGGTACC TGCAGAAGCC AGGCCAGTCT150CCAAAGCTCC TGATCTACATA GTTTCCAACC GATTTTCTGG GGTCCCAGAC200AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTCACACTCA AGATCAGCAG250AGTGGAGGCT GATGATCTGG GAGTTTATTT CTGCTCTCAG AGTACACATT300TTCCGTACAC GTTCGGAGGG GGGACAAAGT TGGAAATAAA ACGGGGTGGA350GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGC AGGTCAAACT400GCAGGAGTCT GGCCCTGGGA TATTGCAGCC CTCCCAGACC CTCAGTCTGA450CTTGTTCTTT CTCTGGGCTT TCACTGCACA CTTATGGTAT AGGAGTAGGC500TGGATTCGTC AGCCTTCAGG GAAGGGTCTG GAGTGGCTGG CACACATTTG550GTGGAATAAT AATAAGTACT ATAACACAGC CCTGAAGAGC CGGCTCACTG600TCTCCAAGGA CGCCTCCAAC AACCAGGTAT TCCTCAACAT CGCCAGTGTG650GACACTGCAG ATACTGCCAC ATACTACTGT GCTCGAATAG CCCTTATTAC700
TACGAAAATA GCGTGGTACT TCGATGTCTG GGGCCAAGGC ACCACGGTCA750CCGTCTCCTC AGGATCCGAG TCCAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC800CCACCGTGCC CACTCGAGGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT850GCCCCCATCC CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC900TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT950GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA1000CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC1050AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC1100CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA1142<210>2<211>380<212>PRT<213>智人<400>2MET Gly Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser1 5 10 15Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val20 25 30His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly35 40 45Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ile Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly50 55 60Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser85 90 95Gln Ser Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu100 105 110Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro130 135 140Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Leu Ser Leu His145 150 155 160Thr Tyr Gly Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly165 170 175Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asn Asn Lys Tyr Tyr Asn180 185 190Thr Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Ala Ser Asn Asn195 200 205
Gln Val Phe Leu Asn Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr210 215 220Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Ala Leu Ile Thr Thr Lys Ile Ala Trp Tyr225 230 235 240Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser245 250 255Glu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu260 265 270Glu Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg275 280 285Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly290 295 300Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro305 310 315 320Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser325 330 335Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln340 345 350Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His355 360 365Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys370 375 380
权利要求
1.一种编码卵巢癌抗独特型微抗体的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，含有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
3.一种表达载体和宿主菌的优化组合，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。
4.一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求3所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的工程细胞，其特征在于，它是大肠杆菌。
6.一种生产卵巢癌抗独特型微抗体的方法，其特征在于，该方法包括步骤(a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的工程细胞，从而表达出卵巢癌抗独特型微抗体；(b)分离纯化出表达的卵巢癌抗独特型微抗体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)的培养条件包括培养温度28～40℃，更佳为30～37℃；pH6.0～8.0，更佳为6.5～7.5；诱导剂IPTG浓度为0.1～2mM，更佳为0.2～1mM。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)的分离条件包括(i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式取出发酵上清液，获得菌体；(ii)破碎细胞，获得破菌液；(iii)对破菌液进行离心以去除破菌上清液，获得沉淀；(iv)将沉淀进行变复性；(v)通过盐析和/或超滤进行初步纯化，或直接通过层析纯化方法，从而得到纯度达到95％的纯品。
全文摘要
本发明提供了一种编码卵巢癌抗独特型微抗体的核苷酸序列，高效生产卵巢癌抗独特型微抗体的生产方法，以及有关的工程细胞构建、表达和纯化的工艺。优化后的卵巢癌抗独特型微抗体基因，非常适合在大肠杆菌中表达，同时通过优化组合表达质粒和宿主菌以及发酵工艺优化，提高了表达量，具有高表达、高稳定的优点。本发明可高效、简便、低成本的获得卵巢癌抗独特型微抗体纯品。
文档编号C07K1/00GK1854295SQ20051002536
公开日2006年11月1日 申请日期2005年4月25日 优先权日2005年4月25日
发明者任军, 黄阳滨, 孙九如, 顾小伟, 赖伟萍, 沈丽丽 申请人:上海新生源医药研究有限公司