专利名称：：具有吸附其上的蛋白质和抗体的微粒在鼻内给药的药物组合物制备中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有吸附其上的蛋白质和抗体的微粒在鼻内给药的药物组合物制备中的用途。在本说明书和其后的权利要求书中，名词“蛋白质”包括由两个(种)或多个(种)氨基酸缩合而成的任何化合物。因此该名词包括，但不限于，生物活性肽、多肽和蛋白质。众所周知在多种动物种类包括人类在内，具有3至6个氨基酸(AA)的肽通过鼻腔途径给药，蛋白质的吸收高于40％，具有9至27个AA的多肽约为10-15％，具有较高分子量的多肽低于1％〔例如，胰岛素(51个AA)，吸收几乎为零〕，尽管同样的肽在种类与种类之间，或者甚至同一种类不同个体之间都有明显的不同〔LeeW.A.和LongeneckerJ.P.，生物药物制造(Biopharm.Manufact.)，4月，1-7页，(1988)〕。这就是为什么80年代末期仅有3种九肽〔去氨加压素(desmopressin)，赖氨酸加压素(lypressin)，催产素〕通过鼻腔途径给药，而通过鼻粘膜转运蛋白酶抑制剂和增强剂自80年代早期得到研究。通常，这些增强剂是增加鼻粘膜被动渗透率的表面活性剂。由此有可能获得将降钙素(32AA)、胰岛素(51AA)、生长激素(191AA)和其它蛋白质及高分子量多肽进行鼻内给药的制剂〔LeeW.A.和LongeneckerJ.P，“生物药物制造”4月，1-7页，(1998)；VenhoefJ.C.等人，“欧洲药物代谢及药物动力学杂志”(Eur.J.DrugMetab.AndPharmacokin)，15，83(1990)；MishimaM.等人，“药物动力学杂志”(J.Pharmacobio-Dyn.)10，S.69(1987)；MishimaM.等人，“药物动力学杂志”，12，32(1989)；WatanabeY.等人，“化学药物公报”(Chem.Pham.Bull)，40，3100(1992)；SchipperN.G.M.等人。“药物研究”(PharmacenuticalRes.)，10，682(1993)；ShaoZ.等人，“药物研究”，11，1174(1994)〕。但是，由于这些增强剂基本上是表面活性剂，具有或多或少程度地严重的和可逆性的损伤粘膜的不利之处，从而增加了药物的被动渗透率。为了尝试改进吸收，鼻腔转运迟滞剂也得到应用，诸如粘滞剂、粘附聚合物等，并且得到的结果是适度的。但是，迟滞剂也对粘膜和纤毛有毒害作用。为了消除这些缺点，考虑将药物掺入淀粉微粒来给药，因为淀粉太大而不会被吸收但可在鼻腔内部分水化，并缓慢释放先前掺入的肽。〔LllumL.等人，“国际药理杂志”(Int.J.Pham)，39，189(1987)；BjrkE.，EdmanP，“国际药理杂志”，47，233，(1988)〕。用这种方法获得了迟滞效应，以及小、中型分子吸收的提高。但是，大分子的吸收没有提高，因为粘膜没有受损。终于，PCT专利申请WO94/28879公开了一种用于口服给药的药物组合物，其包含生物活性物质以及特异性结合此生物活性物质的抗体和许多聚合材料的微粒。特别是，生物活性物质属于肽、多肽和蛋白质家族。优选地，微粒是聚苯乙烯微球。生物活性物质和抗体吸附在此微粒上，并且微粒在小鼠中被上皮包被的集合淋巴结的滤泡胞吞。因而有可能在实验动物中同时计算进入载体细胞的微粒数量(吸收)和有效透壁且到达位于肠系膜管淋巴的微粒数量，肠系膜管可收集所有被运送物质。在上述提及的应用中，最有效的转运是利用以牛生长激素为蛋白质和其特异性抗体bGH-Ab为抗体而获得的。吸收测定是通过体内在大鼠空肠和回肠中插入3.6×1011个经包被的微粒来进行的，90分钟后固定组织并进行测定(计算中考虑90分钟的6个内吞循环)。获得的数据如下a)90分钟内通过40cm2的总吸收8,400,000颗微粒〔产量＝0.023‰(＝8,400,000/3.6×1011)〕；b)90分钟内通过40cm2每单位面积的总吸收210,000颗微粒/cm2〔产量/cm2＝0.00058‰(＝210,000/3.6×1011)〕；依次，透壁流量的测量是通过在大鼠的空肠+回肠中体内插入3.6×1011个经包被的微粒和每5分钟从插有导管的肠系膜管收集淋巴来进行的。结果如下a)90分钟内通过40cm2上的透壁转运65,000颗微粒〔40cm2上的产量65,000/3.6×1011(＝0.00018‰)〕；b)90分钟内透壁转运的物质/cm21625颗微粒/cm2〔产量/cm2＝4.4×10-9(＝0.0000044‰)〕；这些数据显示肠内胞吞作用的产量比透壁转运的产量高出130倍。这意味着130颗被胞吞的颗粒中，129颗被集合淋巴结的淋巴组织所捕获，仅有1颗透过进入到淋巴。现在令人惊奇地发现，吸附于聚合材料微粒上的蛋白质和此物质的特异性抗体在鼻粘膜内的主动转运产量比在肠内高出400,000倍。更特别的是，由于肠内实验的吸收数据得自体内，这些数据涉及包括增加产量的主动和被动的旁细胞转运的输入流率(腔-淋巴)。基于这样的初始前提，鼻与肠转运产量的比无疑会高于先前提及的400,00倍。实际上，在体外单独研究了鼻粘膜，并且有可能测定包被后的微粒两个相反的、单向的流量，而净吸收可通过这些流量的差异得到计算。因而鼻粘膜的净吸收不似报道过的肠那样，不包括输入的被动组分而仅仅是主动吸收的结果。更值得指出的是，除极有利的产率以外，通常和口服途径相比，鼻腔途径的优越性还在于被吸收的物质不必通过繁杂的胃肠道消化系统后再进入循环中，也不必突然通过肝脏。因而，本专利的第一个目的是提供具有吸附其上的蛋白质和抗体的微粒多聚物用于在鼻内给药的药物组合物制备中的一种用途。蛋白质优选自BSA(牛血清白蛋白)、胰岛素、脑啡肽、激素、生长因子、细胞因子、凝集因子、神经肽、抗微生物剂及其片段。抗体依次选自IgM、IgA和IgG的免疫球蛋白。免疫球蛋白优选地对该蛋白质具有特异性。微粒优选地是非免疫原性聚合材料的微球如聚苯乙烯、橡胶或其它聚合物。任选地，聚合材料是生物可降解型的。优选地，根据本发明的药物组合物可制备成包含有效剂量的吸附于聚合材料微粒上的蛋白质和抗体及药学可接受的惰性成份的合适剂型。通过鼻内途径给药的合适剂型的例子有乳油、软膏、气雾剂、喷雾剂和滴剂。剂型还可以包含其它传统的成份如防腐剂、稳定剂、缓冲液、调节渗透压的盐、乳化剂、调味剂等等。根据本发明的药物组合物中的蛋白质和抗体的用量可以在大范围内随已知因素而变化，如疾病的状态和严重程度、病人的体重、日剂量的次数和所选蛋白质的活性。不过最佳用量可由本领域技术人员容易地依常例决定。通常，蛋白质/免疫球蛋白的比例是1至15,000摩尔蛋白质每摩尔免疫球蛋白，优选地是1至5,000，甚至更优选地是1至100摩尔蛋白质每摩尔免疫球蛋白。依次，根据本发明的药物组合物中蛋白质以重量计的用量可由本领域专业技术人员在个例中根据所用蛋白质的已知活性容易地决定。根据本发明的药物组合物的剂型可以由制药化学公知的方法包括混合、成粒、压缩、溶解、消毒等等途径。吸附于微粒上的蛋白质的活性连同针对所评测的蛋白质的抗体可通过以下实验手段来估量。实施例1通过鼻内途径微粒的转运折颈处死后，从NewZealand白色雄兔(体重3-3.5kg)分离得到的两对侧鼻粘膜用于实验。对应于上鼻甲的粘膜区用Krebs-Henseleit溶液洗涤〔“生物化学及物理院报”(Comp.Biochem.Physiol.)，CremaschiD.等人，99A，361(1991)；“生物化学和生物物理杂志”(Biochem.Biophys.Acta)，Cremasch；D.等人，27，1280(1996)〕，接着放置在盛有聚四氟乙烯的Ussing槽中(接触面积为0.3cm2)，并用Krebs-Henseleit溶液温育，维持在27±1℃。Krebs-Henseleit溶液的组分如下(mM)Na+142.9；K+5.9；Ca2+2.5；Mg2+1.2；Cl-127.7；HCO3-24.9；H2PO4-1.2；SO42-1.2；葡萄糖5.5。pH维持在7.4。同时用O295％+CO25％进行洗涤。洗涤气体还被用于氧化组织和混合溶液。使用数字式万用表(KeithleyInstr.，Cleveland，美国，型号136)，确定如此放置的对侧组织的跨上皮电压(Vms)的差异。实验的前30分钟内每10分种测定一次(用以估量分离后上皮的功能)，实验结果结束时也进行测定(开始后150分钟；即120分钟的温育期)。预温育结束时，获自两组织之一的粘膜下层侧和另一组织粘膜侧的溶液由250μl直径约为0.5μm的荧光聚苯乙烯微粒悬浮液(荧光素异硫氰酸酯偶联，FITCPolyscienceInc，Warrington，PA，美国)所替代。微球的浓度在600nm波长处用吸收标准直线(λ5光度计，由Perkin-Elmer公司，Norwalk，CT，美国提供)对10μl样品进行测定(至少在温育期开始和结束时取样)。微粒的参比浓度在适当稀释后的Burker槽中预先决定(LeitzGMBH，D-6330Wetzlar，德国提供的OrthoplanMPV2荧光显微镜)。实验过程中微粒的初始和最终浓度过程无明显变化。在120分钟温育过程中，转运的微粒因为浓度低而在Burker槽中进行测定，并且用每平方厘米每小时的微粒数量的单向粘膜-粘膜下层流量(Jms)或反之亦然的(Jsm)来表示。进行测定前，为了防止Krebs-Henseleit溶液中的微粒彼此聚集和吸附在组织上，供体溶液和含有被转运微粒的溶液在实验开始时和结束时都用超声波处理。供体溶液每30分钟彻底更新，这一步骤经证明足以维持游离微粒的恒定浓度。实施例2吸附于微粒上的蛋白质通过鼻内途径的转运按如前述实施例1相同的步骤进行，除了微粒悬浮于蛋白质溶液中(6.5×10-6M)和整个悬浮液在37℃温育90分钟。接着洗涤4次，每次包括离心沉淀和在含有牛血清白蛋白，BSA(7.4×10-4M，5％p/v)的Krebs-Henseleit溶液中重新悬浮。实施例3吸附于微粒上的抗体通过鼻内途径的转运按前面实施例1和2相同的步骤进行，除了微粒悬浮在由抗体组成的蛋白质溶液里。实施例4微粒上吸附的结合抗体的蛋白质通过鼻内途径的转运按与先前所述实施例1和2相同的步骤进行，除了使用吸附在微粒上并特异性结合抗体的多肽。微粒首先悬浮在合适的蛋白质溶液中(6.5×10-6M)，并且整个悬浮液在37℃温育90分钟。接着洗涤4次，每次包括离心沉淀和用含有BSA的Krebs-Henseleit溶液(7.4×10-4M，5％p/v)重新悬浮组成。最后，用含有特异性抗多肽抗体的溶液包被的微粒(6.5×10-8M)在4℃温育16小时。为了研究经包被微粒的转运动力学，在微粒于通常初始浓度下得到包被后才将其稀释或浓缩，以使均一性包被与微粒的最终浓度无关。在使用的多肽中，牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白A(人初乳IgA)、免疫球蛋白G(鼠抗人胰岛素和抗BSA)由Sigma提供(St.Louis，MO，美国)，而牛胰岛素和脑啡肽(〔leu5〕脑啡肽)由CalbiochemAG提供(Lucerne，瑞士)。实施例1-4的结果见表1，显示天然的(未包被)或用多种蛋白质包被后的微粒之粘膜-粘膜下层流量(Jms)和反之亦然的(Jsm)。不论包被的类型如何，只有发现分离得到的粘膜在实验开始时和预温育期间以及温育结束时具有活力，实验才被认为是有效的。为此目的所考虑的参数为跨上皮电压(Vms)的差异，其为活性带电离子及细胞代谢(支持后者)的跨上皮转运和上皮作为屏障物之完整性的共同指示。初始最小Vms值为+1mV(正粘膜下层)。实验过程中Vms缓慢而逐渐地增加，因而不但表明分离的粘膜没有降解，而且表明在体外此粘膜功能的恒定恢复。这种随时间变化的趋势证明与CremashiD.等人的报道相类似〔“生物化学和物理学院报”，99A，361，(1991)〕。温育温度为27±1℃。和37℃相比，这一温度使新陈代谢和转运降低约2倍，却导致分离的组织更加稳定。在进行的多种类型实验中，27℃预温育30分钟后的平均Vms(在带有微粒的供体溶液插入和伴随流量测定的温育开始前)是4.0±0.1mv(134片粘膜)。在温育120分钟结束时的Vms是6.6±0.2mV(134片粘膜，P＜0.01)。不论包被的类型如何，供体溶液中的微粒浓度在120分钟温育期间没有明显的减少。实际上此浓度在温育开始时等于3.25±0.05×1011颗微粒/毫升(134次实验)，在温育结束时为3.22±0.04×1011颗微粒/毫升(我们进行的134次实验)。这意味着流率Jms和Jsm在所考虑的时间段内是单向的，并且没有发生由于吸附或聚集而造成微粒损失。这更给我们提供了针对产生流量的溶液浓度的可靠参考。表1的结果显示a)在不同的包被条件下，在325×106颗微粒/毫升的供体溶液中Jsm值对应于每平方厘米每小时约3-6×106颗微粒；b)当微粒没有用多肽包被时，Jms值和Jsm值没有明显差异；因而，无微粒的净吸收发生(J净和零无明显差异)；c)用多肽进行包被，不论使用的多肽如何(BSA、胰岛素、脑啡肽、IgA、抗胰岛素IgG、抗BSAIgG)都导致Jms值总明显高于Jsm值；因而发生了净吸收(J净与零有明显差异)；d)微粒经吸附胰岛素或BSA进行包被后，各自的抗体(抗胰岛素IgG或抗BSAIgG对于吸附的浓度为1∶100)通过与此两种蛋白质特异的键同它们结合时，就胰岛素和BSA的Jms而言同特异性吸附于微粒上的抗体的Jms一样，都受到强烈刺激；所以，净吸收(J净)明显的增加。由于最高净流量是通过胰岛素结合其特异性IgG得到的，所以检查了这类包被类型的转运动力学。最后，微粒按先前所公开的那样进行包被，然后稀释或浓缩，在不同微粒浓度下进行流量测定。表2显示每一浓度进行6次实验所获得的结果。这些结果显示a)浓度为2×109和200×106颗微粒/毫升时，Jms和Jsm没有明显差异。因而J净与零没有差异；b)较高浓度时，Jsm没有显示统计学上的明显变化，Jms变得明显高于Jsm。因而J净与零有统计学的差异；c)提高浓度时Jms逐渐地增加，并且和Jsm的差异也增加；所以J净也增加。在浓度为982×109颗微粒/毫升时仍可观察到增加，即比使用的最小浓度高500倍；d)动力学趋势为S型，并且跨上皮转运每平方厘米的最大产量是3.2×1011颗微粒/毫升时获得的，它等值于1.7‰。在27℃获得的这一产量比肠中获得的相应产量高400,000倍，后者在37℃进行测定，如上已述其为总的主动净流量和被动腔-淋巴流量的流量(1.7×10-3/4.4×10-9＝400,000)。表1天然微粒、用多肽(Ag)包被的微粒、用抗体包被的微粒或用与其特异性IgG结合的多肽(Ag+Ab)包被的微粒的流量*，**p＜0.05或0.01，对于初始值°，°°p＜0.05或0.01，对于零·，··p＜0.05或0.01，对于Jsm表2用结合抗胰岛素IgG的胰岛素包被的微粒的流量。供体溶液具有不同浓度的微粒<></tables>°°p＜0.01，对于零··p＜0.01，对于Jsm权利要求1.含有吸附其上的蛋白质和抗体的微粒用于鼻内给药的药物组合物制备中的用途。2.根据权利要求1所述的聚合物微粒的用途，其特征在于蛋白质选自BSA、胰岛素、脑啡肽、激素、生长因子、细胞因子、凝集因子、多肽、抗微生物剂及其片段。3.根据权利要求1或权利要求2所述的聚合物微粒的用途，其特征在于抗体是选自IgM、IgA和IgG的免疫球蛋白。4.根据权利要求3所述的聚合物微粒的用途，其特征在于免疫球蛋白是特异于蛋白质的。5.根据权利要求1至4中任意一项所述的用途，其特征在于微粒是聚合材料的微球。6.根据权利要求5所述的聚合物微粒的用途，其特征在于聚合材料是生物可降解的。7.根据权利要求5所述的聚合物微粒的用途，其特征在于聚合材料是聚苯乙烯。8.根据权利要求1至6中任意一项所述的聚合物微粒的用途，其特征在于蛋白质/免疫球蛋白的比例为1至15,000摩尔蛋白质每摩尔免疫球蛋白。9.根据权利要求1至6中任意一项所述的聚合物微粒的用途，其特征在于蛋白质/免疫球蛋白的比例为1至5,000摩尔蛋白质每摩尔免疫球蛋白。10.根据权利要求1至6中任意一项所述的聚合物微粒的用途，其特征在于蛋白质/免疫球蛋白的比例为1至100摩尔蛋白质每摩尔免疫球蛋白。全文摘要具有吸附其上的蛋白质和抗体的微粒用于鼻内给药的药物组合物制备中的用途。文档编号A61K9/18GK1252712SQ98804173公开日2000年5月10日申请日期1998年4月8日优先权日1997年4月14日发明者D·克里马斯奇,C·波塔申请人:方济各安吉利克化学联合股份有限公司