微粒体疫苗的制作方法

专利名称：微粒体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的以肽为基础的疫苗，以及这种疫苗在人和动物疾病(例如病毒感染和癌症)的预防性和治疗性疗法中的用途。
背景技术：
大多数成功的疫苗以标准减毒的或灭活的病原体产生的中和抗体为基础。然而，对于引起慢性炎症的病原体，例如人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)、丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)、分支杆菌(mycobacteria)和寄生虫，或者在癌症情况下，T-细胞介导的免疫应答是决定性的。主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)抗原呈递和T-细胞免疫应答的分子学认识，引导了在开发疫苗的尝试中应用确定的抗原性肽加细胞因子(cytokine)和/或共激分子(co-stimulatorymolecule)。所有上述尝试中的基本问题之一是难以构建一个类似于体内抗原呈递细胞(antigen presenting cells，APC)的定性和定量的抗原送递系统(antigen delivery system)。
CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)识别抗原是与I类主要组织相容性复合体(MHC)分子装配的小的抗原性肽。在APC的细胞溶胶中产生抗原性肽，并且随后易位到内质网(endoplasmic reticulum，ER)腔中(Rock，K.L.和Goldberg，A.L.Annu Rev Immunol 17，739-779(1999))。合成I类MHC重链并且使之插入到ER腔中，在ER腔中该重链与b2-微球蛋白(b2-microglobulin，b2M)形成二聚体(dimer)(Natarajan等，Rev Immunogenet 1，32-46(1999)；Pamer E和Cresswell P，Annu RevImmunol.16 323-358(1998))。该二聚体保留在ER中直到与合适的抗原性肽装配。例如重链结合蛋白(heavy-chain binding protein，BIP)、钙联接蛋白(calnexin)、钙网蛋白(calreticulin)和Erp57这样的陪伴分子(chaperone)催化I类MHC在ER中的二聚合过程以及与肽的装配(Paulsson K和WangP.，Biocilitil Biophys Acta.1641(1)1-12(2003))。
装配的I类MHC在APC(例如感染的或恶性细胞)的细胞表面上快速表达。T细胞受体对肽-I类MHC的识别导致CTL杀死表达感染抗原或肿瘤抗原的靶细胞。从病毒蛋白或癌蛋白鉴定CTL识别表位之后，设计合成的以肽为基础的疫苗来激发T-细胞免疫性，成为预防或治疗感染性和恶性疾病的有吸引力的途径(Furman MH和Ploegh HL.，J Clin Invest.110(7)875-9(2002)；Berinstein N.Semin Oncol.30(3)(增刊8)，1-8(2003)；Falk等，Nature348，248-251，(1990)；Van Bleek GM和Nathenson SG.，Nature 348213-216(1990)；Kast，W M.和Melief，C.J.Immunol.Lett.30229-232(1991))。以所述送递系统为基础的肽疫苗有很多种不同形式。最简单的形式是溶解于水溶液中的肽。直接注射可溶性抗原性肽已表明不能成功刺激CTL应答，因为它们快速生物降解或者诱导由不成熟APC的抗原刺激产生的T细胞无反应性(Kyburz，D.等，Eur.J.Immunol.231956-1962(1993)；Toes，R.E等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93785 5-7860(1996)；Amoscato等，J.Immunol.161，4023-4032(1998))。据报道，使用合成的肽衍生疫苗的附带的困难是CTL的诱导，虽然它们能杀死与肽外因脉冲的靶细胞，但是它们不能识别天然处理并呈递肽表位的靶细胞(例如感染的或恶性细胞)(Dutoit，V.等，J.Clin.Invest.1101813-1822(2002))。
据报道，为了选择正确的肽，在ER中定性控制I类MHC抗原呈递。只有正确装配的I类MHC能在APC表面上表达。佐剂的使用几乎不能提高合成肽的呈递质量(Schijns，V E.2001.Crit.Rev.Immunol.2175-85(2001))。肽疫苗的改进形式是构建具有加载肽的重组I类MHC的人工脂膜(BenMohamed等，Lancet Infect Dis.2(7)，425-31(2002))。虽然脂质体策略可在给患者注射之前，将结合肽的I类MHC抗原分子掺入在脂质膜中，但是APC的ER中极复杂的加载系统不能单纯地由重组I类MHC抗原、合成肽和脂质体的简单混合物来仿效。只有少数几种肽能与重组I类MHC在体外装配(Ostergaard Pedersen L等，Eur J Immunol.31(10)，2986-96(2001)。
另外，插入的I类MHC的不正确取向以及缺乏共激分子使得它难以诱导有效免疫应答。因为标准的APC具有呈递最佳抗原和引发天然T细胞引起的细胞免疫应答的独特能力，正在研发产生一种关键APC即自体固有树突状细胞(dendritic cell，DC)作为体外疫苗载体的策略(Banchereau，J.等，Annu.Rev.Immunol.18767-811(2000))。最初的研究表明，用作体内疫苗的抗原性肽脉冲的DC能诱导CTL应答(Tsai，V等，J.Immunol.1581796-1802(1997))。尽管多项人体临床试验报道了肯定的证据，但是没有生化证据表明所述脉冲的肽确实加载到表面I类MHC上，这质疑了肽脉冲的APC诱导有效免疫应答的功效。
因此，需要另一种可选的疫苗制剂，既能克服上述问题，又能提供常规疫苗的治疗有效性。所述疫苗应该实现APC细胞的内源呈递抗原(endogenous presented antigen)的质量，同时保持高效并避免副作用。

发明内容
根据本发明的第一方面，提供一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括分离自动物细胞的翻转的微粒体(inverted microsomes)，或者其膜片段，所述微粒体或其膜片段与外部暴露的肽抗原和主要组织相容性复合体(MHC)蛋白相结合。
本发明的微粒体来自动物细胞，因此可以产生自在真核细胞中存在的下列区室(compartment)内质网、溶酶体、核内体或内吞作用途径(endocyticpathway)的成分。
用微粒体或其片段的膜中已经存在的MHC蛋白可以分离微粒体。可选地，MHC蛋白随后可以被导入微粒体或片段中。得自ER的微粒体包括I类和II类MHC分子(Bryant等，Adv Immunol.80，71-114(2002))。
本发明对于I类MHC限制性抗原性肽以及II类MHC分子同样适用。所述组合物中的MHC蛋白就获得微粒体的细胞来说，可以是异种来源。
主要组织相容性复合体(MHC)的基因簇编码MHC家族蛋白。MHC分子在所有较高等的脊椎动物细胞上表达。所述MHC分子首先在小鼠中得以证实并被称作H-2抗原(组织相容性-2抗原)。在人体中它们叫做人白细胞相关抗原(human-leucocyte-associated antigen，HLA抗原)，因为它们首先在白细胞(血白细胞)上得到证实。I类和II类MHC分子是已知的最多形的蛋白质，它们个体彼此之间表现出最大的遗传变异性，并且它们在分别向细胞毒性T细胞和辅助T细胞呈递外来蛋白抗原中起着关键作用。I类分子在几乎所有脊椎动物细胞上表达，而II类分子限于与辅助T细胞相互作用的几种细胞类型，例如B淋巴细胞和巨噬细胞。两类MHC分子都具有免疫球蛋白样结构域和单一的肽结合沟，该结合沟结合从外来蛋白衍生的小的肽片段。每个MHC分子能结合一组大的特征性肽，所述肽由蛋白细胞内降解产生。肽MHC复合体在靶细胞内部形成之后，被运输到细胞表面，在那里它们被T细胞受体识别。T细胞除了表达识别靶细胞表面上肽MHC复合体的抗原特异性受体之外，还表达CD4或CD8共同受体，所述共同受体识别靶细胞上MHC分子的非多形区辅助细胞表达识别II类MHC分子的CD4，而细胞毒性T细胞表达识别I类MHC分子的CD8。(Alberts等，″MolecularBiology of the Cell″，第三版，1229-1235(1994))。
I类MHC由重链和β-2-微球蛋白构成。人I类MHC重链由称作HLAA、B、C的三种不同的基因座编码。它们与称作β-2-微球蛋白的小蛋白非共价结合。人I类MHC蛋白的例子是I类HLA组织相容性抗原，如图13所示的A-2α链前体(I类MHC抗原A*2)(数据库登记号No.P01892)；或I类HLA组织相容性抗原，如图13所示的B-7α链前体(I类MHC抗原B*7)(数据库登记号No.P01889)。
II类MHC由两条非共价键合的链α链和β链构成。两条链均由I-区相关(I-region associated，Ia)抗原中的基因编码。所述蛋白的例子是II类HLA组织相容性抗原，如图14所示的DRB3-1β链前体(I类MHC抗原DRB3*1)(数据库登记号No.P79483)；和II类MHC组织相容性抗原HLA-DQα1(DQw4特异性)前体，也在图14中给出(数据库登记号A37044)。
I和II类MHC cDNAs和基因组DNAs的序列为公开且可获得的(www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)。
所有真核细胞都具有内质网(ER)。所述内质网的膜一般构成普通动物细胞全部膜的一半以上。它组织成分枝小管的网状迷路与扩展贯穿细胞溶胶的平囊。认为所述小管和囊是相互连接的，使得ER膜形成包封单一内部空间的连续片状结构。这种高度复杂的空间称作ER腔或ER池腔，并且它经常占据细胞总体积的10％以上。ER膜将ER腔与细胞溶胶分开，并且介导这两个区室之间的选择性分子转移。
ER在脂质和蛋白的生物合成中起核心作用。对于大多数细胞的细胞器来说，ER的膜是产生所有跨膜蛋白和脂质的部位，所述细胞器包括ER本身、高尔基体、溶酶体、核内体、分泌小泡和质膜。ER膜还通过产生大部分脂质而对线粒体和过氧化物酶体膜有主要贡献。另外，几乎所有分泌到细胞外的蛋白以及那些最终会被递送到ER、高尔基体或溶酶体腔的蛋白最初被送递到ER腔(Alberts等，″Molecular Biology of the Cell″，第三版，577-595(1994))。
溶酶体是一种特定的细胞器，该细胞器包括特定的酶，该酶用于降解必须被破坏的内源细胞蛋白，或者用于破坏免疫系统所靶向的需加以破坏的外源蛋白或寄生物。
核内体是形成细胞中部分胞吞途径的细胞器。存在由细胞表面向核内体或向溶酶体流动的胞吞小泡的恒流。通过外质膜的“出芽”过程(称作“内陷”)形成小泡，或者小泡能从它们最后回流到的内细胞器形成。胞吞作用是细胞将有或没有结合配体的外部细胞受体内在化的过程，还是细胞从它的外部环境取样的一条途径。
根据本发明的组合物可以选择性地用合适的佐剂(adjuvant)和/或促进T-细胞应答的细胞因子配制成制剂，所述细胞因子如干扰素或白介素、其它促进T-细胞应答的细胞因子，所述白介素或干扰素如白介素-2(IL-2)、白介素-15(IL-15)、白介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFNγ)。所述适合的佐剂为常规的佐剂。给药之前，上述物质能适当地与加载抗原的微粒体混合，或者可以适当地制成与膜结合的微粒体的成分。
在本发明上下文中微粒体是通过主要组织相容性复合体(MHC)方式呈递抗原性肽的任何动物细胞的内质网(ER)、溶酶体或核内体区室的细胞游离膜小泡。ER衍生微粒体的定义以所谓“ER-标记(ER-marker)”的存在为基础，所述“ER-标记”是一般在ER中存在的蛋白，例如BIP、p58、钙联接蛋白、钙网蛋白、TAP相关蛋白(TAP-associated golycoprotein，tapasin)。溶酶体衍生微粒体的定义以特异性标记LAMP1和/或LAMP2的存在为基础。通过在从动物细胞制备之后在电子显微镜下所观察到的微粒体的形态识别它们。
通过任何常规方法均能分离本发明组合物中含有的微粒体。合适的方法包括Saraste等和/或Knipe等(Saraste等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，6425-6429(1986)和Knipe等，J.Virol.21，1128-1139(1977))的方法。上述方法包括细胞或组织的匀浆，接着通过以7500转/分钟(rpm)离心10分钟分离细胞核，然后通过以15500rpm离心54分钟回收“粗”微粒体。“粗”微粒体是粘附有核糖体的微粒体。然后通过蔗糖垫以110000重力加速度单位(g)差速离心(differential centrifugation)60分钟进一步纯化重新悬浮的“粗”微粒体。以37000rpm进一步蔗糖梯度离心10小时以将粗微粒体精细分级分离(达到等密度条件(isopyknic condition))，并且通过使用合适的抗体，例如抗-p58抗体，进行蛋白质印迹(Western blotting)测定含有ER的级分。
翻转的微粒体是进一步加工的结果，例如对分离的微粒体反复的冷冻-融化处理步骤，引起微粒体的外膜的破坏和再形成，使得所述膜的“内”面存在于翻转的微粒体的“外侧”上。因此经过上述处理得到的微粒体被描述为是“膜内侧翻外的(inside-out)”或“翻转的(inverted)”微粒体。制备“膜内侧翻外的”或翻转的微粒体的方法使普通微粒体制备物中可见的腔结构(lumen structure)不存在。
在根据本发明的组合物中，微粒体可以包括其膜片段。适当地，所述膜片段可以通过包括使用洗涤剂(detergent)或反复冷冻融化或超声处理来破碎微粒体结构的方法来制备。类似地还可以加载肽抗原来形成本发明的组合物。优选地，所述膜片段得自带有对ER或者对溶酶体特异性标记的细胞内膜。
在本发明的疫苗组合物中，还可以有一定百分比的非翻转(non-inverted)结构的微粒体，所述非翻转结构即在标准微粒体制备之后原位排列(in situarrangement)的膜取向与微粒体制备之前ER、核内体或溶酶体腔的“向内”一致。但是，本发明组合物中至少大约75％至大约95％，合适地至少大约90％的微粒体具有与原位微粒体取向相反的膜取向，因此描述为是“膜内侧翻外的”或翻转的微粒体。所述组合物可以因此另外含有一定比例的非翻转的微粒体。
在本发明的其他具体实施方式
中，组合物可以是更一致的，并且可以包括至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％的微粒体，所述微粒体与从没有进行进一步处理细胞制备的微粒体相比具有翻转的或反向的(或“膜内侧翻外的”)膜取向。
微粒体可以首先加载抗原，然后进行进一步处理，以提供翻转的或“膜内侧翻外的”微粒体，这样暴露ER膜的内表面；或者能从细胞源制备微粒体，所述细胞源的微粒体中已经存在优选的抗原肽；或者可以对微粒体处理以首先提供翻转的或“膜内侧翻外的”的微粒体，然后随后加载抗原。
通过同等程序可以制备溶酶体和核内体。从动物细胞的胞吞区室纯化来的溶酶体微粒体包括溶酶体和核内体两者。在制备ER衍生微粒体的纯化程序中分级分离总的细胞膜之后，溶酶体膜通过抗该膜的标记LAMP1和LAMP2的抗体分辨。
然后处理纯化的溶酶体微粒体，得到如上所述的翻转的或“膜内侧翻外的”微粒体或膜片段，如果需要，然后可以在酸性条件下加载MHC限制的肽，例如在pH值小于3，优选3至3，适当地在大约2.5的条件下。
要从中制备分离的微粒体总体的动物细胞可以是具有细胞表达的MHC分子的任何一般常见的细胞类型。例如，血液的细胞或免疫系统的细胞，如B-细胞和巨噬细胞，所谓抗原呈递细胞(APCs)。但是，还可以使用来自如肝、肾、肺、脑、心、皮肤、骨髓、胰等这样的组织的细胞类型。
所述细胞可以是人或非人动物的。适当地，动物是哺乳动物。动物可以是啮齿动物物种，例如小鼠、大鼠或天竺鼠(guinea pig)，或者其它物种，例如兔，或者犬或猫科动物，或者蹄类物种，例如绵羊、猪、马、山羊、牛，或非哺乳动物物种，例如鸟类(例如家禽，例如鸡或火鸡)。
从中制备微粒体的细胞可以是培养的细胞系。所述细胞系可以是永生细胞系。细胞系可以基本上从非胚胎组织来源产生。
在本发明的一些具体实施方式
中，细胞来源可以是遗传工程修饰的动物细胞来源，例如细胞系，或者转基因非人动物。所述从中制备微粒体的细胞或组织可以是来自转基因非人动物的人源化动物组织或细胞，所述转基因非人动物的基因组已经通过插入一个或多个人类基因而得到修饰。
在与从转基因非人动物或转基因细胞系制备的微粒体有关的本发明的具体实施方式
中，所述转基因是导入另外的一个或几个基因或者一个或几个编码蛋白的核酸序列。转基因可以是异源基因或同源基因的另外的拷贝，所述转基因选择性地在组成型启动子或可诱导启动子的控制之下。转基因可以是细胞或细胞系的瞬时转染或稳定转染，或者是细胞或细胞系中的附加型表达系统(episomal expression system)。
但是，在人用医药领域，预期发现本发明这方面的组合物作为疫苗的最大应用。因此，优选的是从中制备微粒体的细胞来源具有与当用作疫苗时与组合物接受者的MHC相匹配的MHC同种异型位(allotope)。
在根据本发明这方面的一个具体实施方式
中，从中制备微粒体的细胞来源可以是当用作疫苗时的组合物的最终接受者。
或者，人细胞的合适的来源可以来自细胞系，例如得自非胚胎的细胞系，适当地是B-细胞系，例如细胞系221。这样的细胞系还可以有益地不表达I类和/或II类主要组织相容性复合体(MHC)的蛋白。本发明的这个具体实施方式
可以是商业化规模生产疫苗的更优选的实施方案，其中从用不同的MHC同种异型位工程化的所述细胞系制备非个体疫苗(non-individualvaccine)。
细胞系221为上述MHC阴性细胞系的例子。所述细胞中不存在天然I类MHC表达，允许对细胞系的修饰以表达任何期望的基因型的I类MHC。这在实现疫苗组合物的完全免疫作用中是特别重要的，因为不同的人群表达不同的MHC蛋白。在本发明所述组合物中，MHC蛋白就从中获得微粒体的细胞来说是异源的。
20％以上的人群表达一些I类MHC，如HLAA2。在使用MHC阴性细胞系的情况下，利用常规基因转移方法，将一个或多个相匹配的MHC基因转染到细胞系中，并且将转基因构建到表达载体中。表达构建体的表达盒一般包括标准启动子，例如细胞巨化病毒(CMV)启动子、或延伸因子I启动子或肌动蛋白启动子，增强子，插入的转基因和多腺苷酸化信号(poly-Asignal)，以实现最优的表达。转染之前，从质粒主链分离表达盒，避免在转染细胞中表达细菌质粒基因。I类和II类MHC cDNAs和基因组DNA的序列是公开的和可获得的(www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)。通过使用I类MHC阴性或选择的MHC类阳性细胞系可以构建I类MHC转染子库(MHCclass I transfectants Bank)，来分别转染大多数I类MHC基因。表达盒的选择依赖转基因的最佳表达。
利用标准重组技术可以实现抗原呈递细胞的转染，例如使用合适的包括编码感兴趣MHC蛋白的核酸序列的载体。术语“载体”一般指任何核酸载体，可以是RNA，DNA或cDNA。或者载体可以描述为“表达载体”。
术语“载体”或“表达载体”其中可以包括染色体载体、附加型载体和来自病毒的载体，例如，来自细菌质粒的载体，来自噬菌体的载体，来自转座子的载体，来自酵母游离基因(yeast episome)的载体，来自插入元件(insertion element)的载体，来自酵母染色体元件(yeast chromosomalelement)的载体，来自病毒例如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒的载体，以及来自它们的组合的载体，例如来自质粒和噬菌体遗传元件如粘粒和噬粒的载体。一般情况下，适合保持、繁殖或表达在宿主中表达多肽的核酸的任何载体可以被用于就这方面的表达。从细菌质粒，例如细菌质粒pUC18，可以构建载体。
提供载体用于特异性表达。所述特异性表达可以是可诱导表达或者只在特定细胞类型中表达的表达，或者是可诱导和细胞特异性表达。可诱导载体中优选的是通过易于操作的周围因素例如温度、营养添加剂、低氧和/或细胞因子或其它生物活性因子的存在诱导表达的载体。特别优选的可诱导载体是化学品(例如化学添加剂象抗生素)的水平变化诱导表达的载体。适合在本发明中使用的各种载体，包括用于原核和真核宿主的组成型和可诱导表达载体是公知的并且是本领域技术人员通常使用的。
重组表达载体包括，例如复制起点、优选来自高表达基因的启动子定向转录结构序列和选择性标记，所述选择性标记允许在暴露给载体之后分离包括该载体的细胞。
哺乳动物表达载体可以包括复制起点、合适的启动子和增强子，还可以包括任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和表达必需的5′-侧非转录序列。根据本发明的优选的哺乳动物表达载体可以没有增强子元件。
启动子序列可以是任何合适的已知的启动子，例如人巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV即时早期启动子、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子或逆转录病毒(long terminalrepeat，LTR)启动子(promoters of retroviral LTR′s)(例如劳斯肉瘤病毒(“RSV”)的启动子)和金属硫蛋白启动子(如小鼠金属硫蛋白-I启动子)。启动子可以包括启动子活性所需要的最小序列(例如没有增强子元件的TATA盒)，例如，CMV启动子的最小序列(mCMV)。优选地，启动子是在没有增强子元件的低基础水平下能发挥功能的哺乳动物启动子。
优选地，启动子与编码要转染到抗原呈递细胞中的MHC蛋白的核酸序列邻近。包括这里描述的启动子的变体，例如同源或直向同源物(orthologues)，是本发明的一部分。
本发明第一方面的表达载体的主链可以从没有其自身启动子和增强子元件的载体如质粒载体pGL2衍生。增强子能结合通过DNA折叠位于几千碱基的启动子区(Rippe等，TIBS 1995；20500-506(1995))。
表达载体还可以包括能使载体繁殖的可选择标记，例如抗生素抗性。
包含编码要转染的MHC蛋白的核酸的载体的核酸序列可以编码如上所述的报告蛋白(reporter protein)，例如氯霉素酰基转移酶(“chloramphenicolacetyl transferase，CAT”)转录单元，荧光素酶(luciferase)或绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。报告基因的应用涉及上述基因的表型，这能在转化细胞中检测到并且用于，例如，分析基因表达的诱导和/或抑制。在研究基因调控中使用的报告基因包括其他公知的报告基因，如编码通过生物发光测试能检测的荧光素酶的lux基因，编码通过组织化学分析能检测的β-葡萄醛酸糖苷酶的uidA基因，编码通过组织化学分析能检测的β-半乳糖苷酶的lacZ基因，编码通过UV光，UV显微镜检查或通过萤光辅助细胞筛选分析(fluorescence assisted cell sorting，FACS)能检测的增强的绿色荧光蛋白的基因。
包括MHC蛋白的核酸序列的DNA可以是单链或双链。单链DNA可以是编码或有义链，或者它可以是非编码或反义链。为了治疗用途，核酸序列是能在要治疗的受治疗者中表达的形式。
载体中的终止序列可以是编码聚腺苷酸化信号的腺苷酸化核苷酸的序列。一般地，聚腺苷酸化信号在要治疗的受治疗者中是可识别的，例如用于治疗人的来自病毒(如SV40病毒)的相应序列。其他终止信号是本领域公知并可以使用的。
优选地，聚腺苷酸化信号是RNA转录的双向终止子。终止信号可以是猿猴病毒40(simian 40 virus，SV40)的聚腺苷酸化信号，例如SV40晚期聚(A)。或者终止序列可以是当与CMV启动子结合时导致最大表达的牛生长激素(bovine growth hormone)的聚腺苷酸化信号(Yew等，Human GeneTherapy，8575-584(1997))。
另外，表达载体可以包括另一个聚腺苷酸化序列，例如SV40早期聚(A)。这样的另一个聚(A)可以位于编码MHC蛋白的核酸序列的上游，减少可能在载体中开始的隐蔽转录(cryptic transcription)，从而保证载体的基础基因表达最小化。
整合病毒基因组的基因表达可能对染色体位置效应(chromosomalpositional effect)易感。上述效应包括转录沉默(transcriptional silencing)和附近异源增强子带来的启动子激活。另外，整合的序列能激活附近基因和致癌基因的表达。通过使用形成插入病毒基因组的边界元件，减小上述作用。绝缘子(Insulator)如鸡β-珠蛋白5′DNase I高敏度位点(5′HS4)为遗传元件，该元件标记位于开放染色质结构域和组成型缩合染色质的区之间的边界。
称为支架结构或基质附着区(scaffold or matrix attachment region，S/MAR)的其他元件使染色质锚定于核结构并且形成染色体环，所述染色体环结构具有使远处调控元件接近相应启动子的生理作用。实例位于人干扰素-γ基因座并且称作IFN-SAR。绝缘子和S/MAR两者都能减小位置效应，当它们与lentiviral载体结合时表现出最大活性(Ramezani等，Blood 1014717-24，(2003))。显而易见，所述元件在整合到宿主细胞基因组中之后，对调控的载体如这里所述的载体有益。
本发明的组合物包括微粒体，或其片段，所述微粒体或其片段与加载到微粒体中的外部暴露的肽抗原相结合。所述结合可以是这样的，使肽抗原插入到微粒体的膜中；相对于微粒体的外膜，肽抗原的至少一个表位暴露。为了使抗原被免疫系统识别，微粒体的膜还包括对T-细胞呈递肽抗原的MHC蛋白。MHC蛋白在产生微粒体的细胞的细胞器中天然存在，或者MHC蛋白在制备微粒体之前通过重组DNA技术被转染到细胞中表达。插入的抗原性肽和MHC蛋白在微粒体的膜中形成结合体，使得蛋白外露与免疫系统的细胞相互作用。
在核苷三磷酸(NTP)(例如腺苷三磷酸(ATP))和NTP再生系统存在下通过孵育微粒体和肽抗原，可以将抗原性肽导入或加载到微粒体中。显然，NTP，例如ATP，有利于肽抗原通过位于微粒体膜中的蛋白转运蛋白(proteintransporter)掺入到微粒体。不必要受到理论束缚，即可看出一旦在NTP存在下孵育微粒体与肽抗原，抗原就能与已经在微粒体膜中存在的I类MHC蛋白结合。可选地，在从里面翻到外面处理之后也可以将抗原性肽加载到微粒体中，在这种情况下不需要NTP。
与微粒体结合存在的抗原性肽适当地具有一个或几个表位。表位是免疫球蛋白结合位点可识别的抗原的最小部分，并且可以是线性或不连续的。因此，MHC结合肽的任何类型，天然的或合成的或人工修饰的都包括在内。
抗原性肽可以来自外部来源即非自身的，或者自身的即自身抗原(autoantigen)。外来抗原性肽可以源自病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物或其它微生物(即传染性物质)，或者高级生命形式，例如植物或动物。在本发明的一些具体实施方式
中，抗原可以是自身抗原，例如由赘生性细胞(neoplastic cell)或癌细胞表达的抗原，正常自身蛋白(本发明用于自身免疫失调的耐受(tolerising)疫苗情况下)。
抗原来自赘生性细胞或癌细胞的情况下，细胞可以来自黑素瘤、肺腺癌、结肠癌、乳癌或白血病细胞。自身免疫疾病包括但不限于多发性硬化(MS)、全身红斑狼疮、1-型或胰岛素依赖型糖尿病、抗磷脂综合征、重症肌无力、肌炎、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’s Syndrome)和类风湿性关节炎。
在本发明的一些具体实施方式
中，优选制备具有一种以上类型的抗原性肽，或者具有经修饰以提高免疫原性序列的抗原性肽的组合物。在制备微粒体之前，也可以用一种以上类型的MHC分子转染细胞。所述一种以上类型的MHC分子用作具有一种以上类型MHC同种异型位的疫苗时，在组合物接受者情况下有用。
在本发明该方面的优选具体实施方式
中，提供了如上定义的组合物，其中微粒体中抗原与MHC分子的比例对于特异性免疫反应的诱导是最佳的，例如在0.1至1.5范围内，优选从0.2至1.2或0.5至1.0，最优选0.2-0.5至1.0。加载的抗原性肽的量可以根据诱导的免疫应答的水平而不同。
定义的主要疾病的抗原性肽能容易地从科学文献中选择或者通过生物信息方法鉴定(Renkvist等，Cancer Immunol Immunother 50，3-15(2001)；Coulie等，Immunol Rev 188，33-42(2002)；De Groot等，Vaccine 19(31)，4385-95(2001))。
例如，流感病毒产生的肽SIINFEKL和ASNENMETM，或来自黑素瘤细胞的肽YLQLVFGIEV。
表1给出I类HLA限制性癌/睾丸抗原的详细信息；表2给出I类HLA限制性黑素细胞分化抗原；表3给出I类HLA限制性广泛表达抗原；表4给出I类HLA限制性肿瘤特异抗原；表5给出II类HLA限制性抗原；表6给出融合蛋白衍生表位；以及表7给出给定HLA等位基因识别的表位频数。
其他实例为表8中选自Anthony等Clinical Immunol.，vol.103，第264-276页(2002)的丙肝病毒(HCV)肽；表9中选自Kaul等J.Clinical Invest.，vol.107，第1303-1310页(2001)的人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)；表10中选自Koziel等，J.Virol.，vol.67，第7522-7532页(1993)的丙肝病毒(HCV)肽；和表11中选自He等PNAS USA，vol.96，第5692-5697页(1999)的丙肝病毒(HCV)肽。
抗原性肽表位可以作为单体或表位的重复序列而存在，例如二聚体、三聚体、四聚体、或更高的聚体如五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。可以使用表位序列的片段，以及包括表位序列的重叠序列(overlapping sequence)。
除非上下文另有具体说明，术语“肽”包括多肽和蛋白两者。
上述肽包括类似物、同系物、同源物、同工型、衍生物、融合蛋白和具有相似结构的蛋白，或者是这里定义的相关多肽。
这里使用的术语“类似物”指和这里描述的蛋白序列有相似或相同功能的肽，但是不必包括与所述氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列或者具有与这里描述的蛋白的结构相似或相同的结构。肽的氨基酸序列如果满足下面标准中的至少一项，则与这里描述的肽的氨基酸序列“类似”(a)具有与这里描述的肽的氨基酸序列至少30％(更优选地，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％)相同的氨基酸序列的肽；(b)由在严谨条件下与编码这里描述的肽序列的至少5个氨基酸残基(更优选地，至少10个氨基酸残基，至少15个氨基酸残基，至少20个氨基酸残基，至少25个氨基酸残基，至少40个氨基酸残基，至少50个氨基酸残基，至少60个氨基酸残基，至少70个氨基酸残基，至少80个氨基酸残基，至少90个氨基酸残基，至少100个氨基酸残基，至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列所编码的肽；或者(c)由与编码这里描述的肽的核苷酸序列至少30％(更优选地，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％)相同的核苷酸序列所编码的肽。
杂交的严谨条件特征是低盐浓度或高温条件。例如，高严谨条件定义为在0.5M的NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM的乙二酸四乙酸二钠(EDTA)条件下和与固相载体结合的DNA杂交，并且用0.1×SSC/0.1％SDS在68℃下洗涤(Ausubel等编著，″Current Protocols in Molecular Biology″l，第2.10.3页，Green Publishing Associates出版，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，New York，(1989))。在一些情况下低严谨条件可能是必需的。根据本发明中使用的，中等严谨程度定义为包括在42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等(1989)上文)。通过加入渐增量的甲酰胺使杂交核酸双螺旋不稳定，使之也能进行更严谨的杂交。这样容易利用特定杂交条件，并且一般根据期望的结果来选择。一般情况下，对于与靶DNA 95至100％同源性的探针，在50％甲酰胺存在下的常规杂交温度是42℃，对于90至95％同源性的是37℃，对于70至90％同源性的是32℃。
与这里所描述的肽有“类似结构”的肽指，和这里描述的肽的结构有类似的二级、三级或四级结构的肽。通过本领域技术人员公知的方法能测定肽的结构，所述方法包括但不限于X-射线结晶法(X-ray crystallography)、核磁共振法(nuclear magnetic resonance)和晶体电子显微法(crystallographicelectron microscopy)。
这里使用的术语“融合蛋白”指包括(i)这里描述的肽或其片段、相关肽或其片段的氨基酸序列和(ii)异源肽的氨基酸序列(即不是这里描述的肽序列)的肽。
这里使用的术语“同系物(homologue)”指包含与这里描述的肽的序列相似的氨基酸序列但是不必具有相似或相同功能的肽。
这里使用的术语“同源物(orthologue)”指(i)包含与这里描述的肽的序列相似的氨基酸序列和(ii)具有相似或相同功能的非人类肽(non-humanpeptide)。
这里使用的术语“相关的肽”指这里描述的肽的同系物、类似物、同工型(isoform)、同源物，或它们的任何组合。
这里使用的术语“衍生物”指包括通过导入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变的上述肽的氨基酸序列的肽。衍生肽具有与这里描述的肽相似或相同的功能。
这里使用的术语“片段”指包括与这里描述的肽的氨基酸序列的至少5个氨基酸残基(优选地，至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基酸残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基)的氨基酸序列的肽，细节上做必要的修改(mutatis mutandis)。所述肽的片段可能具有或不具有该肽的功能活性。
这里使用的术语“同工型(isoform)”指由相同基因编码的肽的变体，但是它们的等电点(pI)或者分子量(MW)不同，或者两者都不同。所述同工型的氨基酸组成可以不同(例如作为供选择的剪接或限制性蛋白水解的结果)，另外，可选地，可以由不同的翻译后修饰(例如，糖基化作用、酰化作用、磷酸化作用)产生。如这里使用的，术语“同工型”还指只以单一形式存在的肽，即所述同工型不表达为几种变体。
通过为了最佳比较(optimal comparison)目的而调整序列(例如，为了与序列进行最佳排列(best alignment)，在第一个序列中引入缺口)并且比较相应位点(position)的氨基酸残基或核苷酸，测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分率。“最佳排列”是导致最高同一性百分率的两个序列的排列。相比较的序列中相同的氨基酸残基或核苷酸的数目确定同一性百分率(即，同一性％＝相同位点的数目/总的位点的数目×100)。
利用本领域技术人员公知的数学算法能完成两个序列之间的同一性百分率的测定。比较两个序列的数学算法的实例是Karlin和Altschul的算法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)872264-2268、根据Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877改良。Altschul等，J.Mol.Biol.(1990)215403-410的NBLAST和XBLAST程序并入了这样的算法。利用NBLAST程序能进行BLAST核苷酸检索，分数＝100，词长＝12，获得与编码这里描述的肽序列的核酸分子同源的核苷酸序列。利用XBLAST程序能进行BLAST蛋白检索，分数＝50，词长＝3，获得和这里描述的肽同源的氨基酸序列。能使用根据Altschul等，NucleicAcids Res.(1997)253389-3402所述的Gapped BLAST，以获得为比较目的的缺口排列。可选地，PSI-Blast能被用来进行重复搜索，检测分子之间的远距离相关性(Id.)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，能使用各程序的默认参数(例如，XBLAST和NBLAST)。参见，例如，http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于比较序列的数学算法的另一个例子是Myers和Miller的算法，CABIOS(1989)。是GCG序列排列软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)并入了这样的算法。本领域公知的序列分析的其他算法包括Torellis和Robotti Comput Appl.Biosci.(1994)103-5中描述的ADVANCE和ADAM；和Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)852444-8中描述的PASTA。FASTA中，ktup是设置搜索敏度和速度的控制选项。
技术人员知道各种氨基酸具有相似性质。一个或几个其他某种氨基酸经常能取代一种物质的一个或几个同种氨基酸，但是不消除那种物质的期望的活性。因此氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸经常能彼此互相取代(具有脂肪支链的氨基酸)。这些可能的取代中优选的是使用甘氨酸和丙氨酸互相取代(因为它们具有相对短的支链)和使用缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸互相取代(因为它们具有较大的疏水性脂肪支链)。经常能被彼此取代的其他氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(带有芳香侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(带有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(带有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷酰胺(带有酰胺侧链的氨基酸)；和半胱氨酸和甲硫氨酸(带有含硫的侧链的氨基酸)。这种性质的取代作用经常称作“保守性(conservative)”或“半保守性(semi-conservative)”氨基酸取代。
也可以进行相对于这里描述的肽序列的氨基酸序列的氨基酸缺失或插入。因此，例如，对所述肽的活性不具有实质性作用的氨基酸，或者至少不消除所述活性的氨基酸可被缺失。也可以对这里描述的肽序列进行氨基酸插入。上述方法用做改变本发明蛋白的性质(例如有助于鉴定、纯化或表达蛋白，所述蛋白从重组来源获得，包括融合蛋白)。所述相对于重组来源的肽的序列的氨基酸变化可以利用任何合适的技术进行，例如通过利用定点诱变(site-directed mutagenesis)。当然可以通过标准化学合成技术来制备分子，例如固相肽合成，或通过可利用的生物化学技术来制备。
可以理解的是，本发明的范围内的氨基酸取代或插入，能利用天然存在的或非天然存在的氨基酸进行。不管是不是使用天然的或合成的氨基酸，优选只存在L-氨基酸。
根据本发明，能使用在抗原呈递细胞(APC)中代表内质网、溶酶体或核内体的纯化的微粒体在I类或II类MHC分子上加载抗原性肽。这里描述的体外和体内免疫的结果表明根据T细胞的增殖和IL-2的产生测定，加载肽的微粒体表现出比加载肽的APC强得多的应答。通过定量测定肽接受的I类MHC分子的量，APC表面上接受的I类分子低于放射化学检测限制。然而，在微粒体中检测到显著量的肽结合I类MHC。另外，与细胞表面相比较，在微粒体中检测到类似量的共同刺激的分子，B7.1和B7.2。因此，加载有抗原性肽的微粒体代表有效疫苗组合物。
本发明发现，APC的ER中50％以上的I类MHC分子是肽接受的。通过“膜内侧翻外的”过程，加载Kb特异性卵清蛋白(OVA)肽的微粒体能在体外和体内诱导T细胞应答。相反，使用相同肽脉冲的APCs具有的刺激T细胞应答的能力小得多。若微粒体包括共激分子，则与APC分离的微粒体代表着未来针对各种各样疾病的肽疫苗的有希望的赋形剂。
除了在微粒体制备之前将选择的MHC基因转染到动物细胞中之外，还可以用编码共激分子的基因转染或共同转染细胞，所述编码共激分子的基因例如B7的基因和/或编码细胞因子的基因，所述细胞因子例如白细胞介素或干扰素，所述白介素例如IL-2。在细胞因子情况下，转基因与CD2或CD4的跨膜结构域融合，使细胞因子定向进入ER膜。另外，为了富集MHC水平，ER、KDEL或其他ER滞留信号(retention signalling)中的共激分子和膜结合细胞因子(Nilsson T和Warren G.，Curr Opin Cell Biol.6(4)，517-21(1994))将在ER中用于滞留转基因产物的转基因C-末端进行标记。所述转基因的表达盒与I类MHC转基因相似。
因此，根据本发明，所述疫苗组合物可以和一种或几种能促进T细胞免疫应答的细胞因子，例如干扰素或白介素，例如IL-2、IL-15、IL-6、GM-CSF、IFNγ、促进T细胞应答的细胞因子和/或常规佐剂共同给药。上述物质可以在给药之前与加载抗原的微粒体适当地混合，或者可以适当地制备成微粒体的膜结合成分。所述膜结合成分可以利用如上所述的重组DNA技术来引入，在最终用来形成微粒体的细胞器中基因工程表达细胞因子，或者所述细胞因子可以被加载到微粒体膜中或者与表面蛋白结合。
在微粒体制剂中表达的膜结合细胞因子可以通过用包括选择性带有ER滞留信号的与膜锚定蛋白融合的细胞因子分子的构建体转染抗原呈递细胞来制备。例如，通过构建包括编码融合蛋白的核酸的载体可以制备包括膜结合IL-2分子的微粒体，所述融合蛋白包括与IL-2的C-末端融合的CD2膜结构域和ER滞留信号，例如来自E15-9K腺病毒蛋白的16氨基酸序列，其中ER滞留信号与CD2蛋白的C-末端融合。载体在抗原呈递细胞中的表达导致在细胞的细胞器，即ER中的细胞因子的蓄积，能制备含有膜结合细胞因子的微粒体。
另外，适当包括针对疫苗的特异性免疫应答的检测和监测，例如通过象酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)这样的技术检测血清细胞因子(例如IL-2和/或IFNγ)，或者使用肽加载微粒体的体外T细胞应答测定，或者细胞增殖测定。
在最简单形式中，本发明提供一种组合物，该组合物包括分离的动物细胞内质网的微粒体或者其膜片段，所述微粒体或其膜片段与外部暴露的肽抗原和主要组织相容性复合体(MHC)蛋白相结合。适当地配制成疫苗给药。
根据本发明的第二方面，提供了根据本发明第一或第二方面用于医药的组合物。因此本发明的这个方面延伸至患有疾病或病症的受治疗者的治疗或预防方法，包括对受治疗者施用如上定义的疫苗的步骤。
根据本发明的第三方面，提供了如上定义的组合物在制备用于疾病的预防或治疗的疫苗中的用途。所述疾病可以是微生物或病毒引起的感染，或者它可以是特征在于肿瘤细胞生长和/或肿瘤生成的癌症。或者，所述疾病可以是自身免疫疾病，其中疫苗具有诱导对自身抗原的耐受性的治疗用途。根据本发明的这方面的用途还延伸至这样的疾病的治疗方法，该方法包括对需要的受治疗者施用所述组合物。适当地，能通过任何常规途径施用本发明的疫苗组合物，例如肌内、静脉内、腹膜内、口服或通过对脑脊液注射给药。
能使用本发明的疫苗治疗的疾病或病症包括但不限于黑素瘤、肺腺癌、结肠癌、乳癌或白血病。自身免疫疾病包括但不限于多发性硬化(MS)、全身红斑狼疮、1-型或胰岛素依赖型糖尿病、抗磷脂综合征、重症肌无力、肌炎、斯耶格伦氏综合征和类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)。另外，病毒感染，例如HIV感染、疱疹病毒感染、丙肝病毒感染；或寄生虫感染，例如疟原虫原生寄生虫感染，疟疾的成因物质，例如镰状疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、或诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)，或者另一种寄生虫，例如鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、或布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、或痢疾变形虫(Entamoeba histolytica)、或兰伯氏贾第虫(Giardia lambia)，或细菌感染，例如大肠杆菌E.coli 0157、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)等。
还可以预见到，在对患者施用本发明组合制剂之前，本发明的微粒体在加载肽抗原时，可以与抗原呈递细胞(APC)融合。适当地，在治疗之前从患者取得APC，但是也可以从同种异体来源获得。在这样情况下，使用细胞的同种异体来源，免疫抑制药物也可以形成治疗方案的一部分。
根据本发明的第四方面，提供了制备如上定义的疫苗组合物的方法，该方法包括在核苷三磷酸(NTP)存在下孵育微粒体群和抗原性肽，接着进一步处理，制备翻转的微粒体并且在生理稀释剂和选择性包括的佐剂中配制得到制剂。象葡萄糖这样的试剂被包括其中，具有保持制备的微粒体疫苗的构象的能力。适当地，将孵育所得的微粒体洗涤，并重悬于疫苗的生理稀释剂溶液中，所述稀释剂包括一定量的抗原性肽以防止存在于微粒体膜上的MHC-肽复合物解离。
在核苷三磷酸(NTP)，例如ATP、GTP、CTP、TTP或UTP存在下，进行用抗原加载微粒体的过程。也可以在一种以上类型的抗原肽的存在下实施抗原加载方法。在这种方法中，多种抗原可以被加载到微粒体中。
通过进一步处理微粒体可以制备翻转的微粒体，即在使膜重组并且适合形成“膜内侧翻外”形式微粒体的条件下分裂微粒体的膜。因此反复冷冻-融解步骤的利用在这方面是合适的。例如，能在合适的介质或缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))中悬浮微粒体，然后暂时浸入液氮中合适的时间，适当地1分钟至5分钟，优选2分钟，然后移至37℃，例如在水浴中，保持适当时间，适当地2-6分钟，优选4分钟。冷冻-融解重复步骤的次数可以是3-5次，适当地4次重复步骤。
在本发明这方面的另一个具体实施方式
中，所述方法包括用抗原加载如上所述制备的翻转微粒体。为了将抗原性肽加载到翻转微粒体中，NTP的存在可能不是必需的(尽管可能是值得的)。
根据本发明的第五方面，提供了在密封容器中包括如上定义的组合物和一种或几种细胞因子和/或佐剂的部分的试剂盒。合适地，试剂盒包括如上定义的本发明方法或用途的说明。
根据本发明的第六方面，提供了试剂盒部分，所述部分包括如上定义的组合物和一种或几种细胞因子和/或佐剂分子以对受治疗者单独、依次或同时给药。
本发明第二方面和随后几个方面的优选特征与第一方面一样，细节上作必要的修改(mutatis mutandis)。
在本发明特别优选的具体实施方式
中，提供了用于疾病的预防或治疗的疫苗组合物，所述疾病的特征是定义的抗原或由感染物质引起的潜在免疫原性的肽序列的表达，或者特征是天然细胞抗原的表达，其中组合物是通过下面的方法制备的(1)获得表达MHC蛋白的抗原呈递细胞的样品；(2)在分离微粒体制品的条件下将细胞匀浆；(3)制备抗原性肽，例如利用重组DNA技术，或者从天然组织来源、或感染物质的来源分离，或者在大多数情况下从合成的抗原性肽分离；(4)在NTP存在下孵育抗原性肽和微粒体，将抗原性肽加载给微粒体；(5)进一步处理步骤(4)中加载的微粒体，制备翻转微粒体群；(6)适当时在生理稀释剂和/或佐剂中配制加载的翻转微粒体的疫苗。
如上所述，还可以从分离的细胞群或细胞系制备微粒体。在微粒体制备之前可能已经用表达选择的蛋白的核酸构建体转染细胞或细胞系。
根据上述方案，用抗原性肽对微粒体加载，然后接着处理，制备翻转的微粒体。但是，在另一个具体实施方式
中，可以首先制备翻转微粒体，然后用抗原加载，在这种情况下步骤(4)中NTP的存在不一定是必需的。
如上所讨论的，本发明的疫苗组合物优选包括翻转微粒体，更优选均匀的翻转微粒体群。但是，所述翻转微粒体群中也可以存在没有翻转的微粒体。
细胞可以是MHC阴性的，这样允许用编码选用于疫苗的MHC类分子的合适的核酸转染细胞系。抗原的制备也可以包括利用化学方法合成抗原性肽。
在NTP存在下发生用抗原性肽对没有翻转的微粒体加载。翻转微粒体的加载没有表现出必需存在NTP，但是这是优选的。


参照下面的实施例和附图进一步描述本发明，提供实施例和附图的目的只是为了详细描述而不是为了限制本发明。参考下面的附图，其中图1显示用RAW309Cr.1细胞的微粒体中交联剂修饰的OVA肽进行的H2-Kb分子的交联。125I-标记的ANB-NOS-OVA肽在存在或不存在ATP再生系统下、或者存在或不存在10倍摩尔过量天然OVA-肽下，与RAW309Cr.1细胞的微粒体混合。交联的H-2Kb已标明；图2显示RAW309Cr.1细胞的微粒体中OVA-肽接受H-2Kb的浓度。对于OVA-肽接受H-2Kb的半定量，在UV照射下，分别用微粒体或RAW309Cr.1细胞孵育10nM标记的肽。用R218抗血清沉淀H-2分子，并且通过磷成像(phospho-imaging)定量测定交联的Kb分子；图3显示微粒体中或RAW309Cr.1细胞的表面上H-2分子的测定。在10％SDS-PAGE上分离30微克来自RAW309Cr.1微粒体或RAW309Cr.1细胞的NP40溶胞产物的蛋白。以指定的滴定法稀释溶胞产物并且在SDS-PAGE上分离。通过R218抗-H-2抗血清检测H-2分子的免疫印迹；
图4显示RAW309Cr.1细胞的微粒体中B7.1、B7.2和ICAM-1的测定。在10％SDS-PAGE上分离30微克来自RAW309Cr.1微粒体或RAW309Cr.1细胞的NP40溶胞产物的蛋白。通过特异性抗体检测B7.1、B7.2和ICAM-1的免疫印迹；图5显示OVA-肽编辑的微粒体对B3Z T细胞的刺激。如材料和方法中所述使用来自2×105RAW309Cr.1细胞的微粒体加载OVA或Ld-特异性肽，。用OVA肽脉冲2×105RAW309Cr.1细胞(参见材料和方法)。洗涤之后，肽脉冲的2×105RAW309Cr.1细胞、OVA-加载的微粒体、Ld-肽加载的微粒体和没有肽的微粒体与105B3Z细胞共同培养过夜。A)用PBS洗涤之后，用LacZ底物ONPG通过总的细胞溶胞产物分析B3Z细胞中LacZ活性。37℃下孵育4小时之后读取吸光度(415纳米)。用100nM OVA肽培养的B3Z细胞和正常基质被用作B3Z刺激的阳性对照和阴性对照。B)对这些培养物的上清液通过ELISA测定IL-2产生。将实验重复四次，得到相同结果。误差条指明三份培养物的SEM；图6显示用由不同浓度的OVA-肽预先加载的2×105RAW309Cr.1细胞的微粒体对B3Z T细胞的刺激。加载有指定的不同浓度OVA-肽的微粒体与B3Z细胞一起培养过夜，然后测定LacZ活性；图7显示OVA-肽编辑的微粒体刺激体内特异性T细胞应答。用OVA-编辑微粒体(OVA-edited microsomes)或Ld-肽加载微粒体或OVA肽或OVA-脉冲RAW309Cr.1细胞i.s.对C57BL/6(H-2b)小鼠致敏，并且7天之后用相同刺激激发。所述激发之后6天，从脾中分离富集的T细胞并且以105细胞/孔与指定的刺激物培养。在与T细胞共同培养之前对RAW309Cr.1细胞照射三天之后，收集上清液用于细胞因子ELISA(b)并且用[3H]胸苷(a)对培养物脉冲。结果代表每个治疗小组至少三只小鼠的小组，并且实验重复四次，得到相似结果。误差条指示三份培养物的SEM。对Balb/c(H-2d)小鼠实施类似实验作为阴性对照；图8显示T细胞受体(Tcell receptor，TCR)诱导的MAK激酶的激活。分别用OVA-脉冲的RAW309Cr.1、OVA-微粒体和抗-CD3/CD28刺激来自OVA-微粒体免疫的C57BL/6的107 T细胞。通过抗-p-ERK和抗-p-JNK抗体检测ERK和JNK的激活。通过作为加载对照的抗-ERK和抗-JNK检测ERK和JNK的相似水平；图9显示在微粒体中而不是在RAW309Cr.1细胞的表面检测OVA-接受H-2Kb。10 nM125I-标记的ANB-NOS-OVA肽在指定浓度下与或不与天然OVA肽混合。混合肽与相当于107 RAW309Cr.1细胞的微粒体或者与107RAW309Cr.1细胞孵育。交联的H2-Kb分子已标明；图10显示流感病毒肽编辑的Kb-微粒体在体内诱导T-细胞应答的研究结果(每组5只小鼠)；图11显示DC和制备的微粒体的电子显微照相照片(A)放大×12000和(B)放大×40000是来自RAW细胞的制备的微粒体；(C)放大×40000是反复冷冻-融解和加载肽而翻转的微粒体，显示开放的或翻转的微粒体。在照片中看不到加载的肽；图12显示对来自A2黑素瘤患者的MAGE-A2特异性T-细胞进行研究的结果；图13显示I类MHC抗原A2α链母体和B7α链母体(登记号分别是P01892和P01889)的氨基酸序列；图14显示II类MHC抗原DRB3-1β-链母体和HLA-DQα1(DQw4特异性)母体-人类(登记号分别是P79483和A37044)的氨基酸序列。
具体实施例方式
材料和方法细胞系和动物B3Z是表达LacZ的CD8 T细胞杂交瘤，该杂交瘤响应对SIINFEKL肽特异性的T细胞受体的激活，I类H-2Kb MHC分子呈递所述SIINFEKL肽。RAW309Cr.1，一种Kd/Kb鼠巨噬细胞细胞系，用作APCs，从ATCC(ATCCTIB-69)获得。所有的细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基(Dulbecco′smodified Eagle′s medium)中培养。获得6周龄的雌性C57BL/6小鼠H-2b和Balb/c小鼠H-2d。根据被认可的的方案对动物进行所有的处理。
抗体、肽和肽修饰利用常规F-moc化学方法，在肽合成仪(431A型，Applied Biosystems，Foster City，CA)中合成所有的肽，并且接着通过高效液相色谱(HPLC)纯化。将纯化的肽溶解于PBS。
通过将第三个残基异亮氨酸取代为酪氨酸以用于碘化作用，并通过使叠氮基苯与第七位赖氨酸的ε-氨基上的硝基共价偶联来修饰肽OVA 257-264(SIINFEKL)。上述硝基可以被光活化。通过将200微升二甲基亚砜(DMSO)中的0.5毫克ANB-NOS(N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧琥珀酰亚胺)与100微升PBS中的100微克肽和50微升CPAS(3-[环己基氨基]-1-丙磺酸)(0.5摩尔/升，pH10)混合来进行交联剂修饰。使反应在冰上进行30分钟。为了去除过量的ANB-NOS和离子，通过在Sephadex G-10上凝胶过滤，并接着通过HPLC来纯化混合物。用氯胺-T-催化的碘化作用(125I)标记一等份的肽(1微克)。修饰和标记实验避光进行。
抗血清、免疫沉淀和SDS-PAGE抗H2的兔抗清(R218)由Karolinska研究所Dr.Sune Kvist友情提供。对证实的H2特异性的单克隆抗体(Y3)由剑桥大学的Tim Elliot友情提供。抗JNK、ERK、p-ERK和p-JNK抗血清从(Santa Cruz Biotechnology)获得。根据Li等(J Biol Chem..274(13)，8649-54(1999))所述进行免疫沉淀、免疫印迹和SDS-PAGE。Protein-A-Sepharose从Pharmacia(Uppsala，瑞典)获得。
实施例1微粒体制备和肽结合测定根据Saraste等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，6425-6429(1986))的步骤制备和纯化来自RAW309Cr.1的微粒体，RAW309Cr.1为一种Kd/Kb鼠巨噬细胞细胞系。I类免疫遗传学是RAW细胞和Balb/c小鼠中的Kb。
以利用Saraste等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，6425-6429(1986))和Knipe等(J.Virol.21，1128-1139(1977))对微粒体膜分级分离的改良方法为基础从B细胞制备微粒体。所有步骤在0-4℃下进行。
·收集3×109细胞并且用冷的PBS冲洗一次。
·在含有10微升苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(100mM)的20毫升STKMM-缓冲液中重悬浮细胞。
·4℃下以1500转/分(rpm)转5分钟。
·在10毫升H2O(有5微升PMSF)中重悬浮。
·在40毫升杜恩斯组织匀浆器(Dounce)中匀浆，20个冲程。
·加入30毫升STKMM并且充分混合。
·倒在JA-18试管中。
·4℃下以7500转/分离心10分钟。
·小心地将上清液收集到新试管中。
·4℃下以15500转/分离心54分钟。
·用10毫升STKMM缓冲液小心冲洗沉淀团，然后用吸移管将沉淀团重悬浮于1毫升RM缓冲液中并且在15毫升杜恩斯匀浆器(douncer)中匀浆。粗微粒体以AOD280＝60的浓度稀释。
·在含有5 mM苯甲脒的5毫升的0.33M蔗糖的顶部铺上总微粒体(上述)，接着在由1毫升的2M蔗糖/5mM苯甲脒组成的蔗糖垫的顶部铺上。
·在SW41转子中以110000×g离心60分钟在上述垫的顶部得到总微粒体带。小心收集总微粒体带。然后将2M蔗糖/5mM苯甲脒缓慢加入微粒体，得到45％(重量/体积，w/v)蔗糖最终浓度。
·利用Paulsson等(J Biol Chem.277(21)，18266-71(2002))描述的方法的改进方法通过浮选法(floatation)将微粒体再分级分离。将3毫升的45％(w/v)蔗糖中的100微升总的微粒体放置在SW41超离心试管的底部，盖上下面的蔗糖溶液30％的1毫升，27.5％、25％、22.5％和20.0％的各1.9毫升(所有的溶液含有5mM苯甲脒)。
·4℃下以37000转/分离心10小时之后(达到等密度条件)，通过向上移动收集25个各300微升的级分。
·通过用抗-p58抗体(p58是一种ER蛋白)进行蛋白印迹测定ER级分。
·在肽加载和免疫实验中使用倒入的ER级分。
交联混合物在总体积100微升RM缓冲液(250 mM蔗糖，50mM三乙醇胺盐酸盐(TEA-HCl)，50mM KOAc，2mM MgOAc2，和1mM二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT))中含有50或100nM(125I)的ANB-NOS-肽和10微升的微粒体(60A280/毫升)。混合之后，立即在室温下在366纳米照射样品5分钟。然后通过RM缓冲液中0.5-M蔗糖垫离心回收膜。用冷的RM缓冲液将膜洗涤一次。洗涤的膜溶解用于免疫沉淀或免疫印迹。如Li等(J Biol Chem.274(13)，8649-54(1999))所述，与ATP的交联反应包括ATP再生系统。混合100nM的(125I)ANB-NOS-肽和107细胞，相当于在总体积100微升的RM缓冲液中制备10微升微粒体所使用的细胞量，进行RAW309Cr.1细胞上表面Kb分子的交联。混合之后，立即在室温下照射样品5分钟。用RM缓冲液洗涤去除过量肽。细胞溶解用于用Y3抗体的免疫沉淀。
通过4℃下将RAW309Cr.1细胞与Y3抗体孵育15分钟进行对表面I类MHC的检测。洗涤之后，细胞溶解于1％ NP40溶胞缓冲液，并且用蛋白-A珠沉淀澄清的溶胞产物。用R218抗血清通过免疫印迹检测沉淀的I类MHC。
室温下利用ATP再生系统将微粒体与天然肽混合10分钟进行肽编辑用于刺激T细胞。离心之后通过RM缓冲液中蔗糖垫去除过量肽。加载的微粒体在液氮中交替冷冻/融解，然后37℃水浴，反复10次。将处理过的微粒体以(6A280/毫升)的浓度重新悬浮于PBS中并且保存在-80℃待用。在1毫升基质中将100nM肽和107细胞混合过夜或者在37℃在1毫升PBS中混合4小时来制备肽脉冲的RAW309Cr.1细胞。脉冲的细胞在与B3Z T细胞混合之前用PBS洗涤，或者将上述混合物直接加给B3Z。
实施例2B3ZT细胞杂交瘤的激活向总体积200微升的105B3Z细胞的培养物加入包括肽-编辑微粒体、肽-脉冲RAW309Cr.1细胞、OVA肽的所制备刺激物。加入PBS和抗-CD3/CD28包被小球分别作为阴性对照或阳性对照。过夜孵育之后，通过使用邻硝基苯基b-D-吡喃半乳糖苷(Sigma)底物LacZ活性指示B3Z的激活。由于B3Z细胞本身表达Kb且呈递SIINFEKL，所以通过向基质中加入SIINFEKL的系列稀释液测定OVA-响应的线性范围。
实施例3在微粒体中而不是在APC表面上检测肽-接受I类MHC分子有人报道过使用交联剂修饰的肽和分离的来自RAW309Cr.1的ER微粒体测定体外肽转运和加载(Li等，J Biol Chem.274(13)，8649-54(1999))。测试检查ATP存在下肽跨越ER膜的易位以及随后在I类MHC分子上加载肽(Wang等J Immunol.157(1)，213-20(1996))。
为了测定微粒体膜中肽-接受I类MHC分子，将交联剂(ANB-NOS)与H2-Kb-结合卵清蛋白(OVA)肽(残基257-264，SIIFEKL)的赖氨酸残基的ε-氨基结合，并且用酪氨酸取代位置3上的异亮氨酸残基用于碘化作用。上述修饰使得在组装期间OVA肽与H2-Kb分子光致交联(photo-cross-linking)。为了定量比较微粒体中和活RAW309Cr.1细胞表面上的肽-接受H2-Kb，修饰的OVA肽用125I标记，并且在UV照射下与RAW309Cr.1和活RAW309Cr.1细胞的微粒体孵育。接着用抗-H2抗体Y3通过免疫沉淀分析肽-结合的H2-Kb分子。不存在ATP时，只有几个Kb分子与OVA肽组装；同时在ATP存在下，显著量的Kb分子与OVA肽交联(图1)。这个结果证明ER中存在大量肽接受的I类分子。
对微粒体中和RAW309Cr.1表面上OVA-交联Kb的半定量分析表明，与微粒体中肽接受Kb分子的高水平相反，APC表面上OVA-结合的Kb分子低于放射化学可检测水平(图2)，再一次证明肽-接受I类MHC分子主要在ER中，但是不在APC表面。在竞争实验中，证明这种修饰的OVA肽与Kb的结合是特异性的。为了检验修饰的OVA-肽的亲合力，标记的所述OVA肽与其不同浓度的天然形式竞争。天然OVA肽在报道肽的浓度下竞争50％的报道肽，并且在10倍报道肽的浓度下完全破坏结合(图2)。此外，Ld特异性肽不能竞争OVA结合。这表明修饰的OVA-肽的结合亲和性是Kb特异性的并且与它的天然形式相似。为了定量测定与从106RAW309Cr.1得到的微粒体中Kb分子结合的肽的量，在ATP存在下，标记的肽与微粒体孵育。交联之后，I类MHC沉淀出并且测定肽-结合Kb的每分钟衰变数(disintegrationsper minute，dpm)，并且转化为肽的浓度。结果表明，大约500至1000个肽与一个细胞中的微粒体中的Kb分子结合。另外，ER中I类MHC分子的总量比RAW309Cr.1细胞表面上的多(图3)。因此，来自APC的微粒体能将足够的肽-I类MHC复合体送递给T细胞。
实施例4APC的微粒体中存在B7和ICAM1完全T细胞应答需要来自抗原-MHC复合体和如B7的共激分子的信号(Acuto等，Immunol Rev.192，21-31(2003))。和所有的膜蛋白一样，共激分子在ER中合成，接着在APC的表面上表达。为了定量测定分离的微粒体中B7和ICAM-1共激分子的量，溶解相当于5×106RAW309Cr.1的微粒体，并且分别使用对上述分子特异性的抗血清进行蛋白印迹分析澄清的溶胞产物。在比较中，还用相同的抗体对5×106RAW309Cr.1的总细胞溶胞产物进行印迹。通过密度分析定量测定B7.1、B7.2和ICAM-1带的密度。在微粒体样品中容易测定B7和ICAM-1(图4)。微粒体中测定的量是总的细胞溶胞产物的大约一半。肽-编辑微粒体中足量共激分子的存在能模拟APC的功能表面，提供抗原-MHC和对T细胞的共同刺激信号。
实施例5加载Kb特异性OVA肽的微粒体在体外刺激T细胞为了研究肽-加载微粒体诱导特异性T细胞应答的能力，通过反复冷冻-融解方法(材料和方法)对天然OVA肽-编辑微粒体进行膜内侧翻外的处理。使用处理过的微粒体和OVA-肽脉冲的RAW309Cr.1刺激识别Kb-SHNFEKL复合体的B3Z T细胞杂交瘤(Fremont等，Proc Natl Acad Sci U S A.92(7)，2479-83(1995)；Shastri N和Gonzalez F.，J Immunol.150(7)，2724-36(1993))。洗涤出过量肽之后，通过诱导IL-2产生和IL-2-启动子启动的LacZ的表达，OVA编辑的微粒体刺激B3Z T细胞(图5)。通过B3Z细胞对没有肽或加载了Ld特异性肽的微粒体没有应答性，支持OVA-Kb诱导的B3Z应答的特异性(图5)。此外，B3Z对OVA-编辑微粒体的应答水平与OVA-肽的量有关(图6)。OVA-脉冲的RAW309Cr.1在过量肽的存在下能诱导B3Z应答(Schott等，Proc Natl Acad Sci U S A.99(21)，13735-40(2002))。
但是，如果通过洗涤去除了过量的肽，OVA-脉冲的RAW309Cr.1不再能诱导B3Z应答。如果OVA本身能诱导B3Z细胞产生IL-2(图5)，表明不是RAW309Cr.1，而是OVA本身都B3Z的刺激物。最近报道了SIINFEKL体外诱导Kb限制T细胞应答的能力，提出CTL能彼此呈递肽(Schott等Proc Natl Acad Sci U S A.99(21)，13735-40(2002))。但是，肽-编辑微粒体在体外诱导CTL应答，但是肽-脉冲的RAW309Cr.1不诱导，这与肽结合结果相吻合(图2)，并且表明肽-编辑微粒体能模拟APCs，有效地将抗原性肽呈递给TCR，并且刺激CTL的全应答。
实施例6用Kb-特异性OVA肽加载的微粒体在体内诱导OVA-肽应答为了进一步检验OVA-编辑微粒体在体内诱导免疫应答的能力，使用来自RAW309Cr.1细胞的OVA-编辑微粒体、加载有Ld-特异性肽的微粒体、可溶性OVA肽、OVA肽脉冲的RAW309Cr.1和PBS在体内诱导免疫应答。分别用上述刺激物两次皮下注射五组C57BL/6或Balb/c小鼠，每组5只小鼠。注射间隔是一周。第二次注射之后6天，从脾分离T细胞，并且分别用五种源刺激物体外交叉刺激。另外，使用抗-CD3/CD28包被小球作为阳性对照。PBS刺激的T细胞对任何刺激没有响应，而抗-CD3/CD28在所有的组中诱导增殖响应。OVA-肽脉冲的RAW309Cr.1和加载有Ld-特异性肽的微粒体不诱导T细胞应答(图7)。相反，来自OVA-编辑微粒体和OVA肽C57BL/6组的T细胞体外对OVA-编辑微粒体应答，而对OVA-脉冲的RAW309Cr.1或加载有Ld-肽的微粒体不应答(图7)。IL-2产生的非常有说服力的结果(图7)再次证实OVA-编辑微粒体在体内诱导特异性T细胞应答(图7)。Balb/c具有H-2d，因此，没有诱导的OVA应答。
实施例7OV-微粒体激活的TCR信号传输途径为了分析响应OVA-微粒体刺激的TCR信号传输，使用从OVA-微粒体免疫C57BL/6小鼠分离的T细胞来体外诱导TCR信号传输。在用抗-CD3/CD28或用OVA-编辑微粒体，但是不用OVA-脉冲的RAW309Cr.1(图8)刺激的T细胞中检测ERK和JNK的激活。因此，生物化学证据证明响应微粒体上OVA-Kb的特异性TCR信号传输，并且进一步证明用抗原性肽编辑微粒体能在体内诱导特异性免疫应答。
实施例8流感病毒肽加载的微粒体将来自小鼠流感病毒的Kb特异性肽(ASNENMETM)加载到来自Kb特异性RAW细胞的微粒体中。使用加载的微粒体对C57BL/6小鼠免疫接种。在分开的组中，使用PBS或肽作为对照。经7天时间施用两次抗原之后，从脾分离T-细胞，并且与PBS或肽、肽、或肽-加载微粒体交叉培养三天。在免疫接种之后第四天测定T-细胞增殖。结果如图10所示。
实施例9对黑素瘤细胞的作用一对一地用从手术活组织检查纯化的自体固有的肿瘤细胞，并用重组-人白细胞介素-2(r-human IL-2)(10单位/毫升(U/mL))四次(每次给药间隔5天)分别刺激从三名A2黑素瘤患者(P1，P2，P3)分离的T-细胞。通过细胞毒性测试对特异性抗肿瘤应答进行分析，并且与肿瘤细胞系K259比较。将MAGE肽加载给从221-A2人B-细胞系分离的微粒体，其中缺失MHC基因座，并且接着用HLA-A2转染。来自黑素瘤患者的T-细胞系在正常培养基中与肽、微粒体或肽-加载微粒体培养三天。第三天测定增殖。结果如图12所示。
讨论这些结果证明，能使用来自ER的微粒体来处理I类MHC上的编辑的抗原性肽，处理过的微粒体能重新构成APC的功能表面来诱导CTL应答，因此，与共同刺激因子分子结合的微粒体I类MHC送递的抗原性肽是肽疫苗的新形式。
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表1I类HLA-限制癌/睾丸抗原。发现睾丸的正常精母细胞和/或精原细胞表达这些抗原。发现MAGE-3、MAGE-4和GAGE基因有时也在胎盘中表达[26、24]。发现NY-ESO-1抗原在正常卵巢细胞中表达[18]。


a当与首次报道表位序列的文献不同时，给定参考文献中描述的肿瘤间组织分布。
表2I类HLA-限制黑素细胞分化抗原。这些抗原只能在相同谱系的(lineage)正常和赘生性细胞(即黑素细胞、皮肤、视网膜、周围神经节)中或者在前列腺的正常细胞中表达

a两个不同的研究小组同时发现这个基因并且给它两个不同的名字，分别是MART-1和Melan-A。
表3I类HLA-限制性广泛表达的抗原


aCAP-1是这种肽的另一个名字b当与第一次报道表位序列的文献不同时，给定参考文献中描述的肿瘤间组织分布c端粒酶在大多数人肿瘤中表达列出的那些显示易于被细胞毒性T淋巴细胞溶解d所有的上皮组织表达粘蛋白，象高糖基化分子。
表4 I类HLA-限制肿瘤特异性抗原，包括特有的(CDK-4、MUM-2、MUM2、β-连环蛋白、HLA-A2-R170I、ELF2m、肌球蛋白-m、凋亡蛋白酶-8(caspase)，KIAA0205、HSP70-2m)和共有的(CAMEL、TRP-2/INT2、GnT-V、G250)抗原

aVLPDVFIRC(V)＝都被CTL识别的九肽和十二肽b这种抗原在正常细胞中不表达，因为对精巢组织没有进行试验，在获得更多信息之前不清楚这种抗原属于哪类。
表5II类HLA-限制抗原


a所有上皮细胞高度表达糖基化粘蛋白，而赘生性细胞经常显示具有正常蛋白序列的高糖基化粘蛋白b当与第一次报道表位序列的文献不同时，给定参考文献中描述的肿瘤间组织分布。
表6融合蛋白衍生的表位(正常组织中从来没有发现融合蛋白)

a这些bcr-abl表位不是真的融合蛋白产生的表位，因为它们从外部bcr-abl结合衍生。
表7给定HLA等位基因识别的表位频率

表8以前测得的在HCV-暴露患者中被识别的HCV肽

选自Anthony等Clinical Immunol.，vol.l03，第264-276页(2002)。
表9HIV-CTL肽表位

选自Kaul等，J.Clinical Invest.，vol.107，第1303-1310页(2001)
表10HCV病毒肽抗原

选自Koziel等，J.Virol.，vol.67，第7522-7532(1993)表11HCV病毒肽抗原

选自He等PNAS USA，vol.96，第5692-5697页(1999)。
权利要求
1.一种疫苗组合物，该组合物包括分离自动物细胞的翻转的微粒体，或者其膜片段，所述微粒体或其膜片段与外部暴露的肽抗原和主要组织相容性复合体蛋白相结合。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述微粒体来自细胞的内质网。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，所述主要组织相容性复合体蛋白来自与从中获得微粒体的细胞异种的来源。
4.如前面任意一项权利要求所述的组合物，其中，所述组合物还含有一种或几种共激分子。
5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述共激分子选自由B7和IL-2组成的组。
6.如前面任意一项权利要求所述的组合物，其中，所述抗原来自病毒、细菌、酵母、真菌或原生动物来源。
7.如前面任意一项权利要求所述的组合物，其中，所述抗原为自身抗原。
8.如权利要求6所述的组合物，其中，所述抗原来自赘生性细胞或癌细胞，或者为正常自身蛋白。
9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述赘生性细胞或癌细胞选自黑素瘤、肺腺癌、结肠癌、乳癌或白血病细胞。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的组合物，该组合物用于药物中。
11.对忠有疾病或病症的受治疗者治疗或预防的方法，该方法包括对受治疗者施用权利要求1-9中任意一项所述的疫苗而治疗所述疾病或病症的步骤。
12.权利要求1-9中任意一项所述的组合物在制备预防或治疗疾病病症的疫苗中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中，所述疾病为由病毒、细菌、酵母、真菌或原生动物引起的感染。
14.如权利要求12所述的用途，其中，所述疾病为癌症。
15.如权利要求14所述的用途，其中，所述癌症为黑素瘤、肺腺癌、结肠癌、乳癌或白血病。
16.如权利要求12所述的用途，其中，所述疾病为自身免疫疾病。
17.如权利要求16所述的用途，其中，所述自身免疫疾病为多发性硬化、类风湿性关节炎或全身红斑狼疮。
18.一种制备权利要求1-9中任意一项所述的疫苗组合物的方法，该方法包括在核苷三磷酸存在下孵育微粒体群和抗原，接着处理以制备翻转的微粒体，并且在生理稀释剂和选择性含有的佐剂中将得到的制品制成制剂。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述微粒体来自细胞的内质网。
20.如权利要求18所述的方法，其中，所述主要组织相容性复合体蛋白来自与从中获得微粒体的细胞异种的来源。
21.如权利要求18所述的方法，其中，所述主要组织相容性复合体蛋白来自与从中获得微粒体的细胞自身的来源。
22.如权利要求18-21中任意一项所述的方法，其中，所述组合物还包括一种或几种共激分子。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述共激分子选自B7和IL-2组成的组。
24.如权利要求18-23中任意一项所述的方法，其中，所述抗原为来自病毒、细菌、酵母、真菌或原生动物的抗原。
25.如权利要求18-23中任意一项所述的方法，其中，所述抗原为自身抗原。
26.如权利要求18-23中任意一项所述的方法，其中，所述抗原来自赘生性细胞或癌细胞，或者为正常自身蛋白。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述赘生性细胞或癌细胞选自黑素瘤、肺腺癌、结肠癌、乳癌或白血病细胞。
28.一种试剂盒，该试剂盒包括在密封容器中的权利要求1-9中任意一项所述的组合物以及一种或几种细胞因子和/或佐剂。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其中，所述细胞因子是I1-2或IFNγ。
30.一种试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-9中任意一项所述的组合物以及一种或几种细胞因子和/或佐剂，用于对受治疗者单独、依次或同时给药。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述细胞因子为I1-2或IFNγ。
全文摘要
本发明提供了一种疫苗组合物，该组合物包括来自动物细胞的翻转的微粒体，或者其膜片段，所述微粒体或其膜片段与外部暴露的肽抗原和主要组织相容性复合体蛋白相结合。
文档编号A61P37/00GK1856322SQ200480027398
公开日2006年11月1日 申请日期2004年7月30日 优先权日2003年8月1日
发明者王平, 李苏翎 申请人:玛丽皇后和威斯特-弗尔德学院