专利名称：载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的制备方法。特别是一种载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法。
背景技术：
免疫治疗在针对传染性疾病以及肿瘤的预防和治疗中扮演着重要的角色。免疫治疗的手段不外乎各种抗原和抗体对于人体的使用。抗体，无论是单克隆还是多克隆，均为蛋白大分子，而抗原则相当多样化，包括细胞、病毒、蛋白、多肽、以及基因物质。
近10多年来，以可降解、生物兼容的聚合物为基质的缓释微球在小分子化学药物及多肽药物上有着成功的应用，这类缓释微球能够使多肽抗原在体内长时间(或多脉冲)释放，产生持续的抗体响应和其它免疫应答也多有报道。通过纳米或微小颗载体将抗原输送到APC胞浆，从而诱导细胞免疫，特别是CTL应答的工作也吸引了相当的研究投入。在此基础上如何将蛋白大分子抗原、抗体包封在这类对于多肽分子成功的输送体系中，使之以自然构像释放于循环系统或体内特定的靶位是本发明所要解决的问题。
对于在可降解高分子剂型中保持蛋白大分子的自然构像，不少研究者做过有益的尝试。比如，在过去的几十年里，文献中见到过各种关于提高蛋白质在微囊包过程中的稳定性的方法的报道。但是，这些方法只能解决一个或一部分问题，而对于其他问题不能兼顾，甚至引发出新的问题。也有些方法只适用于特定的一种蛋白质。还有一些报导也由于研究者自身所关注的研究领域不同而显得互相矛盾。举个例子说明，对于市场上唯一同类产品--缓释重组人类成长激素(rhGH)来说，其稳定性是靠和锌形成络合物来实现的。而与锌形成络合物是rhGH在体内的自然形态。当这种锌络合制备方法用于另一种蛋白，如促红细胞生成素(EPO)，蛋白分子发生聚集的比率可以高达40％，引起导致免疫原性的顾虑。为避免蛋白在微囊包过程中因解除有机溶剂而变形失活，科学家预先将蛋白分子与糖类、无机盐或者其他保护剂制为固体颗粒状，从而采取一种固体分散在油相，在进一步分散在水相(即油包固体—水包油，S-O-W)的方法微囊包蛋白药物。这些蛋白稳定化辅料常常由于其高溶解度而产生强渗透压力，引起突释。比如，当溶解度高的硫酸盐用于提高EPO在微囊包过程中的素稳定性时，突释高达总剂量的55％。
(Cleland，J.L.，Jones J.S.，稳定的重组人生长素和珈吗干扰素剂型用于生物可降解的微球微囊化.药学研究，1996年，第13期，第1464-1475页)；Cleland和Jones研究了在W-O-W(油包水-水包油)和S-O-W微囊化过程中各种辅料对重组人类生长激素和干扰素的保护作用，发现甘露醇和海藻糖能够在防止蛋白在微胶囊过程中聚集这个方面起到最好的作用。Sanchez核查了类似的赋形剂对于另一种蛋白——破伤风类酶素的保护作用，结果发现在Cleland和Jones的报告中被认定为对复原重组人类生长激素和干扰素不起有效作用的葡聚糖能在水合条件下的释放阶段对蛋白质起到最好保护功能。这样的实验似乎说明了单糖在干燥过程中对蛋白能起到更好的保护作用，而高分子化合物则在释放阶段起到更好效果。不过，Sanchez的葡聚糖-PLGA复合微球缓释剂型的释放曲线显示60％的载药量发生了突释。这种突释放也许是由于直接冻干法制备的蛋白-辅料颗粒尺寸过大引起的。
在S-O-W过程中，预制备的蛋白颗粒的大小十分重要。[Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.Formation and Isolation of Spherical fine protein Microparticles throughLyophilization of protein-poly(ethylene glycol)Aqueous Mixture.Pharm.Res.，171376-1373(2000)]，(Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，HiroshiYamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.通过冷冻蛋白和聚乙二醇水混合溶液制备球型蛋白微球，药学研究，2000年，第17期，第1376-1373页)；Morita发现当固体蛋白质颗粒的直径从5微米增大到20微米时，不仅初期的释放速率翻倍，其微囊包封率从80％下降到20％。Cleland讨论了在S-O-W过程前缩小蛋白质微粒体积大小的方法。进一步粉碎蛋白质冻干粉不能得到直径小于10微米的微粒，而把这些粉末研磨成更小的尺寸的方法却受阻于研磨热引起的蛋白质性变。虽然喷雾式干燥法能得到预期大小的蛋白质微粒，但是其间的切力和产生的热量却又会由于有了气体液体界面的介入而引起性变。喷雾干燥法或许可以提供足够小的蛋白颗粒，但是喷嘴附近的高剪切力和液体与空气间的界面张力会使蛋白变性。更不妙的是，喷雾干燥或喷雾式冷冻干燥中须使用表面活性剂，而表面活性剂有促成了蛋白质在下一步制剂程序中与溶剂互相作用。Maa等报道了在喷雾干燥之前预先将重组人类生长激素和锌络合的方法防止蛋白质成分的聚集。不过锌络合会导致生长激素以外的蛋白变性。[Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，andHiroyuki Yoshino.Formation and Isolation of Spherical fine proteinMicroparticles through Lyophilization of protein-poly(ethylene glycol)Aqueous Mixture.Pharm.Res.，171376-1373(2000)]，(Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.通过冷冻蛋白和聚乙二醇水混合溶液制备球型蛋白微球，药学研究，2000年，第17期，第1376-1373页)；Motita等用PEG沉淀蛋白质的方法制备了蛋白超微颗粒。但是，在微囊包过程中这些微粒还是直接处于有机溶剂的作用下。由于蛋白质对于高分子化合物基质的内部表面的吸附作用，未受任何保护的蛋白质和PLGA的直接接触会引起不完全的释放。为了避免亲水-疏水分界面，科学家曾用亲水性双相体系制备高分子化合物微粒。然而，在乳化阶段必须靠共价或离子同步交联作用来固化颗粒，从而使蛋白质暴露在活性反应物中。
专利申请号CN02146543.6，公开号CN1401328，名称流行性脑脊髓膜炎多糖-蛋白结合疫苗，该技术将A群、C群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖通过化学的方法以共价键结合到有效的蛋白载体上，制备出含有两种结合疫苗的联合疫苗制剂，该制剂可供人体免疫接种，用于预防A群、C群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌的感染。不过该技术是针对的是非蛋白亚单位疫苗，而是用蛋白做载体，导致异种蛋白本身的免役原性的问题难于避免，且是通过化学修饰，同样化学修饰导致疫苗本身的性质的变化不得而知。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用多糖玻璃体保护疫苗和抗体活性的方法。并且通过多糖玻璃体保护疫苗制备成纳米或微小颗载体将抗原输送到APC细胞的胞浆里，从而诱导细胞免疫，特别是CTL细胞。或制备成缓释的微球来维持血液中抗原浓度，从而刺激浆细胞长期分泌抗体，诱导体液免疫。局部缓释抗体主要是针对固体肿瘤的血管增生迅速，利用局部注射缓释微球，特异性抑制肿瘤血管增生，使得肿瘤得不到足够得营养而饿死。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明的具体步骤如下①将疫苗或抗体加入多糖溶液；②将所制备的疫苗或抗体-多糖6％或6％以上浓度溶液与相同浓度的聚乙二醇溶液在低于室温高于冰点的温度下混合，或将疫苗或抗体-多糖6％或6％以上浓度溶液与并含有0.2-2％的聚电解质的聚乙二醇溶液在冰点以上的温度混合，或将疫苗或抗体-多糖6％以下浓度溶液与相同浓度聚乙二醇溶液在冰点以上的温度混合；③将所形成的混合溶液或水相-水相乳浊液冷冻干燥；④将所得到的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到载有疫苗或抗体的-多糖玻璃体微粒。
所述的聚乙二醇，其分子量为1,000-30,000；其浓度为0.2％-50％。
所述的聚乙二醇，用于除去PEG连续相的有机溶剂是溶解PEG而不溶解多糖的溶剂。
所述的多糖，其分子量为10,000-2,000,000；其浓度为2％-20％。
所述的多糖，为葡聚糖。
所述的聚电解质为海藻酸钠、羧甲酸纤维素钠带负电荷的聚电解质。
所述的多糖分散相颗粒，含有缓冲物质、盐类和小分子糖类物质。
所述的缓冲物质为Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，盐类为Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖类为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。
所述的疫苗为亚单位疫苗、活病毒疫苗、减活病毒疫苗、死病毒疫苗、核酸疫苗。
所述的亚单位疫苗为甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、禽流感疫苗、戊肝疫苗、艾滋病疫苗、炭疽疫苗、肿瘤疫苗、SARS疫苗、流感疫苗、血吸虫病疫苗，还可以添加免疫佐剂如细胞因子、TAP、无机盐、CpG等起到增强免疫的效果。
所述的活病毒疫苗为麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗、鼠疫疫苗、卡介苗。
所述的亚单位疫苗的重量百分比0.001％-50％，所述的抗体为重量百分比0.001％-50％，所述的多糖重量百分比50-90％。
所述的抗体，为抗血管增生的抗体，病毒抗体、肿瘤抗体和细胞因子抗体或者抗细胞因子的抗体。载在多糖玻璃体中的疫苗和抗体，可以长期保持活性和治疗效果。
缓释微球剂型，载有抗体、疫苗和病毒的多糖微粒分散在可降解高分子微球的基质中；高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成复乳即油包固体—水包油(S/O/W)的方法，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成复乳即油包固体—水油包油(S/O/O)的方法，或者通过喷雾干燥法制备微球，或者添加到各种凝胶中。
所述的高分子为聚醚酰亚胺、聚酯、聚酸酐、聚氨基酯、或骨架非肽键的聚氨基酸，包括聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸及其组合；还包括硅像胶、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明质酸、明胶、胶原蛋白、聚乙交酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纤维蛋白原、纤维蛋白及它们的组合、凝胶包括聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸温敏型水凝胶、糖敏型凝胶和酸敏型凝胶、它们的组合。
所述的温敏型凝胶，其特征为载于疫苗或抗体多糖玻璃体微粒或多糖溶液中的蛋白被选择性地分配在多糖相中处于热力学上更稳定的状态。此外，温敏型凝胶系在升温相变(从液体到胶状)过程中发生脱水收缩引起的突释，而分配在多糖相中的蛋白则可以在相当程度上避免这类突释。所述的多糖玻璃体或者未经乳化冻干的含有疫苗或抗体的多糖溶液可以被直接加入低温下处于液体状态的温敏型凝胶或它们的组合。
所述的缓释疫苗的微球剂型为皮下注射，起到长期缓释有治疗和预防作用的疫苗。
所述的缓释抗体的微球剂型为固体肿瘤周围注射，起到长期缓释，和提高固体肿瘤周围的抗体浓度，起到治疗肿瘤的效果。
所述的APC细胞吞噬的疫苗的微球剂型为0.5μm-10μm的微球，皮下注射或肌肉注射能被APC细胞吞噬，引起细胞免疫或体液免疫，或两者兼有的免疫应答。
所述的疫苗多糖玻璃体可以进一步分散在功能性的高分子溶液，制备成缓释微球、免疫细胞能吞噬的微粒(0.5μm-10μm)、或涂在各种支架的表面涂层、制备成骨架、栓塞剂等。
本发明方法制备的疫苗和抗体多糖玻璃体微粒表面光滑圆整，颗粒规整无粘连，粒径可以根据需要进行调控从0.1μm到10μm。进一步把疫苗和抗体多糖玻璃体分散在控释高分子材料中，根据临床的需要制备不同的剂型，如缓释微球、APC细胞吞噬的0.5μm-10μm的小微球等，可以长期保持活性和治疗效果。制备的载有疫苗或抗体多糖玻璃体微粒可以直接用于吸入剂型，保护结构脆弱的疫苗或抗体；载有疫苗或抗体多糖玻璃体微粒的热敏液-胶体可以直接用于临床皮下注射给药或植入皮下起缓控释疫苗或抗体的效果。载有疫苗或抗体的玻璃体可以通过S/O/W或S/O/O复乳方法制备成缓释微球，粒径在500nm-10,000nm的微球可以诱导细胞免疫或细胞和体液免疫，在20μm-120μm微球可以缓控释疫苗起到以体液免疫为主免疫治疗和预防。多糖相不仅可以在制剂过程中保护疫苗或抗体，还可以用来改善其释放动力学。对于给定疫苗或抗体担载量的微球来说，多糖的用量是一个方便的因素可用来调控疫苗或抗体的释放速率和释放模式。增加多糖的用量，则释放速率提高，不完全释放的问题得到改善，但突释的可能性增大。减小多糖的用量则起到相反的效果。仔细地选择多糖的用量同时结合可降解高分子的分子量及亲水-疏水性能可以达到既控制突释，又避免不完全释放的目的。
具体实施例方式
实施例的基本条件疫苗或抗体—多糖玻璃体的制备和微球的制备或载蛋白质-多糖玻璃体的敏感型凝胶制备。可以根据具体疫苗和抗体的性质，可以选定三种制备疫苗或抗体--多糖玻璃体的方法一种、两种或三种。
实施例11.低温水相-水相乳液法制备疫苗或抗体-多糖玻璃体①制备疫苗疫苗或抗体、PEG和多糖水溶液用超纯水分别制备10％的PEG和10％的多糖水溶液，精确称取10克PEG和10克多糖水分别放在100毫升的烧杯里加水90克，然后把两个烧杯放在加热的磁力搅拌30min，待PEG和10％的多糖全部溶解取下来冷却待用。用电子天平精确称取800毫克疫苗或抗体溶于7.2毫升水中待用。
备疫苗或抗体、PEG和多糖水相-水相乳液在0℃-4℃条件下，将1.的多糖、疫苗或抗体和PEG水溶液按照体积比分别为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋涡30s-60s充分混匀，形成水相-水相乳液；或称取按照多糖和PEG的质量比为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混匀再加水溶解，再按照多糖和疫苗或抗体的重量比为1∶1加入，使之形成形成水相-水相乳液。
冻疫苗或抗体、PEG和多糖水相-水相乳液将制备疫苗或抗体、PEG和多糖形成水相-水相乳液，一些没有分配到多糖相的蛋白质，在降温过程中再分配到多糖分散相中，冷冻过夜。
④完成步骤③的样品在真空冷冻干燥机冻干；⑤完成步骤④的样品用二氯甲烷洗涤三次除去PEG连续相获得载疫苗多糖玻璃体。
得到的疫苗或抗体多糖玻璃体的粒径大都在300nm-5μm，得到这些玻璃体光滑圆整，粒径分布均匀。可以使疫苗或抗体的结构得到好的保护，避免了在剂型制备过程失活。
2.载有疫苗或抗体多糖玻璃体的微球制备称取1g和5g的PVA和NaCl，加超纯水94g，同时加热、搅拌，至PVA完全溶胀，停止加热，继续缓慢搅拌，待溶液呈澄清透明且无气泡后，停止搅拌，放于4℃冰箱待用。该溶液浓度为1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。
精确称取聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)200mg，加二氯甲烷980mg，漩涡振荡，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，浓度为20％(W/W)，现用现配，以防二氯甲烷挥发。
称取疫苗或抗体多糖玻璃体微粒10mg，均匀分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白质-多糖玻璃体微粒均匀分散于PLGA溶液中，将所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化钠的溶液中，以2200rpm的转速匀浆成复乳(S/O/W)，于一分钟内转移到4℃的10％氯化钠水溶液中，搅拌3～4小时后收集陈化的蛋白微球，用超纯水洗涤三次，在冰相预冻过夜，再真空冷冻干燥，制得粒径为50μm-120μm的微球。制备微球还可以用S/O/O复乳法和喷雾干燥法制备的微球，可以用于皮下注射，起到缓释和治疗作用。
实施例21.低温诱导相分离法制备疫苗或抗体-多糖玻璃体①制备疫苗或抗体、PEG和多糖水溶液用超纯水分别制备5％的PEG和5％的多糖水溶液，精确称取5克PEG和5克多糖水分别放在100毫升的烧杯里加水95克，然后把两个烧杯放在加热的磁力搅拌30min，待PEG和5％的多糖全部溶解取下来冷却待用。用电子天平精确称取400毫克蛋白溶于3.6毫升水中待用。
②疫苗或抗体、PEG和多糖均相共水溶液将①的多糖、疫苗或抗体和PEG水溶液按照体积比分别为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋涡30s-60s充分混匀，形成均相溶液；或称取按照多糖和PEG的质量比为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混匀再加水，使之溶解形成均相溶液。
③冷冻疫苗或抗体、PEG和多糖均相共水溶液将制备疫苗或抗体、PEG和多糖均相共水溶液在降温过程中发生相分离，使多糖成为分散相，PEG成为连续相。但是避免速冻条件下冷冻过夜。
④完成步骤③的样品在真空冷冻干燥机冻干；⑤完成步骤④的样品用二氯甲烷洗涤三次除去PEG连续相获得载疫苗或抗体多糖玻璃体。
2.载有疫苗或抗体多糖玻璃体的微球制备称取1g和5g的PVA和NaCl，加超纯水94g，同时加热、搅拌，至PVA完全溶胀，停止加热，继续缓慢搅拌，待溶液呈澄清透明且无气泡后，停止搅拌，放于4℃冰箱待用。该溶液浓度为1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。
精确称取聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)200mg，加二氯甲烷980mg，漩涡振荡，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，浓度为20％(W/W)，现用现配，以防二氯甲烷挥发。
称取疫苗或抗体多糖玻璃体微粒10mg，均匀分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得蛋白质-多糖玻璃体微粒均匀分散于PLGA溶液中，将所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化钠的溶液中，以2200rpm的转速匀浆成复乳(S/O/W)，于一分钟内转移到4℃的10％氯化钠水溶液中，搅拌3～4小时后收集陈化的蛋白微球，用超纯水洗涤三次，在冰相预冻过夜，再真空冷冻干燥，制得粒径为50μm-120μm的微球。
制备微球还可以用S/O/O复乳法和喷雾干燥法制备的微球，可以用于皮下注射，起到缓释和治疗作用。
实施例3稳定的水相-水相乳液法得到的载疫苗或抗体多糖分散相玻璃体的粒径大多数都在300nm-5μm，得到这些玻璃体光滑圆整，粒径分布均匀。可以使疫苗或抗体的结构得到好的保护，避免了在剂型制备过程失活。
称取聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)100mg，使之在漩涡混合器的作用下充分溶解在1ml的乙腈中，然后称取10mg的疫苗或抗体多糖玻璃体加入乙腈的溶液中，并在磁力搅拌下充分分散。在一定量的外油相溶液中加入200ml棉子油的表面活性剂span80，在电力搅拌器以200rpm搅拌下充分混匀。把分散有疫苗或抗体多糖玻璃体的乙腈溶液逐滴加入搅拌中的外油相溶液中，搅拌固化5个小时，抽滤，得到的微球颗粒用50ml石油醚洗三次，减压干燥10个小时，收集微球，在现微镜观察微球的粒径为50μm～120μm的微球，符合皮下注射的要求。
可以缓控释疫苗，起到维持体内的疫苗浓度，从而激发体液免疫，维持体内抗体浓度达到治疗和预防目的。
实施例4载有疫苗或抗体多糖玻璃体温敏型凝胶制备称取疫苗或抗体多糖玻璃体微粒10mg，在4℃均匀分散于0.5g的PLGA-PEG-PLGA的水溶液中，PLGA-PEG-PLGA的浓度为20％(W/W)，磁力搅拌15分钟，转速1800rpm，充分搅拌使得疫苗或抗体多糖玻璃体微粒均匀分散于PLGA-PEG-PLGA溶液中，将所得均匀分散于PLGA-PEG-PLGA的混悬液加热到37℃固化，做体外释放。而临床应用则现配现用。
实施例5模型疫苗BSA缓控释剂的制备和体外释放行为可以在保持疫苗成分或抗体的自然构像的温和条件下将其制成多糖玻璃体微粒。这种微粒具有对有机溶剂、温度等条件的耐受性，可以进一步将得到保护的疫苗颗粒制成诸如高分子缓释微球等各种维持体内的疫苗浓度、提高抗体的滴度，或者通过交叉抗原提呈刺激细胞免疫。
一、溶液配置1.BSA溶液制备称取肌红蛋白20.7mg，加入超纯水2ml中涡选溶解，得到肌红蛋白溶液浓度约10mg/ml。
2.葡聚糖溶液制备称取葡聚糖1.0g，加超纯水至10.00g，加热搅拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比约10％。
3.PEG溶液制备称取葡聚糖1.0g，加超纯水至10.00g，加热搅拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比约10％。
二、模型疫苗BSA-葡聚糖微粒制备1.BSA葡聚糖微粒制备分别称取肌红蛋白溶液、葡聚糖溶液和PEG溶液0.50g、0.16g和1.00g(注两份)，在0℃的条件下，采用匀浆器E档(22，000rpm)匀浆3×5s。上述乳液在-20℃放过夜，再冷冻干燥24h。干燥物置于二氯甲烷5ml中，12,000rpm离心5min，倾去上层清夜，重复二氯甲烷洗涤过程三次。将最后得到的肌红蛋白葡聚糖微粒保存在1ml二氯甲烷中。
2.空白对照葡聚糖微粒制备分别称取葡聚糖溶液和PEG溶液0.15g和1.00g，按上面制备方法同法制备。
(注将上述两种微粒在PCS测定其粒径分布和大小及扫描电镜观察形态呈球形，微粒大多数粒径在1～2um左右。)三、模型疫苗BSA缓释制剂的制备1∶5膜控释制剂制备称取PLGA(75/253A)15.1mg、二氯甲烷1ml，涡选溶解。加入700ul摇匀的BSA葡聚糖微粒混悬液，涡旋使分散均匀。通过S/O/W方法制备成PLGA微球。我们可以清楚的看到球中有分散均匀的BSA葡聚糖微粒。
四、释放液测定释放液样品采用micro-BCA试剂盒测定。以BSA标准蛋白制备标准曲线。BSA-葡聚糖PLGA微球释放液吸收值减除同法制备的空白微球释放液吸收值进行校正，带入上述标准曲线中计算释放液BSA浓度。依次绘制不同葡聚糖/PLGA比例涂层中BSA的释放曲线。我们可以看出其释放行为良好，无明显突释行为。
实施例6模型抗体β-半糖乳糖苷酶蛋白缓控释剂的制备和体外释放行为目前国际上已经有500种抗体用于诊断和治疗，FDA已经批准20个抗体上市，其中8种用于肿瘤治疗的靶向抗体。如针对血管表皮生长因子[VEGF]的抗体Avastin，使晚期结肠癌患者生存期平均延长五个月，但是治疗费用及其昂贵。由于抗体的分子量较大，结构复杂，通常四级结构，在体内恶劣的环境下，构像更易发生变化，比化学药更容易失活。因此需要一个的输送完整结构抗体的体系，直接送到肿瘤细胞的血管周围，抑制肿瘤细胞的血管生长。或其它杀伤肿瘤细胞的抗体，起到局部缓释抗体，提高局部血药浓度，减少药的用量和毒性，节约治疗成本。故我们选择了一个与抗体分子量大小相当，也具有空间四级结构的模型蛋白β-半糖乳糖苷酶蛋白来说明此体系对抗体的保护作用。
一、模型β-半糖乳糖苷酶蛋白-葡聚糖微粒制备按照实例5制备二、模型疫苗BSA-葡聚糖微粒制备和微球制备按照事例5制备三、释放试验按照实例5进行释放液测定；四、本发明方法对β-半糖乳糖苷酶蛋白的保护作用为了验证本发明对生物活性物质有较好的保护作用，设计如下实验有机溶液存在条件下葡聚糖微粒对结构易变的蛋白大分子的保护作用，把β-半糖乳糖苷酶(一个具有四级结构、分子量为500KD的酶)载进葡聚糖微粒进行了测试。先将蛋白质以0.67mg/mlβ-半糖乳糖苷酶溶于葡聚糖溶液，按照1∶20的比例，然后将其加入实例1所描述的PEG溶液中乳化。冷冻干燥后，用二氯甲烷反复洗涤几遍除去PEG。接下来的步骤中，将所回收的载着蛋白质的葡聚糖微粒在缓冲液中重新溶解，加入o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)，测试对底物-ONPG的水解催化活性。酶的催化作用在经历了从实例5到实例6所描述的操作过程(包括乳化、冷冻干燥以及二氯甲烷洗涤)后，只是下降了不到10％。此10％的活性下降还包括了由于在乳化过程中被分配在PEG相的部分蛋白以及冷冻干燥过程中损失的蛋白活性。也就是说，在与微囊包过程所用的有机溶液—二氯甲烷的接触中，葡聚糖微粒有效地保存了蛋白酶的活性。
实施例7被抗原提呈细胞(APC)吞噬的微粒疫苗制备当微粒的粒径在500nm-10,000nm容易被APC细胞吞噬，一些抗原可以通过不同的途径从内吞体逃逸到细胞浆。这一途径又称吞噬体-胞质溶胶(phagosome-cytosol)方式；或MHCI类分子经内质网和高尔基体直接进入内体与外源性抗原结合，并将其提呈到细胞表面；在溶酶体中外源性抗原肽经胞吐作用被释放到胞外，与细胞表面的MHCI类分子结合。基于上述非经典外源性抗原MHCI类分子提呈原理，设计了保证疫苗的完整结构，并且应用可以帮助疫苗从内吞体逃逸出来的高分子材料(PEI)，来保证有更多的疫苗从内吞体到细胞浆，从而有更多的机会刺激细胞免疫。
一、溶液配置1.戊肝疫苗溶液制备称取戊肝疫苗4.05mg，加入超纯水1ml中涡选溶解，得到戊肝疫苗溶液浓度约4.05mg mg/ml。
2.葡聚糖溶液制备称取葡聚糖1.0g，加超纯水至10.00g，加热搅拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比约10％。
3.PEG溶液制备称取葡聚糖1.0g，加超纯水至10.00g，加热搅拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比约10％。
二、模型疫苗戊肝疫苗-葡聚糖纳米粒制备1.戊肝疫苗葡聚糖微粒制备分别称取戊肝疫苗溶液、葡聚糖溶液和PEG溶液0.05g、0.02g和8.00g(注两份)，另一分添加小分子1mg的PEI在多糖相在0℃的条件下，采用匀浆器E档(22,000rpm)匀浆3×5s。上述乳液在-20℃放过夜，再冷冻干燥24h。干燥物置于二氯甲烷5ml中，12,000rpm离心5min，倾去上层清夜，重复二氯甲烷洗涤过程三次。将最后得到的戊肝疫苗葡聚糖微粒保存在1ml二氯甲烷中。
2.空白对照葡聚糖微粒制备分别一份称取葡聚糖溶液和PEG溶液0.02g和8.00g，和另一份0.02g葡聚糖溶液和加4mg的PEI及PEG溶液和8.00g，按上面制备方法同法制备。
三、模型疫苗戊肝疫苗-葡聚糖纳米粒的PLGA微球的制备1.称取疫苗戊肝疫苗-葡聚糖纳米粒10mg，50mg PLGA50/50(平均分子量6,500)溶于1ml乙腈，含0.5％(w/v)司盘的棉子油8ml，将两液体混合，10krpm匀浆30-60秒，显微镜下观察小于10um(S/O/O法制备)，将此乳液滴入100ml棉子油萃取挥发4小时，最后加入100ml石油醚洗涤15min。最后过滤挥干。
四、戊肝疫苗-葡聚糖纳米粒的PLGA微球的制备过程的免疫活性的回收分别称取2mg的戊肝疫苗-葡聚糖纳米粒，和2mg PLGA微球，其中微球用4ml二氯甲烷洗涤4次，用1200转/min离心，去上清液。最后挥干重新溶解在磷酸缓冲液，再用厦门大学提供的试剂合(ELISIA)测定。其回收的免疫活性，我们发现除掉物理损失，活性几乎全部保持。可以预防戊肝。
权利要求
1.一种载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征在于，具体步骤如下①将疫苗或抗体加入多糖溶液；②将所制备的疫苗或抗体-多糖6％或6％以上浓度溶液与相同浓度的聚乙二醇溶液在低于室温高于冰点的温度下混合，或将疫苗或抗体-多糖6％或6％以上浓度溶液与并含有0.2-2％的聚电解质的聚乙二醇溶液在冰点以上的温度混合，或将疫苗或抗体-多糖6％以下浓度溶液与相同浓度聚乙二醇溶液在冰点以上的温度混合；③将所形成的混合溶液或水相-水相乳浊液冷冻干燥；④将所得到的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到载有疫苗或抗体的-多糖玻璃体微粒。
2.根据权利要求1所述的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的聚乙二醇，其分子量为1,000-30,000；其浓度为0.2％-50％之间。
3.根据权利要求1所述的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的多糖，其分子量为10,000-2,000,000；其浓度为2％-20％。
4.根据权利要求1所述的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的聚电解质为海藻酸钠、羧甲酸纤维素钠带负电荷的聚电解质。
5.根据权利要求1所述的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是所述的多糖分散相颗粒，含有缓冲物质、盐类和小分子糖类物质。
6.根据权利要求5所述的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的缓冲物质为Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，盐类为Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖类为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。
7.根据权利要求1所述的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的疫苗为亚单位疫苗、活病毒疫苗、减活病毒疫苗、死病毒疫苗、核酸疫苗。
8.根据权利要求7所述的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的亚单位疫苗为甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、禽流感疫苗、戊肝疫苗、艾滋病疫苗、炭疽疫苗、肿瘤疫苗、SARS疫苗、流感疫苗、血吸虫病疫苗；所述的活病毒疫苗为麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗、鼠疫疫苗、卡介苗。
9.根据权利要求1或者7或者8所述的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的抗体为重量百分比0.001％-50％，所述的多糖重量百分比50-90％，所述的亚单位疫苗的重量百分比0.001％-50％。
10.根据权利要求1所述的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的抗体，为抗血管增生的抗体，病毒抗体、肿瘤抗体和细胞因子抗体或者抗细胞因子的抗体。
全文摘要
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的载有活性疫苗或抗体的多糖玻璃体微粒的制备方法。具体步骤如下①将疫苗或抗体加入多糖溶液；②将所制备的疫苗或抗体－多糖在冰点以上的温度混合；③将所形成的混合溶液或水相－水相乳浊液冷冻干燥；④将所得到的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到载有疫苗或抗体的－多糖玻璃体微粒。本发明制备的疫苗和抗体多糖玻璃体微粒表面光滑圆整，颗粒规整无粘连，粒径可以根据需要进行调控从0.1μm到10μm。可以长期保持活性和治疗效果。
文档编号A61K39/12GK1887275SQ200610029129
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者金拓, 袁伟恩, 吴飞 申请人:上海交通大学