专利名称：制备多糖玻璃体微粒的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的制备方法。特别是一种制备多糖玻璃体微粒的方法。
背景技术：
基因重组技术用于治疗蛋白的表达和生产的20多年以来，到目前为止，已有30多个蛋白药物产品投入临床使用，近200个在审批和研发过程中，涌现出一批诸如安进(Amgen)、基因技术(Genentech)等一批新的大型医药公司。相对于蛋白大分子药物本身的快速发展，其剂型技术进展缓慢。一方面，蛋白大分子药物口服不吸收、体内半衰期短，需要注射给药；另一方面，许多何尔蒙、细胞因子类的蛋白药物药物治疗周期长，长期而频繁地注射成为必须，也影响患者顺应性的主要原因。缓释蛋白药物的剂型的研发，由于在制备微粒过程导致活性的损失诸如W/O/W法等。发展制备具有活性保护的蛋白微粒势在必行。而葡聚糖和PEG是常用来蛋白药物的冻干保护剂和分离纯化蛋白的试剂。Hennink利用修饰的葡聚糖制备蛋白缓释微球的报道，但是作者用到强氧化剂如过硫酸钾、过硫酸铵等，及聚合物引发剂使葡聚糖分子发生交联，这些难免不与蛋白发生反应，导致蛋白的失活或增加免疫原性。到目前还未见在水性环境下，不用交联剂或固化剂制备聚合物的微粒方法报道。
经对现有技术文献的检索发现，经对现有技术文献的检索发现[Hennink.W.E.and Franssen.O.PROCESS FOR THE PREPARATION OF A CONTROLLED RELEASESYSTEM.Publication No.WO/1998/022093 International Application NoPCT/NL1997/000625]，(Hennink.W.E.and Franssen.O.一种控释系统的制备方法，公开号.WO/1998/022093.国际申请号PCT/NL1997/000625)，该专利报道了水相-水相两相系统制备多糖颗粒。不过它们使用了可以交联的多糖，而着些交联基团是通过化学修饰得到。这样不仅会改变多糖的本身的性质，有可能增加多糖的免疫原性，同时这些交联基团也可能与蛋白质和多肽发生交联，因为交联基团并没有特殊的选择性。我们避免了使用交联来使不稳定的水相-水相乳液制备多糖玻璃体。
现有技术中的专利[CHEN，Li；ZHU，Hua；JIN，Tuo THE PREPARATIONMETHOD OF A STABLE POLYMER AQUEOUS PHASE-AQUEOUS PHASE EMULSION AND ITSUSE，Publication Number InternationalWO/2002/000778 Application No.PCT/CN2001/001033](陈励；朱华；金拓稳定的高分子水相-水相乳液的制备及其应用公开号为，WO/2002/000778国际申请号PCT/CN2001/001033)，该专利揭示一种新型的稳定的乳液(高分子水相-水相乳液)及其制备方法和在制药及生物技术中的应用。该乳液与常规乳液的根本区别在于其分散相和连续相均为水溶液。即通过将高分子电解质引入高分子亲水两项体系(aqueous two-phase system)产生扩散双电层，从而开发了一个独特的材料体系稳定的不需连续搅拌或者(对分散相的)即时固化高分子水相-水相乳剂。将这一体系用于蛋白大分子药物缓释微球剂型的制备，获得了理想的结果。然而，有些蛋白分子可能与高分子电解质发生相互作用，造成聚集。
发明的内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种制备多糖玻璃体微粒的方法。使其制备的微粒表面光滑圆整，均匀度好，颗粒规无粘连，在完全无有机溶剂、不加任何交联剂、聚合物引发剂及表面活性剂尤其是高分子电解质类表面活性剂，以避免这些对药物的治疗的作用影响。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明在-2℃-4℃的条件，两种或两种以上的互不形容的水溶性聚合物，在外界条件下如匀质化、Voterx、超声机械搅拌等作用下形成乳液，然后冻干并除去连续散相得到多糖玻璃体微粒。不需使用有机相(或称油相)乳化，不需使用交联剂、固化剂、表面活性剂，不存在水-油、水-气等强界面张力的界面。
本发明具体包括以下步骤
①将聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)或聚吡咯烷酮(PVP)等和多糖溶于水中配成溶液，在低温的条件下，按照大于1∶1(W/W)的比例混和，在外力的作用下，形成乳液；②将生物活性物质加入其中，或与多糖、聚乙二醇一并加入，或不加药物；③将完成步骤②的乳剂冷冻；④将完成步骤③的样品冻干；⑤将完成步骤④的样品用溶剂洗涤除去PEG、PEO或PVP连续相获得多糖分散相颗粒。
所述的PEG、PEO或PVP，其分子量为1,000-30,000。
所述的PEG、PEO或PVP，其浓度为0.2％-50％之间。
所述的多糖，其分子量为50,000-500,000。
所述的多糖，其浓度为2％-20％。
所述的多糖，为葡聚糖或者葡聚糖、淀粉、纤维素及其衍生物、琼脂糖和水溶性高分子多糖。
所述的PEG、PEO或PVP，用于除去PEG、PEO或PVP，连续相的有机溶剂是溶解PEG而不溶解多糖的溶剂。
所述的多糖分散相颗粒，含有缓冲物质、盐类和小分子糖类物质。
所述的缓冲物质为Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，盐类为Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4中的一种；小分子糖类为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇中的一种。
所述的多糖分散相颗粒，可以用来微囊化结构脆弱的治疗物质--诸如蛋白质、多肽、基因物质、抗体、疫苗、病毒和脂质体等可被担载于多糖微粒之中；所述的多糖分散相颗粒，可以用于其所担载的治疗物质的缓释微球剂型和吸入剂型；所述的缓释微球剂型，载有治疗物质的多糖微粒分散在可降解高分子微球的基质中；通过将多糖微粒分散在可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成复乳即油包固体—水包油(S/O/W)的方法，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成复乳即油包固体—油包油(S/O/O)的方法。
所述的吸入剂型，为载有治疗物质的多糖本身，其粒径为1μm-5μm。
一、空白多糖玻璃体制备1.制备PEG和多糖水溶液用超纯水分别制备10％的PEG和10％的多糖水溶液，精确称取10克PEG和10克多糖水分别放在100毫升的烧杯里加水90克，然后把两个烧杯放在加热的磁力搅拌30min，待PEG和多糖全部溶解取下来冷却待用。
2.制备PEG和多糖低温水相-水相乳液在0℃-4℃的条件下，将1.的多糖和PEG水溶液按照体积比分别为1∶5、1∶10、1∶20、1∶40在西林瓶旋涡30s-60s充分混匀，形成水相-水相乳液；或称取按照多糖和PEG的质量比为1∶5、1∶10、1∶20、1∶40在西林瓶先混匀再加水，使之溶解形成水相-水相乳液。
3.冷冻制备PEG和多糖低温水相-水相乳液将制备PEG和多糖低温水相-水相乳液在冰箱冷冻过夜，也可以速冻不会影响玻璃体的大小。
4.将完成步骤3的样品在真空冷冻干燥机冻干；5.将完成步骤4的样品用二氯甲烷洗涤三次除去PEG连续相获得多糖分散相颗粒。
二、载药多糖玻璃体制备1.制备PEG和多糖水溶液均按照空白多糖玻璃体制备方法。
2.在0℃-4℃的条件下，把药物和多糖溶液混合均匀，或把药物和PEG和多糖水溶液一起混合制备载药的PEG和多糖低温水相-水相乳液。
3.冷冻多糖、药物和PEG低温水相-水相乳液4.将制备多糖、药物和PEG低温水相-水相乳液冷冻过夜。
5.然后按照制备空白多糖玻璃体4和5进行的方法得到载药多糖玻璃体。
本发明制备的载药多糖玻璃体可以直接用于吸入剂型，保护结构脆弱的生物试剂如蛋白质和多肽等药物；通过将多糖微粒分散在可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成复乳即油包固体—水包油(S/O/W)的方法，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成复乳即油包固体—油包油(S/O/O)的方法。
本发明完全避免了使用有机溶剂、高剪切力、界面、和交联剂等，在温和的条件下把生物活性物质，如蛋白质、多肽、疫苗、DNA、RNA、病毒和脂质体载入多糖玻璃体，能够长期保持活性。大大的减少保存的费用和提高疗效。同时制备的多糖玻璃体的粒径小，活性高，因此在制备成其它剂型如缓释微球，可以减少突释和不完全释放。
具体实施例方式
实施例一空白多糖玻璃体制备1.在0℃-4℃条件下，配制成10％的Dex70,000和10％的PEG8,000溶液；按照取0.500gDex70,000；2.500gPEG8,000，即1∶5(w/w)旋涡30s-60s充分混匀形成水相-水相乳液，在-26℃冰箱预冻一晚，再在真空干燥24小时，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋涡5min，在12000RPM离心5min，去上清液，来回三次，在真空干燥挥尽二氯甲烷，收集微粒，取少量的在显微镜下观察，或把它混悬在二氯甲烷中用PCS粒度散射仪测定其粒径。粒径在2μm-10μm，平均粒径为5.7μm。
2.在0℃-4℃条件下，配制成10％的Dex70,000和10％的PEG8,000溶液；按照取0.250gDex70,000；2.500gPEG8,000，即1∶10(w/w)，旋涡30s-60s充分混匀形成水相-水相乳液，在-26℃冰箱预冻一晚，再在真空干燥24小时，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋涡5min，在12000RPM离心5min，去上清液，来回三次，在真空干燥挥尽二氯甲烷，收集微粒，取少量的在显微镜下观察，或把它混悬在二氯甲烷中用PCS粒度散射仪测定其粒径。粒径在1μm-5μm，平均粒径为2.652μm。
3.在0℃～4℃条件下，配制成10％的Dex70,000和10％的PEG8,000溶液；按照取0.125gDex70,000；2.500gPEG8,000，即1∶20(w/w)，旋涡30s-60s充分混匀形成水相-水相乳液，在-26℃冰箱预冻一晚，再在真空干燥24小时，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋涡5min，在12000RPM离心5min，去上清液，来回三次，在真空干燥挥尽二氯甲烷，收集微粒，取少量的在显微镜下观察，或把它混悬在二氯甲烷中用PCS粒度散射仪测定其粒径。粒径在0.5μm-5μm，平均粒径为1.562μm。
4.在0℃-4℃条件下，配制成8％的Dex70,000和8％的PEG8,000溶液；按照取0.080g Dex70,000；3.200g PEG8,000，即1∶40(w/w)，旋涡30s-60s充分混匀形成水相-水相乳液，在-26℃冰箱预冻一晚，再在真空干燥24小时，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋涡5min，在12000RPM离心5min，去上清液，来回三次，在真空干燥挥尽二氯甲烷，收集微粒，取少量的在显微镜下观察，或把它混悬在二氯甲烷中用PCS粒度散射仪测定其粒径。粒径在0.3μm-5μm，平均粒径为309nm。
实施例二制备载牛血清白蛋白多糖玻璃体1.制备牛血清白蛋白、PEG和多糖水溶液用超纯水分别制备10％的PEG和10％的多糖水溶液，精确称取10克PEG和10克多糖水分别放在100毫升的烧杯里加水90克，然后把两个烧杯放在加热的磁力搅拌30min，待PEG和10％的多糖全部溶解取下来冷却待用。用电子天平精确称取800毫克牛血清白蛋白溶于7.2毫升水中待用。
2.牛血清白蛋白、PEG和多糖水相-水相乳液在0℃-4℃条件下，将1.的多糖、牛血清白蛋白和PEG水溶液按照体积比分别为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋涡30s-60s充分混匀，形成水相-水相乳液；或称取按照多糖和PEG的质量比为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混匀再加水溶解，再按照多糖和牛血清白蛋白的重量比为1∶1加入，使之形成形成水相-水相乳液。
3.冻牛血清白蛋白、PEG和多糖水相-水相乳液将制备牛血清白蛋白、PEG和多糖形成水相-水相乳液，一些没有分配到多糖相的蛋白质，在降温过程中再分配到多糖分散相中，冷冻过夜。
4.完成步骤3的样品在真空冷冻干燥机冻干；5.完成步骤4的样品用二氯甲烷洗涤三次除去PEG连续相获得载牛血清白蛋白多糖玻璃体。
得到的载牛血清白蛋白多糖分散相玻璃体的粒径大都在300nm-5μm，得到这些玻璃体光滑圆整，粒径分布均匀。可以使牛血清白蛋白的结构得到好的保护，避免了在剂型制备过程失活。
权利要求
1.一种制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征在于，包括以下步骤①将聚乙二醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮和多糖溶于水中配成溶液，在低温的条件下，按照重量大于1∶1的比例混和，在外力的作用下，形成乳液；②将生物活性物质加入其中，或与多糖、聚乙二醇一并加入；③将完成步骤②的乳剂冷冻；④将完成步骤③的样品冻干；⑤将完成步骤④的样品用溶剂洗涤除去PEG、PEO或PVP连续相获得多糖分散相颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征是，所述的聚乙二醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮，其分子量为1,000-30,000。
3.根据权利要求1或者2所述的制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征是，所述的聚乙二醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮，其浓度为0.2％-50％。
4.根据权利要求1所述的制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征是，所述的多糖，其分子量为50,000-500,000。
5.根据权利要求1或者2所述的制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征是，所述的多糖，其浓度为2％-20％。
6.根据权利要求1或者2所述的制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征是，所述的多糖，为葡聚糖或者葡聚糖、淀粉、纤维素及其衍生物、琼脂糖和水溶性高分子多糖。
7.根据权利要求1或者2所述的制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征是，所述的多糖，其分散相颗粒，含有缓冲物质、盐类和小分子糖类物质。
8.根据权利要求1或者2所述的制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征是，所述的缓冲物质为Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，盐类为Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4中的一种；小分子糖类为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇中的一种。
全文摘要
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的制备多糖玻璃体微粒的方法。本发明包括以下步骤①将聚乙二醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮和多糖溶于水中配成溶液，在低温的条件下，按照重量大于1∶1的比例混和，在外力的作用下，形成乳液；②将生物活性物质加入其中，或与多糖、聚乙二醇一并加入；③将完成步骤②的乳剂冷冻；④将完成步骤③的样品冻干；⑤将完成步骤④的样品用溶剂洗涤除去PEG、PEO或PVP连续相获得多糖分散相颗粒。本发明完全避免了使用有机溶剂、高剪切力、界面、和交联剂等，在温和的条件下长期保持生物活性物质活性。大大的减少保存的费用和提高疗效。同时制备的多糖玻璃体的粒径小，活性高，因此在制备成其它剂型如缓释微球，可以减少突释和不完全释放。
文档编号A61K47/36GK1887273SQ20061002912
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者袁伟恩, 金拓, 吴飞 申请人:上海交通大学