一种抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法
【专利摘要】本发明公开一种抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒，该试剂盒包括：抗组蛋白抗体IgG校准品；抗组蛋白抗体IgG质控品；含生物素标记的组蛋白抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；含碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；清洗液。该试剂盒的检测方法在传统的膜条免疫法和酶联免疫吸附法的基础上，将灵敏度和线性范围再提高3?5个数量级，实现真正意义的定量检测，反应迅速，结果可靠，并能配合全自动化学发光免疫分析仪实现全自动使用，对于临床诊断具有无可替代的重要价值。
【专利说明】
-种抗组蛋白抗体I gG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及 制备和检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物检测技术领域，尤其设及一种抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发 光定量测定试剂盒及制备和检测方法。
【背景技术】
[0002] 组蛋白是一种碱性核蛋白，由5个亚单位化1、H2A、肥B、册、H4)组成。抗组蛋白抗体 可W在多种结缔组织病中出现，不具有诊断特异性，但在系统性红斑狼疮和药物性红斑狼 疮病人中阳性率较高。
[0003] 抗组蛋白抗体与各种自身免疫性疾病相关，在全身性红斑狼疮(SLE)患者，抗组蛋 白抗体检出率为30%-70%，在无并发症的类风湿性关节炎患者阳性率15%-50%，青年型 类风湿性关节炎患者阳性率为60%，药物性狼疮患者抗组蛋白的检出率很高(>95 % )。运些 SLE病人临床上伴有肾炎者多见。
[0004] 系统性红斑狼疮(SLE)是一种系统性的自身免疫病。其发病机理与自身免疫有关， 血清学的特点是具有多种自身抗体。本病可发生在任何年龄，最多见为育龄妇女，临床表现 大多发病急缓不一，可为发热、皮疹、秀头、胸膜炎、屯、包炎、肾炎、溶血性贫血、白细胞减少、 血小板减少和中枢神经系统(CNS)受累等，因此常被误诊或漏诊。当今免疫学的飞速发展也 极大地促进了临床医学的发展尤其是风湿病学的发展。随着免疫学的发展，自身抗体的检 测已成为诊断SLE的重要手段。
[0005] 目前临床上抗组蛋白抗体IgG的检测有膜条免疫法和酶联免疫吸附法。膜条免疫 法应用的是膜条显色技术，其特点为固定几个项目在同一膜条测定，一般通过手工或者半 自动膜条仪进行实验操作，最终通过肉眼进行定性判定，该技术灵敏度低，反应时间长，检 测项目只能固定搭配组合，灵活性差。酶联免疫吸附法的灵敏度在膜条免疫法基础上有所 提升，但仍然较低，并且线性范围窄，重复性差，反应时间长，仍然不能很好满足临床的应 用。
[0006] 目前，使用磁微粒化学发光分析法在抗组蛋白抗体IgG免疫分析产品的应用仍未 见。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试 剂盒，本发明提供的试剂盒将化学发光分析技术与磁微粒分离技术相结合，采用生物素和 碱性憐酸酶(ALP)分别标记抗原和抗体，W直径1-3皿的包被链霉亲和素的超顺磁微粒作为 分离试剂。ALP催化底物发光后，通过仪器测量发光强度计算出待测物浓度。该检测方法在 传统的膜条免疫法和酶联免疫吸附法的基础上，将灵敏度和线性范围再提高3-5个数量级， 实现真正意义的定量检测，反应迅速，结果可靠，并能配合全自动化学发光免疫分析仪实现 全自动使用，对于临床诊断具有无可替代的重要价值。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种上述试剂盒的制备方法及使用上述试剂盒的 检测方法。
[0009] 为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0010] -种抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量现憶试剂盒，所述试剂盒包括：
[0011] (1)抗组蛋白抗体IgG校准品，含抗组蛋白抗体IgG和牛血清白蛋白的化iS缓冲液， 所述抗组蛋白抗体IgG校准品包含6个水平的液体校准品，所述6个水平的液体校准品中抗 组蛋白抗体IgG的浓度分别为0，5，20，50，100，200RU/mL
[0012] (2)抗组蛋白抗体IgG质控品，含抗组蛋白抗体IgG和牛血清白蛋白的IYis缓冲液， 所述抗组蛋白抗体IgG质控品包含2个水平的液体质控品，所述2个水平的液体质控品中抗 组蛋白抗体IgG的祀值浓度范围分别为(20±4)RU/mL和（100±20)RU/mL
[0013] (3)试剂1号，含生物素标记的组蛋白抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
[0014] (4)试剂2号，含碱性憐酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛血清白蛋白的化i S缓冲 液；
[0015] (5)磁分离试剂，含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
[0016] (6)清洗液；
[0017] 所述试剂盒中试剂1号，试剂2号和磁分离试剂的含量比为1:3:1，所述含量比为体 积比。
[0018] 进一步的，所述磁微粒的材质为化2〇3;所述磁微粒表面包被有簇基基团，包被物中 簇基基团含量大于20wt%，所述磁微粒的大小为
[0019] -种制备所述抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒的方法，该方 法包括如下步骤：
[0020] (1)配制抗组蛋白抗体IgG校准品：
[0021] 步骤1)配制抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液：
[0022] 将纯化水、Tris、氯化钢和Proclin300加入容器中，充分揽拌至完全溶解，Tris浓 度为Iwt%，氯化钢浓度为Iwt%，Proclin300浓度为0.2V% ;用4M的肥L将溶液的pH值调为 7.0-7.5 ;将牛血清白蛋白加入容器中，充分揽拌至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为 4wt % ;再用4M的肥L将溶液的抑值调为7.0-7.5;用孔径为0.2WI1的滤器过滤，得抗组蛋白抗 体IgG校准品稀释液，2-8°C保存待用；
[0023] 步骤2)配制抗组蛋白抗体IgG校准品：
[0024] 将抗组蛋白抗体IgG用抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点为0,5,20， 50，100,200抓/ml^;
[0025] (2)配制抗组蛋白抗体IgG质控品：
[00%]将抗组蛋白抗体IgG用上述抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点为20，
[0027] (3)配制试剂1号：
[0028] 步骤1)配制试剂1号稀释液：
[00巧]将纯化水、Tris、氯化钢和Proclin300加入容器中，充分揽拌至完全溶解，Tris的 浓度为Iwt %，氯化钢浓度为0.5wt %，Proclin300的浓度为0.2v% ;将牛血清白蛋白加入容 器中，充分揽拌至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为0.5wt % ;用4M的肥L将溶液的抑值调为 7.0-7.5;用孔径为0.2皿的滤器过滤，得试剂I号稀释液，2-8°C保存待用；
[0030] 步骤2)配制试剂1号：
[0031] 将组蛋白抗原用纯化水溶解，2-8°C条件下用浓度为0.2M，pH为9.0的碳酸盐缓冲 液透析化，然后浓缩至浓度为2-4mg/mL的抗原溶液，用浓度为0.2M，抑为8.5-9的碳酸盐缓 冲液配制浓度为0.5-1.Omg/ml的生物素溶液;按照组蛋白抗原与生物素质量比为10:1的比 例在组蛋白抗原溶液中加入生物素溶液，混合均匀，室溫静置12-1化，反应生成组蛋白抗 原-生物素连接物；将含有组蛋白抗原-生物素连接物的反应液在2-8°C条件下用浓度为 0.2M，pH为9.0的碳酸盐缓冲液透析2天，期间进行4次换液，从而除去未反应的生物素，得到 含有组蛋白抗原-生物素连接物的溶液；用试剂1号稀释液将含有组蛋白抗原-生物素连接 物的溶液稀释到0.1-0.化g/mL，制得试剂1号；
[0032] 本步骤配制的试剂1号可降低实验成本，而且能有效分离游离生物素和组蛋白抗 原-生物素连接物，得到的组蛋白抗原-生物素连接物较纯，减少了后续的非特异性反应；
[0033] (4)配制试剂2号：
[0034] 步骤1)配制试剂2号稀释液：
[00巧]将纯化水、4-径乙基赃嗦乙横酸、氯化钢、牛血清白蛋白、ZnCb和Proclin300加入 容器中，充分揽拌至完全溶解，4-径乙基赃嗦乙横酸的浓度为0.6wt %，氯化钢浓度为 0.8讯1%，牛血清白蛋白的浓度为0.5讯1%，211(：12的浓度为0.1讯1%〇，口'〇(31111300的浓度为 0.2v%。,MgCb的浓度为0.1%。；用4M的肥L将溶液的抑值调为7.5-8.0;用孔径为0.2皿的滤 器过滤，得试剂2号稀释液，2-8°C保存待用；
[0036] 步骤2)配制试剂2号：
[0037] 将Img羊抗人多克隆抗体加入到2-化L浓度为lOmg/mL的2-亚氨基硫烧盐酸盐溶液 中，室溫静置20min，再加入0 . ImoL/L的甘氨酸溶液10化，室溫静置5min，用G-25凝胶柱除 盐，收集活化后的羊抗人多克隆抗体，2-8°C保存备用;将1.5mg的碱性憐酸酶加入到10-2化 L的浓度为5mg/血的4-(N-马来酷亚胺基甲基)环己烧-1-簇酸班巧酷亚胺醋溶液中，室溫静 置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的碱性憐酸酶，2-8°C保存备用；将活化的羊抗人 多克隆抗体与活化的碱性憐酸酶混合，2-8°C条件下静置12-2地，用Supperdex200凝胶纯化 柱纯化偶联物，获得羊抗人多克隆抗体-碱性憐酸酶连接物浓溶液，2-8°C保存备用;将羊抗 人多克隆抗体-碱性憐酸酶连接物浓溶液用试剂2号稀释液稀释到0.02-0.化g/mL，即得试 剂2号；
[0038] (5)配制磁分离试剂：
[0039] 步骤1)配制磁微粒缓冲液：
[0040] 将纯化水、Tris和氯化钢加入容器中，充分揽拌至完全溶解，Tris的浓度为Iwt%， 氯化钢的浓度为0.8wt % ;再将牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中，充分 揽拌至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为〇.5wt%，新生牛血清浓度为5v%，Proclin300浓 度为0.2v%。；用4M的肥L将溶液的pH值调为7.9-8.1;用孔径为0.2皿的滤器过滤，得磁微粒 缓冲液，2-8°C保存待用；
[0041 ]步骤2)配制磁分离试剂：
[0042]取IOOmg磁微粒，使用磁力架吸附，静止2min后吸去上清，向磁微粒中加入浓度为 0.025mol/L，pH为4.5-5的2-(N-吗啡嘟）乙横酸缓冲液10mL，充分混匀;再加入0.5-l血新配 审揃浓度均为lOmg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-径基班巧酷亚胺水溶 液，室溫混匀30-60min，得磁珠混悬体系;使用2-(N-吗啡嘟）乙横酸缓冲液配制浓度为5mg/ mL的链霉亲和素溶液，然后向磁珠混悬体系中直接加入4-8mg的链霉亲和素，4°C条件下混 悬16-2化;再使用磁力架吸附，静止2min后吸去上清，向磁微粒中加入IOmL浓度为lM，pH为 8.5的乙醇胺溶液，室溫反应1-化，再使用磁力架吸附，静止2min后吸去上清，向磁微粒中加 入适量磁微粒缓冲液稀释使终浓度为0.5mg/mL，制得磁分离试剂；
[0043] 本步骤中，加入N-径基班巧酷亚胺能对偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺起到稳定作用；加入链霉亲和素后在4度条件下混悬，能更好的保留蛋白质活性，同时 减少室溫变化对偶联效果的影响，使批次之间偶联结果更加稳定;加入乙醇胺，能使乙醇胺 分子中的氨基与磁珠活化后未结合蛋白的活性位点反应，起到终止反应和封闭作用，能产 生更低的本底值。
[0044] (6)配制清洗液：
[0045] 将纯化水、Tris和氯化钢加入容器中，充分揽拌至完全溶解，Tris的浓度为Iwt%， 氯化钢的浓度为〇.8wt%;再将Tween-20和化itonlOO加入容器中，充分揽拌至完全混匀， Tween-20的浓度为0.5wt % ,TritonlOO的浓度为0 . Swt % ;用4M的HCL将溶液的pH值调为 7.5-8.0，用0.2皿滤器过滤，得清洗液，2-8 °C保存。
[0046] 抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒检测抗组蛋白抗体IgG的检 测方法，该方法包括如下步骤：
[0047] (1)将抗组蛋白抗体IgG校准品放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，得到由 全自动化学发光免疫分析仪输出的拟合曲线；
[0048] (2)将抗组蛋白抗体IgG质控品放到上述分析仪测试位置，得到由全自动化学发光 免疫分析仪输出的所述质控品的测试发光值和通过步骤(1)得到的拟合曲线拟合得到抗组 蛋白抗体IgG质控品的浓度值；
[0049] (3)将待测样本放到上述分析仪测试位置，由所述分析仪自动按1:20将样本稀释， 得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的待测样本的浓度值。
[0050] 进一步的，该方法具体包括如下步骤：
[0051] (1)加2化L抗组蛋白抗体IgG校准品或质控品或1:20稀释后的待测标本至检测管 中；
[(K)对 （2)加50化的试剂1号至步骤(1)所述检测管中，混匀后，37 ±0.5r溫育1 Omin;
[0化3] (3)加50化的磁分离试剂至步骤(2)所述检测管中，混匀后，37 ±0.5°C溫育5min， 进行磁分离，去上清；
[0054] (4)加3(K)化的清洗液至步骤(3)所述检测管中，混匀，进行磁分离，去上清；
[0055] (5)重复步骤(4)两遍；
[0化6] (6)加150化试剂2号至步骤(5)所述检测管中，混匀后，37±0.5r溫育IOmin，进行 磁分离，去上清；
[0057] (7)加3(K)化的清洗液至步骤(6)所述检测管中，混匀，进行磁分离，去上清；
[005引 （8)重复步骤(7)两遍；
[0059] (9)加20化L的化学发光底物至步(8)所述检测管中，混匀，检测发光强度；
[0060] 所述步骤（1)、步骤(2)和步骤(3)均包括全自动化学发光免疫分析仪的全自动检 测步骤。
[0061] 本发明的有益效果如下：
[0062] 本发明公开了一种测定抗组蛋白抗体IgG的新技术，使得反应过程更加快速可靠， 提高了灵敏度和线性范围，实现真正意义的定量测定，并能搭配全自动化学发光免疫分析 仪实现全自动的使用，提高工作效率;试剂盒中的校准品、生物素标记试剂、酶标记试剂、磁 分离试剂和清洗液等均是该反应体系下的更优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提 供了有力保障。
【附图说明】
[0063] 图1为实施例7的试剂盒空白限评价中零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度值 与发光值结果进行两点回归拟合得出的一次方程；
[0064] 图2为对比例1制备的试剂盒空白限评价中零浓度校准品与相邻校准品之间的浓 度值与发光值结果进行两点回归拟合得出的一次方程；
[0065] 图3为线性范围评价中样本浓度平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合方 程；
[0066] 图4为本方法同其他方法的试剂盒临床样本测值相关性散点图。
【具体实施方式】
[0067] 为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说 明。
[006引实施例1
[0069] 抗组蛋白抗体IgG校准品的制备：
[0070] 步骤1)配制抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液：
[0071] 将800ml的纯化水、11.2g的Tris、8.6g氯化钢和2ml Proclin300加入容器中，充分 揽拌至完全溶解；用4M的HCL将溶液的pH值调为7.0-7.5;将40g牛血清白蛋白加入容器中， 充分揽拌至完全溶解;再用4M的肥L将溶液的抑值调为7.0-7.5;用纯化水将溶液定容至IL， 用0.2WI1滤器过滤得抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液，2-8 °C保存待用；
[0072] 步骤2)配制抗组蛋白抗体IgG校准品：
[0073] 将抗组蛋白抗体IgG用抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点为0,5,20， 50，100,200抓/mL。
[0074] 实施例2
[0075] 抗组蛋白抗体IgG质控品的制备：
[0076] 将抗组蛋白抗体IgG用上述抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点为20， lOOW/mL。
[0077] 实施例3
[007引试剂1号的制备：
[0079] 步骤1)配制试剂1号稀释液：
[0080] 将8001111纯化水、12.1旨的化13、5.始氯化钢和21111?'〇(31111300加入容器中，充分揽 拌至完全溶解;将5g牛血清白蛋白加入容器中，充分揽拌至完全溶解；用4M的HCL将溶液的 pH值调为7.0-7.5;用纯化水将溶液定容至IL，用0.2wii滤器过滤得试剂I号稀释液，2-8°C保 存待用；
[0081] 步骤2)配制试剂1号：
[0082] 将组蛋白抗原用纯化水溶解，2-8°C条件下用浓度为0.2M，pH为9.0的碳酸盐缓冲 液透析化，然后浓缩至浓度为2-4mg/mL的抗原溶液，用浓度为0.2M，抑为8.5-9的碳酸盐缓 冲液配制浓度为0.5-1.Omg/ml的生物素溶液;按照组蛋白抗原与生物素质量比为10:1的比 例在组蛋白抗原溶液中加入生物素溶液，混合均匀，室溫静置12-1化，反应生成组蛋白抗 原-生物素连接物；将含有组蛋白抗原-生物素连接物的反应液在2-8°C条件下用浓度为 0.2M，pH为9.0的碳酸盐缓冲液透析2天，期间进行4次换液，从而除去未反应的生物素，得到 含有组蛋白抗原-生物素连接物的溶液；用试剂1号稀释液将含有组蛋白抗原-生物素连接 物的溶液稀释到0.1-0.化g/mL，制得试剂1号；
[0083] 实施例4
[0084] 试剂2号的制备：
[0085] 步骤1)配制试剂2号稀释液：
[0086] 将800ml纯化水、6.06g的4-径乙基赃嗦乙横酸、8.5g氯化钢、5g牛血清白蛋白、 0.1拉nCl2、0.2ml Proclin300和O.lg MgCb加入容器中，充分揽拌至完全溶解；用4M的肥L 将溶液的pH值调为7.5-8.0;用纯化水将溶液定容至IL，用0.化m滤器过滤得试剂2号稀释 液，2-8 °C保存待用；
[0087] 步骤2)配制试剂2号：
[008引将Img羊抗人多克隆抗体加入到2-化L浓度为lOmg/mL的2-亚胺四氨嚷吩溶液中， 室溫静置20min，再加入0.1iik)L/L的甘氨酸溶液10化，室溫静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收 集活化后的羊抗人多克隆抗体，2-8°C保存备用;将1.5mg的碱性憐酸酶加入到10-2化L的浓 度为5mg/mL的4-(N-马来酷亚胺基甲基）环己烧-1-簇酸班巧酷亚胺醋溶液中，室溫静置 30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的碱性憐酸酶，2-8°C保存备用;将活化的羊抗人多 克隆抗体与活化的碱性憐酸酶混合，2-8°C条件下静置12-2地，用Supperdex200凝胶纯化柱 纯化偶联物，获得羊抗人多克隆抗体-碱性憐酸酶连接物浓溶液，2-8 °C保存备用;将羊抗人 多克隆抗体-碱性憐酸酶连接物浓溶液用试剂2号稀释液稀释到0.02-0. liig/mL，制得试剂2 号。
[0089] 实施例5
[0090] 磁分离试剂的制备：
[0091 ]步骤1)配制磁微粒缓冲液：
[0092] 将SOOmL纯化水、12. Ig化is和8.5g氯化钢加入容器中，充分揽拌至完全溶解;再 将5g牛血清白蛋白、50血新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中，充分揽拌至完全溶 解；用4M的肥L将溶液的抑值调为7.9-8.1;用纯化水将溶液定容至1L，用0.2皿滤器过滤得 磁微粒缓冲液，2-8 °C保存待用；
[0093] 步骤2)配制磁分离试剂：
[0094] 取IOOmg磁微粒，使用磁力架吸附，静止2min后吸去上清，向磁微粒中加入浓度为 0.025mol/L，pH为4.5-5的2-(N-吗啡嘟）乙横酸缓冲液10mL，充分混匀;再加入0.5-l血新配 审揃浓度均为lOmg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-径基班巧酷亚胺水溶 液，室溫混匀30-60min，得磁珠混悬体系；使磁微粒充分活化，使用2-(N-吗啡嘟）乙横酸缓 冲液配制浓度为5mg/mL的链霉亲和素溶液，然后向磁珠混悬体系中直接加入4-8mg的链霉 亲和素，4°C条件下混悬16-2化;再使用磁力架吸附，静止2min后吸去上清，向磁微粒中加入 IOmL浓度为1M，pH为8.5的乙醇胺溶液，室溫反应1-化，再使用磁力架吸附，静止2min后吸去 上清，向磁微粒中加入适量磁微粒缓冲液稀释使终浓度为0.5mg/mL，制得磁分离试剂；
[00巧]实施例6
[0096] 清洗液的制备：
[0097] 将SOOmL纯化水、12. Ig化is和8.5g氯化钢加入容器中，充分揽拌至完全溶解;再 将5g Tween-20和5g TritonlOO加入容器中，充分揽拌至完全混匀；用4M的肥L将溶液的pH 值调为7.5-8.0用纯化水将溶液定容至IL，用0.2WI1滤器过滤得清洗液，2-8°C保存。
[009引实施例7
[0099] 抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒
[0100] 该试剂盒包括：
[0101] 按照实施例1方法制备的抗组蛋白抗体IgG校准品，每个水平的校准品用量为 0.5ml;
[0102] 按照实施例2方法制备的抗组蛋白抗体IgG质控品，质控品用量为ImL
[0103] 按照实施例3方法制备的试剂1号，试剂1号的用量为5ml;
[0104] 按照实施例4方法制备的试剂2号，试剂2号的用量为15ml;
[0105] 按照实施例5方法制备的磁分离试剂，磁分离试剂的用量为5ml;
[0106] 按照实施例6方法制备的清洗液，清洗液用量为1L。
[0107] 实施例8
[01 08 ]采用实施例7的试剂盒对抗组蛋白抗体I gG进行定量检测：
[0109] (1)加20化抗组蛋白抗体IgG校准品或质控品或1:20稀释后的待测标本至检测管 中；
[0110] (2)加50化的试剂1号至步骤(1)所述检测管中，混匀后，37±0.5°C溫育IOmin;
[01川 （3)加50化的磁分离试剂至步骤(2)所述检测管中，混匀后，37 ±0.5°C溫育5min， 进行磁分离，去上清；
[0112] (4)加3(K)化的清洗液至步骤(3)所述检测管中，混匀，进行磁分离，去上清；
[0113] (5)重复步骤(4)两遍；
[0114] (6)加150化试剂2号至步骤(5)所述检测管中，混匀后，37±0.5°C溫育lOmin，进行 磁分离，去上清；
[0115] (7)加3(K)化的清洗液至步骤(6)所述检测管中，混匀，进行磁分离，去上清；
[0116] (8)重复步骤(7)两遍；
[0117] (9)加20化L的化学发光底物至步(8)所述检测管中，混匀，检测发光强度；
[011引对比例1
[0119] 与实施例7制备的试剂盒相同，不同的是试剂盒中的试剂1号和磁分离试剂。
[0120] 试剂1号的制备如下：
[0121] a.配制试剂1号稀释液：
[0122] 将8001111纯化水、12.1旨的化13、5.始氯化钢和21111?'〇(31111300加入容器中，充分揽 拌至完全溶解;将5g牛血清白蛋白加入容器中，充分揽拌至完全溶解；用4M的HCL将溶液的 pH值调为7.0-7.5;用纯化水将溶液定容至1L，用0.2WI1滤器过滤得试剂1号稀释液，2-8°C保 存待用；
[0123] b.配制试剂1号：
[0124] 用浓度0.2M，抑为9的碳酸盐缓冲液配制0.5mg/ml的生物素溶液;按照组蛋白抗原 与生物素质量比为10:1的比例在组蛋白抗原溶液中加入生物素溶液，混合均匀，室溫静置 1她，反应生成组蛋白抗原-生物素连接物;将含有组蛋白抗原-生物素连接物的反应液通过 G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到含有组蛋白抗原-生物素连接物的溶液； 用试剂1号稀释液将含有组蛋白抗原-生物素连接物的溶液稀释到0.1-0.化g/mL，制得试剂 1号；
[0125] 磁分离试剂的制备如下：
[0126] a.配制磁微粒缓冲液：
[0127] 将SOOmL纯化水、12. Ig化iS和8.5g氯化钢加入容器中，充分揽拌至完全溶解;再 将5g牛血清白蛋白、50血新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中，充分揽拌至完全溶 解；用4M的肥L将溶液的抑值调为7.9-8.1;用纯化水将溶液定容至1L，用0.2皿滤器过滤得 磁微粒缓冲液，2-8 °C保存待用；
[01巧]b.配制磁分离试剂：
[01巧]取IOOmg磁微粒，磁分离去上清，用浓度为0.025mol/L，pH为4.5-5的2-(N-吗啡嘟） 乙横酸缓冲液IOmL重悬;加入0.5-lmL新配制的浓度为lOmg/mL的抓C水溶液，室溫混悬30- 60min;使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用浓度为0.025mol/L，抑为4.5-5 2-(N-吗啡嘟） 乙横酸缓冲液IOmL重悬；加入4-8mg的链霉亲和素，室溫混悬16-2化;再进行磁分离，去上 清，用磁微粒缓冲液稀释重悬到0.5mg/mL，制得磁分离试剂。
[0130] 实施例9
[0131 ]对实施例7和对比例1的试剂盒进行性能评价：
[0132] 1.准确度评价
[0133] 用实施例7的试剂盒，将浓度约为200RU/mL(允许其浓度偏差为±20%)的抗组蛋 白抗体IgG样品A加入到血清或其他相应基质的样品B中，所加入A的体积不超过总体积(A+ B)的10%，根据公式(1)计算回收率R，本方法的回收率要求在85-115%范围内，数据参见表 1，评价结果符合要求。
[0134] ...................................................................(1,)
[0135] 1、：剛乂于；
[0136] V:加入标准溶液的体积；
[0137] Vo:人源样品的体积；
[0138] C:人源样品加入标准溶液后的检测浓度；
[0139] Co:人源样品的检测浓度；
[0140] Cs:标准溶液的浓度。
[0141] 表1准确度评价
[0142]
[0143]
[0144] z.至 口|化 T；n)r
[0145] 用实施例7和对比例I的试剂盒的零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20 次，得出20次测量结果的化U值(相对发光值），计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD 所对应的化U值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟 合得出一次方程，将M+2SD所对应的化U值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为空白 限。本方法的空白限要求不大于IRU/mL，数据参见表2，A、B点连点拟合曲线及拟合方程见图 1，对比例1制备的试剂盒测得的空白限数据见表2-1，A、B点连点拟合曲线及拟合方程见图 2,由数据可见，实施例7与对比例1相比，得到的本底值更低，从而得到的空白限更低，代表 试剂盒的灵敏度更好。
[0146] 表2空白限评价
[0147]
[014 引 [0149]
[0150]
[0151] 3.线性范围评价
[0152] 用实施例7的试剂盒，将接近线性范围上限（200抓/mL)的高值样本按一定比例稀 释为至少5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。按试剂盒说明书进行操 作，对每一浓度的样本均重复检测2次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二 乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，本方法的测量范围为[2,200]RU/mL，要求在此 范围内，相关系数r应>0.9900。数据参见表3,拟合曲线及相关系数见图3,评价结果符合要 求。
[0153] 表3线性范围评价
[0154]
[0155] 4.重复性评价
[0156] 用实施例7和对比例I中的试剂盒重复检测浓度为（20±4)RU/mL和（100±20)抓/ mL的样本各10次，计算10次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV = SD/M X 100 %得 出变异系数CV，本方法变异系数(CV)要求不大于8%，数据参见表4,对比例1制备的试剂盒 得的重复性数据见表4-1，由数据可见，实施例7与对比例1相比，得到的CV值更低，代表试 剂盒的重复性更好，
[0157] CV = SDZMX 100%......................................(2)
[0158] 式中：CV-变异系数;SD-IO次测量结果的标准差;M-IO次测量结果的平均值。
[0159] 表4重复性评价 「01601 LU163J 5.批间更评价
[0164]将实施例7和对比例1的试剂盒分别取立批，每批试剂盒均测定浓度在(20±4)抓/ mL和（100±20)RU/mL范围内的样本，每批重复测定10次，计算30次测定结果的平均值(M)和 标准差(SD)，根据公式(3)计算变异系数(CV)，本方法变异系数(CV)要求不大于15%，数据 参见表5,对比例1制备的试剂盒测得的批间差数据见表5-1，由数据可见，实施例7与对比例 1相比，得到的CV值更低，代表试剂盒的批间差更好，
[01 化]CV = SD/MX100%......................................(3)
[0166] 式中：CV-变异系数;SD-30次测定结果的标准差;M-30次测定结果的平均值。
[0167] 表5批间差评价 LU'm」 6.符井巧评价
[0172]用实施例7的试剂盒，取1份抗组蛋白抗体IgG含量为0的样本，加入人血清白蛋白， 使样本中人血清白蛋白浓度为5000ng/mL，使用该试剂盒对该样本进行检测，测定样本中的 抗组蛋白抗体IgG含量。结果见表6,本方法与人血清白蛋白无交叉反应。数据参见表6,评价 结果符合要求。
[0173] 表6特异性实验
[0174]
[0175] 7.相天性评价
[0176] 用实施例7的试剂盒和商品化的抗组蛋白抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法） 对240份人血清样品同时进行检测。其检测结果参见附图4, W抗组蛋白抗体IgG检测试剂盒 (酶联免疫吸附法)测定的结果为横坐标，W本发明方法的测定的结果为纵坐标作回归分 析，相关方程为^=1.0187义+0.0565，相关系数为护:0.9846。经统计学处理结果表明，本方 法同其他方法的试剂盒临床样本测值相关性良好。
[0177] 8.稳定性评价
[0178] 对实施例7的试剂盒分别进行4°C12个月和37°C7天的加速稳定性实验，结果表明 试剂盒标准品发光强度的变化、批内和批间精密度、准确度等指标均在正常范围之内，试剂 盒有效期可达12个月。
[0179] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 W做出其它不同形式的变化或变动，运里无法对所有的实施方式予W穷举，凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 一种抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 包括： (1) 抗组蛋白抗体IgG校准品，含抗组蛋白抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液，所述 抗组蛋白抗体IgG校准品包含6个水平的液体校准品，所述6个水平的液体校准品中抗组蛋 白抗体IgG的浓度分别为O，5，20，50，100，200RU/mL; (2) 抗组蛋白抗体IgG质控品，含抗组蛋白抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液，所述 抗组蛋白抗体IgG质控品包含2个水平的液体质控品，所述2个水平的液体质控品中抗组蛋 白抗体I gG的靶值浓度范围分别为(20 ± 4) RU/mL和（100 ± 20) RU/mL; (3) 试剂1号，含生物素标记的组蛋白抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液； (4) 试剂2号，含碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛血清白蛋白的Tr i s缓冲液； (5) 磁分离试剂，含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白蛋白的Tr i s缓冲液； (6) 清洗液； 所述试剂盒中试剂1号，试剂2号和磁分离试剂的含量比为1:3:1，所述含量比为体积 比。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述磁微粒的材质为Fe2O3;所述磁微粒 表面包被有羧基基团，包被物中羧基基团含量大于20wt%，所述磁微粒的大小为1-3μπι。3. -种制备如权利要求1-2任一项所述试剂盒的方法，其包括如下步骤： (1) 配制抗组蛋白抗体IgG校准品： 步骤1)配制抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液： 将纯化水、Tris、氯化钠和Pr〇clin300加入容器中，充分搅拌至完全溶解，Tris浓度为 lwt%，氯化钠浓度为lwt%，Proclin300浓度为0.2v% ;用4M的HCL将溶液的pH值调为7.0-7.5;将牛血清白蛋白加入容器中，充分搅拌至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为4wt % ;再 用4M的HCL将溶液的pH值调为7.0-7.5;用孔径为0.2μπι的滤器过滤，得抗组蛋白抗体IgG校 准品稀释液，2-8°C保存待用； 步骤2)配制抗组蛋白抗体IgG校准品： 将抗组蛋白抗体IgG用抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点为0，5，20，50， 100,200RU/mL; (2) 配制抗组蛋白抗体IgG质控品： 将抗组蛋白抗体IgG用上述抗组蛋白抗体IgG校准品稀释液稀释至各浓度点为20， 100RU/mL； (3) 配制试剂1号： 步骤1)配制试剂1号稀释液： 将纯化水、Tris、氯化钠和ProcI in300加入容器中，充分搅拌至完全溶解，Tris的浓度 为Iwt %，氯化钠浓度为0.5wt %，Procl in300的浓度为0.2v % ;将牛血清白蛋白加入容器 中，充分搅拌至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为〇 . 5wt% ;用4M的HCL将溶液的pH值调为 7.0-7.5;用孔径为0.2μπι的滤器过滤，得试剂1号稀释液，2-8°C保存待用； 步骤2)配制试剂1号： 将组蛋白抗原用纯化水溶解，2-8°C条件下用浓度为0.2M pH为9.0的碳酸盐缓冲液透 析2h，然后浓缩至浓度为2-4mg/mL的抗原溶液，用浓度为0.2M，pH为8.5-9的碳酸盐缓冲液 配制浓度为0.5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照组蛋白抗原与生物素质量比为10:1的比例在 组蛋白抗原溶液中加入生物素溶液，混合均匀，室温静置12-18h，反应生成组蛋白抗原-生 物素连接物;将含有组蛋白抗原-生物素连接物的反应液在2_8°C条件下用浓度为0.2M，pH 为9.0的碳酸盐缓冲液透析2天，期间进行4次换液，从而除去未反应的生物素，得到含有组 蛋白抗原-生物素连接物的溶液；用试剂1号稀释液将含有组蛋白抗原-生物素连接物的溶 液稀释到〇. I-0.3yg/mL，制得试剂1号； (4) 配制试剂2号： 步骤1)配制试剂2号稀释液： 将纯化水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、牛血清白蛋白、ZnCl2和Proclin300加入容器 中，充分搅拌至完全溶解，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为0.6wt %，氯化钠浓度为0. Swt %， 牛血清白蛋白的浓度为0.5wt %，ZnCl2的浓度为0 . lwt%。，Proclin300的浓度为0.2v%〇， MgCl2的浓度为0.1%。；用4M的HCL将溶液的pH值调为7.5-8.0;用孔径为0.2μπι的滤器过滤， 得试剂2号稀释液，2-8°C保存待用； 步骤2)配制试剂2号： 将Img羊抗人多克隆抗体加入到2-4yL浓度为10mg/mL的2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中， 室温静置20min，再加入0. lm〇L/L的甘氨酸溶液IOyL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收 集活化后的羊抗人多克隆抗体，2-8°C保存备用;将1.5mg的碱性磷酸酶加入到10-20yL的浓 度为5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，室温静置 30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的碱性磷酸酶，2-8°C保存备用;将活化的羊抗人多 克隆抗体与活化的碱性磷酸酶混合，2-8°C条件下静置12-24h，用SupperdeUOO凝胶纯化柱 纯化偶联物，获得羊抗人多克隆抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，2-8 °C保存备用;将羊抗人 多克隆抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液用试剂2号稀释液稀释到0.02-0. lyg/mL，制得试剂2 号； (5) 配制磁分离试剂： 步骤1)配制磁微粒缓冲液： 将纯化水、Tris和氯化钠加入容器中，充分搅拌至完全溶解，Tris的浓度为lwt%，氯化 钠的浓度为〇. 8wt % ;再将牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中，充分搅拌 至完全溶解，牛血清白蛋白的浓度为0.5wt %，新生牛血清浓度为5v%，Procl in300浓度为 0.2v%。；用4M的HCL将溶液的pH值调为7.9-8.1;用孔径为0.2μπι的滤器过滤，得磁微粒缓冲 液，2-8 °C保存待用； 步骤2)配制磁分离试剂： 取IOOmg磁微粒，使用磁力架吸附，静止2min后吸去上清，向磁微粒中加入浓度为 0.025mol/L，pH为4.5-5的2-0-吗啡啉）乙磺酸缓冲液1〇11^，充分混匀;再加入〇.5-11^新配 制的浓度均为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺水溶 液，室温混匀30-60min，得磁珠混悬体系;使用2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液配制浓度为5mg/ mL的链霉亲和素溶液，然后向磁珠混悬体系中直接加入上述浓度的0.8-1.6mL的链霉亲和 素，4°C条件下混悬16-20h;再使用磁力架吸附，静止2min后吸去上清，向磁微粒中加入IOmL 浓度为1M，pH为8.5的乙醇胺溶液，室温反应1-2h，再使用磁力架吸附，静止2min后吸去上 清，向磁微粒中加入适量磁微粒缓冲液稀释使终浓度为0.5mg/mL，制得磁分离试剂； (6)配制清洗液： 将纯化水、Tris和氯化钠加入容器中，充分搅拌至完全溶解，Tris的浓度为lwt%，氯化 钠的浓度为〇 · 8wt% ;再将Tween-20和TritonlOO加入容器中，充分搅拌至完全混匀，Tween-20的浓度为0.5wt % ,TritonlOO的浓度为0.5wt % ;用4M的HCL将溶液的pH值调为7.5-8.0， 用孔径为〇. 2μπι的滤器过滤，得清洗液，2-8 °C保存。4. 使用如权利要求1所述的试剂盒检测抗组蛋白抗体IgG含量的检测方法，其特征在 于，该方法包括如下步骤： (1) 将抗组蛋白抗体IgG校准品放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，得到由全自 动化学发光免疫分析仪输出的拟合曲线； (2) 将抗组蛋白抗体IgG质控品放到上述分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫 分析仪输出的所述质控品的测试发光值和通过步骤(1)得到的拟合曲线拟合得到抗组蛋白 抗体IgG质控品的浓度值； (3) 将待测样本放到上述分析仪测试位置，由所述分析仪自动按1:20将样本稀释，得到 由全自动化学发光免疫分析仪输出的待测样本的浓度值。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤： (1) 加20yL抗组蛋白抗体IgG校准品或质控品或1:20稀释后的待测标本至检测管中； (2) 加50yL的试剂1号至步骤（1)所述检测管中，混匀后，37 ±0.5°C温育IOmin; (3) 加50yL的磁分离试剂至步骤(2)所述检测管中，混匀后，37±0.5°C温育5min，进行 磁分离，去上清； (4) 加300yL的清洗液至步骤(3)所述检测管中，混匀，进行磁分离，去上清； (5) 重复步骤(4)两遍； (6) 加150yL试剂2号至步骤(5)所述检测管中，混匀后，37±0.5°C温育lOmin，进行磁分 离，去上清； (7) 加300yL的清洗液至步骤(6)所述检测管中，混匀，进行磁分离，去上清； (8) 重复步骤(7)两遍； (9) 加200yL的化学发光底物至步(8)所述检测管中，混匀，检测发光强度； 所述步骤（1)、步骤(2)和步骤(3)均包括全自动化学发光免疫分析仪的全自动检测步 骤。
【文档编号】G01N21/76GK105954267SQ201610249004
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】不公告发明人
【申请人】北京中航赛维生物科技有限公司