具有肝保护功能的睡加内酯类化合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的睡加内酯类化合物及其制备方法和医药用途，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的睡加内酯类化合物，可以从当归的干燥根中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物使肝细胞对之后经历的缺血再灌注损伤的耐受力增强，表现为肝细胞活力增强，细胞死亡率降低。化合物(Ⅰ)预处理能够减轻人肝细胞缺血再灌注损伤，起到肝细胞保护作用，可以用来开发成肝脏保护的药物。
【专利说明】
具有肝保护功能的睡加内酯类化合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从当归的干燥根中分离得到的一种具有肝脏 保护作用的睡加内酯类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 当归，属伞形科的一种植物，多年生草本植物，在中国分布于甘肃、云南、四川、青 海、陕西、湖南、湖北、贵州等地，各地均有栽培。当归的根可入药，一般做药用，是最常用的 中药之一。药材当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(01 iv. )Diels的干燥根。秋末采 挖，除去须根及泥沙，待水分稍蒸发后，捆成小把，上棚，用烟火慢慢熏干。全当归根略呈圆 柱形，根上端称"归头"，主根称"归身"或"寸身"。支根称"归尾"或"归腿"，全体称"全归"。全 当归既能补血，又可活血，统称和血；当归身补血，当归尾破血。除中医处方配方用药外，含 当归的中成药达80余种。同时，当归也是中国卫生部规定的可用于保健食品的原料，在日常 生活中常被作为滋补品食用。
[0003] 当归根含挥发油和非挥发性成分。挥发油中的中性油成分有：亚丁基苯酞 (Butylidenephthalide)、0_薇稀（0-Pinene)、a-薇稀、莰稀（Camphene)、对聚伞花素（p-Cymene)、0_水序稀（0-Phellandrene)、月桂稀(Myrcene)、别罗勒稀（Allo-ocimene)、6_正 丁基-环庚二稀-1，4(6-n-butyl-cycloheptadiene_l，4)、2_甲基-十二烧_5_酮（2-Methyl-dodecane_5-〇ne)、苯乙酬（Acetophenone)、0_甜没药稀（0_Bisabolene)、异菖蒲稀 (Isoacroraene)、菖蒲二稀(Acoradiene)、花侧柏稀（Chamigrene)、a-雪松稀（a-Cedrene)、 藁本内酯（1^81181：；[11(16)、正丁基四氢化酜内酯（11-131^71-七61：抑117(11'0口111：11311(16)、正丁基 酜内酯（11-131^71-口111：11311(16)、正丁稀酜内酯（11-131^7-11(16116口111：11311(16)和佛手柑内酯 (Bergapten)等。尚含其他成分，如：豆甾醇（Stigmasterol)、谷甾醇（Sitosterol)、豆甾醇-D -葡萄糖戒（Stigma-sterol-D-glucoside)、十四醇_1 (Tetradecano 1-1)和钩吻萤光素 (Scopletin)等。
[0004] 大量的药理研究报道表明，当归及其主要化学成分具有广泛的生物活性，对造血 系统、循环系统、神经系统等均有药理作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从当归的干燥根中分离得到的一种具有肝脏保护作用 的睡加内酯类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物(I)，
[0009] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将当归的干燥根粉碎，用75 ~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的 正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸 乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱10个柱体 积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸 膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85 :1、40:1、20:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] 药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备肝脏保护的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备肝脏保护的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物（I)结构式；
[0019 ]图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0021 ]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0022] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0023]制备方法：（a)当归的干燥根（10kg)粉碎，用80 %乙醇热回流提取（25L X 3次），合 并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱和的正 丁醇(3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（163g); (c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(8个柱 体积）、40:1 (8个柱体积）、20:1 (8个柱体积）、12:1 (10个柱体积)和1:1 (5个柱体积）的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶进一步 分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积）、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2(25g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶 0DS-C18分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I) (44mg)。
[0024] 结构确证:无色无定形粉末;HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 591 ? 2618,结合核磁特 征可得分子式为C32H4QO9，不饱和度为13。核磁共振氢谱数据SH(ppm，DMS〇-d 6，400MHz): H-2 (5.89，dd，J=10.0,2.0)，H-3(6.58，ddd，J=10.0,4.8,2.4)，H-4(3.12，m)，H-4(2.65，m)， H-6(5.49，d，J=6.0)，H-7(2.78，m)，H-7(2.07，m)，H-8(1.96，m)，H-9(2.88，m)，H-ll(2.63， m)，H-ll(1.64，m)，H-12(2.79，m)，H-12(2.05，m)，H-15(5.44，dd，J=9.9,8.0)，H-16(3.01， dd，J=11.2,8.0)，H-16(2.78，dd，J=11.2,9.9)，H-18(5.03，d，J=11.6)，H-18(4.66，d，J =11.6)，H-19(1.21，s)，H-21(1.78，s)，H-23(3.10，m)，H-23(2.64，m)，H-27(1.96，s)，H-28 (1 ? 78，s)，15-0Ac (2 ? 17，s)，18-OAc (2 ? 06，s);核磁共振碳谱数据Sc (ppm，DMS〇-d6，125MHz): 204.0(C，1-C)，128.1(CH，2-C)，145.8(CH，3-C)，33.5(CH2,4-C)，135.2(C，5-C)，125.9(CH， 6-C)，26.3(CH2,7-C)，38.2(CH，8-C)，36.7(CH，9-C)，51.1(C，10-C)，23.6(CH2，ll-C)，26.4 (CH2，12-C)，57.9(C，13-C)，79.8(C，14-C)，77.1(CH，15-C)，43.0(CH2，16-C)，59.8(C，17-C)，65.1(CH2，18-C)，19.2(CH 3，19-C)，116.2(C，20-C)，11.7(CH3,21-C)，134.8(C，22-C)， 33.1(CH2,23-C)，150.8(C，24-C)，121.7(C，25-C)，166.8(C，26-C)，13.1(CH 3,27-C)，20.6 (CH3,28-C)，171.1(C，15-0Ac)，21.7(CH3，15-0Ac)，171.3(C，18-0Ac)，21.8(CH3，18-0Ac); 碳原子标记参见图UIR光谱表明该化合物含有羟基（3260CHT 1)，双键（1640CHT1)和酯基 (1740cm-4基团。NMR谱显示六个甲基信号[阳1.21(8，11-19)，1.78(8，11-21)，1.78(8，11-28)，1.96(s，H-27)，2.06(s，18-0Ac)，2.17(s，15-0Ac)]，一个含氧亚甲基[SH4.66(d，J = 11.6泡，11-18)，5.03((1，1=11.6泡，11-18)]，三个烯烃次甲基质子信号[如5.49((1，了 = 6.0Hz，H-6)，5.89(dd，J= 10.0,2.0Hz，H-2)，6.58(ddd，J = 10.0,4.8,2.4Hz，H-3)]，一个含 氧次甲基[8115.44((1(1，1 = 9.9,8.0抱，11-15)]。130匪1?谱显示32个共振碳信号，六个甲基，七 个亚甲基（一个含氧亚甲基SC65.1)，六个次甲基(三个烯属次甲基SC125.9,128.1和145.8; 一个含氧次甲基SC77.1)，十三个季碳（四个羰基SC166.8，171.1，171.3，204.0;四个烯烃季 碳SCI 16.2，121.7，135.2，150.8;两个含氧季碳SC59.8，79.8; -个含氧烯烃季碳SC134.8)。 上述核磁数据表明该化合物为五元环结构。核磁数据表明该化合物含有一个包含不饱 和-T-内酯的九碳侧链单元[SC116.2(C，C-20)，11.7(CH 3，C-21)，134.8(C，C-22)，33.1 (CH2，C-23)，150.8(C，C-24)，121.7(C，C-25)，166.8(C，C-26)，13.1(CH 3，C-27MP20.6(CH3， C-28);SH1.78(s，H-21)，1.96(s，H-27)，1.78(s，H-28)，2.64(m，H-23)，3.10(m，H-23)]，一 个 1-氧代-2,5二烯结构[叱204.0(<：，(：-1)，128.1(01，(：-2)，145.8(01，(：-3)，135.2((：，(：-5)， 125.9(01，06)]，两个羟基[叱79.8(<：，(：-14)，59.8(01，(：-17)]。11]\?(：谱中，11-15(狃5.44， (1(1，1 = 9.9,8.0他）和112-18(狃4.66，(1，1=11.61^和5.03，(1，1=11.61^)与相应乙酰碳（5 C171.1和171.3)的相关性表明015和(：-18位各连有一个乙酰氧基。1?(^3￥谱中11-15与11-18 (SH5.03，d，J = 11.6Hz)的相关性表明C-15位的乙酰氧基为a构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱 和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进 一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0025]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0026] -、材料和仪器
[0027] HL7702肝细胞株由中国科学院上海生命科学研究所提供。化合物（I)自制，方法见 实施例1，HPLC归一化纯度大于98%。高糖DMEM培养基、高糖DMEM/F12 = 1:1培养基、胎牛血 清均购于HycLoneJDTA购于上海试剂一厂。台盼蓝购于北京化工厂。无糖DMEM培养基购于 Gibco。胰酶、MTT、DMS0均购于Amresco。LDH释放法检测试剂盒购于GENMDE。ALT生化检测试 剂盒、AST生化检测试剂盒、LDH生化检测试剂盒均购于美国贝克曼试剂有限公司。Western 及IP细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、MDA检测试剂盒均购于碧云天生物技术研 究所。
[0028] C02培养箱（SheL-Lab 2300)，电热恒温孵育箱（上海跃进医疗器械厂），缺氧培养 盒(长沙长锦科技有限公司），GasALert Extreme氧气检测仪(加拿大BW TechnoLogies)，酶 标仪（美国BioTek Epoch)，全自动生化仪（Beckman LX20)，离心机（德国Eppendorf centrifuge 5415D)，孔板离心机（德国Eppendorfcentrifuge 5430R)，电子微量天平 (METTLER TOLEDO AL104)，PH仪（Thermo ORION 3STAR)〇
[0029]二、试验方法
[0030] 1、细胞分组
[0031] 将细胞分为6组，每组6个复孔：
[0032] (1)正常培养组(N组）：完全培养基，正常条件下培养；
[0033] (2)缺血再灌注组（IR组）：完全培养基正常条件培养lh后，模拟缺氧8h，再灌注4h; [0034] (3)化合物（I)组：
[0035] RE 1 组：化合物（I) 0 ? 5ng/mL预处理 1 h;
[0036] RE2 组：化合物（I) 5ng/mL 预处理 lh;
[0037] RE3组:化合物（I )50ng/mL预处理lh;模拟缺氧8h，再灌注4h;
[0038] (4)生理盐水组(NS组）：以与化合物（I)同等体积的生理盐水预处理1 h，模拟缺氧 8h，再灌注4h。
[0039] 2、化合物（I)的预处理
[0040] (1)化合物（I)的配制：将lmg化合物（I)溶解于500mL生理盐水中。移液枪吸取 2.5mL于第一支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为500ng/mL的化合物（I)溶 液。从第一支离心管中吸取lmL至第二支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为 50ng/mL的化合物（I)溶液。从第二支离心管中吸取lmL至第三支离心管中，用生理盐水稀释 至1 OmL配制成浓度为5ng/mL的化合物（I)溶液。作好标记。
[0041] (2)化合物（I)预处理：正常培养组和缺血再灌注组以每孔lOOiiL新鲜的完全培养 基更换。RE1组每孔加入5ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鲜的完全培养基90yL，RE2组每孔 加入50ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鲜的完全培养基90yL，RE3组每孔加入500ng/mL的 化合物（I)溶液1〇此和新鲜的完全培养基90此。生理盐水组每孔加入生理盐水10yL和新鲜 的完全培养基90yL。轻轻摇动96孔板，使药液充分混混匀，放入C0 2培养箱中孵育lh。
[0042] 3、肝细胞体外模拟缺血再灌注损伤模型的建立：
[0043] (1)体外模拟缺血过程:预处理时间结束后，从细胞培养箱中取出第一块96孔板， 正常培养组每孔用100yL完全培养基更换，放入C02培养箱中继续培养8h。从C02培养箱中取 出第二块96孔板，缺血再灌注组、化合物（I)预处理组和生理盐水组每孔用100此无糖DMEM 培养基置换完全培养基，放入缺氧培养盒中，培养盒中放入盛有50mL灭菌水的无菌小瓶保 持饱和湿度。将缺氧培养盒放入37°C恒温孵育箱中，进气口连接94%N 2-5 %⑶2-1 %02混合 气体，出气口连接氧气检测仪。以2L/min的气体流量通入混合气体，当氧气检测仪显示出气 口氧气浓度〈1 %时，调节混合气体流量300mL/min维持出气口氧气浓度〈1 %。以此模拟缺血 过程8h。
[0044] (2)体外模拟再灌注过程:从C02培养箱中取出第一块96孔板，正常培养组每孔更 换100此新鲜的完全培养基，放入C0 2培养箱中继续培养4h。从缺氧培养盒中取出第二块96 孔板，缺血再灌注组、化合物（I)预处理组和生理盐水组每孔用1〇〇此新鲜的完全培养基置 换无糖DMEM培养基，放入C0 2培养箱中正常条件下(37 °C、5 % C02、95 %空气、饱和湿度)培养 4h，模拟再灌注过程。
[0045] 3、指标检测
[0046] 3 ? 1MTT法检测肝细胞活力
[0047] (l)MTT溶液配制：用电子微量天平称取250mg MTT，放入小烧杯中，加入50mL PBS 搅拌30min，使之充分溶解，即为浓度为5mg/mL的MTT溶液。在超净工作台中用0.22m的微孔 滤器除菌，分装为每支lmL，4 °C避光保存备用。
[0048] (2)细胞准备：按上述方法进行细胞分组，并另设调零孔。并按上述方法进行化合 物(I)预处理和体外模拟缺血再灌注过程。
[0049] (3)呈色：终末时间点每孔加入5mg/mL的MTT溶液20yL，放入37°C、5 %⑶2、95 %空 气、饱和湿度的C02培养箱中继续培养4h。终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入100yL DMS0溶液，微量振荡器上振荡1 Omin，使结晶物充分溶解。
[0050] (4)比色:选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收度(A)，记录结果。实验重复 2次。
[0051 ] 3.2乳酸脱氢酶释放法细胞繁殖与毒性检测
[0052]按GENMED乳酸脱氢酶释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒说明书操作，重复2 次。
[0053] (1)按上述方法准备待测细胞，并另设无细胞的培养液（背景空对照孔)和未处理 的后续裂解的细胞(样品最大酶活性对照孔），作好标记。
[0054] (2)到规定的检测时间点前1小时，从C02培养箱中取出待测的96孔细胞培养板，加 入10yL GENMED裂解液到未处理的后续裂解的细胞孔里，同时加入10yL GENMED补充液到其 余所有检测孔里。放回C02培养箱中继续培养1小时即规定检测时间。
[0055] (3)从⑶2培养箱取出待测96孔细胞培养板，放入孔板离心机离心10min，速度为 250g〇
[0056] (4)分别小心移取50iiL上清液到新的96孔板的相应孔里，同时作好标记。
[0057] (5)混匀GENMED反应液，每孔分别加入50yL GENMED反应液，再分别每孔加入10yL GENMED显色液，摇动96孔板混匀。
[0058] (6)在室温下孵育30min，避免光照。
[0059] (7)每孔分别加入10yL GENMED终止液。
[0060] (8)即刻放进酶标仪里测定光吸收度(A)，选择波长570nm。
[0061] (9)根据以下公式计算细胞死亡率：
[0062] 处理样品实际吸光读数=处理样品孔吸光读数一样品对照孔吸光读数一背景空 对照孔吸光读数
[0063]样品细胞最大酶活性的实际吸光读数=样品最大酶活性对照孔吸光读数一样品 对照孔吸光读数一背景空对照孔吸光读数
[0064]细胞死亡率=(处理样品实际吸光读数+样品细胞最大酶活性的实际吸光读数） X100%
[0065] 3.3肝细胞功能指标的测定：
[0066] 按上述方法进行细胞分组、预处理和模拟缺血再灌注损伤。到终末时间点分别将 各孔细胞培养上清液l〇〇yL收集于Ep管中，每管分别加入100yL完全培养基稀释至200此，室 温下离心5min，速度为1200r/min。取上清液在全自动生化仪下检测ASL、ALT和LDH水平。实 验重复2次。
[0067] 4、统计学处理
[0068] 使用SPSS 13.0软件包进行统计学处理。计量资料采用均数土标准差(x土s)表示， 组间比较采用单因素方差分析，P<〇.05差异有统计学意义。
[0069]三、结果及结论
[0070] 1、化合物（I)预处理对缺血再灌注损伤肝细胞活力的影响
[0071] IR组肝细胞活力比N组明显下降（P〈0.05)，表明体外模拟缺血再灌注过程成功地 造成了肝细胞的缺血再灌注损伤。给予5ng/mL化合物（I)预处理1小时，缺血再灌注损伤肝 细胞的活力较缺血再灌注组和生理盐水组增强(P〈〇.05)，但未能恢复到正常组肝细胞活力 水平(P〈0.05)，生理盐水组则与缺血再灌注组差异无统计学意义(P>0.05)。而0.5ng/mL和 50ng/mL浓度的化合物（I)预处理1小时，均未能增强缺血再灌注损伤肝细胞的活力（P> 0.05)，其肝细胞活力与生理盐水组之间差异也无统计学意义(P>0.05)。结果见表1(1表示 与N组比较，P〈0.05，差异有统计学意义'表示与IR组和NS组比较，P〈0.05，差异有统计学意 义，下同）。
[0072] 2、化合物(I)预处理对肝细胞缺血再灌注损伤的细胞繁殖和毒性的影响
[0073]与正常组相比，体外模拟缺血再灌注损伤使细胞死亡率>90 %。给予5ng/mL化合物 (I)预处理1小时，肝细胞死亡率下降约35%，差异有统计学意义(P〈0.05)，但其细胞死亡率 仍比正常组高约50%，差异有统计学意义(P〈0.05);而生理盐水组肝细胞死亡率比缺血再 灌注组虽略有下降（约为8% )，但差异无统计学意义。0.5ng/mL和50ng/mL浓度的化合物（I) 预处理1小时，肝细胞死亡率比缺血再灌注组分别降低6%和13%，但差异无统计学意义(P> 0.05);而与生理盐水组的肝细胞死亡率相近(P>0.05)。结果见表2。
[0074] 3、化合物(I)预处理对缺血再灌注损伤肝细胞肝功能指标的影响
[0075]与正常组比较，缺血再灌注损伤组细胞培养上清液中的ALT水平未见明显升高(P> 0.05);而AST、LDH水平以及AST/ALT比值显著升高，差异有统计学意义(P〈0.05)。给予5ng/ mL化合物（I)预处理1小时，肝细胞培养上清液中的AST、LDH水平以及AST/ALT比值较缺血再 灌注组和生理盐水组降低，但仍较正常组高(P〈0.05);而ALT水平与缺血再灌注组和生理盐 水组比较，差异无统计学意义(P>〇. 05)。生理盐水组细胞培养上清液中的ALT、AST、LDH水平 以及AST/ALT比值与缺血再灌注组之间差异无统计学意义(PXhOShO.Sng/mL和50ng/mL化 合物（I)预处理1小时，均未能使肝细胞培养上清液中的AST、LDH水平降低(P>0.05)。结果见 表3〇
[0076]本研究显示，化合物（I)(RE2组)使肝细胞对之后经历的缺血再灌注损伤的耐受力 增强，表现为肝细胞活力增强，细胞死亡率降低。以上结果提示，化合物（I)预处理能够减轻 人肝细胞缺血再灌注损伤，起到肝细胞保护作用。
[0077]表1 MTT法检测化合物（I)预处理对缺血再灌注损伤肝细胞活力的影响
[0080]表2 LDH释放法肝细胞繁殖与毒性定量检测细胞死亡率
[0082] 表3肝细胞培养上清液中ALT、AST、LDH水平的变化(n = 5)
[0084] 实施例3
[0085] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0086] 实施例4
[0087] 口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口 服液。
[0088] 实施例5
[0089] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0090] 实施例6
[0091 ]注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0092] 实施例7
[0093] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0094] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将当归 的干燥根粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙 酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物； (b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙 醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤(b)中 75 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、40:1、20:1、12:1和1:1的二氯甲 烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比 为20:1、12:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烧 基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个 柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备肝脏保护的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备肝脏保护的药物中的应用。
【文档编号】A61K31/585GK105968161SQ201610312579
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】金俊红, 于庆生, 沈炳香, 吴松, 李永宏, 王法财
【申请人】六安市人民医院