去除重组汉逊酵母乙肝表面抗原中宿主细胞残留dna的方法

去除重组汉逊酵母乙肝表面抗原中宿主细胞残留dna的方法
【专利摘要】本发明提供了一种去除重组汉逊酵母乙肝表面抗原中宿主细胞残留DNA的方法，该方法包括：步骤a、将待去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵母表达乙肝表面抗原样品溶于含400～500mM NaCl的10～30mM PB溶液中；步骤b、以上述溶有重组汉逊酵母表达乙肝表面抗原样品的含NaCl的PB溶液作为上样液，利用Monoliths QA阴离子交换柱进行层析纯化，得到去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵母表达乙肝表面抗原样品。本发明的方法能够有效去除重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品中残留DNA，使所制得疫苗满足国家药典三部(2010版)中对其中残留DNA含量的规定。
【专利说明】
去除重组汉逊酵母乙肝表面抗原中宿主细胞残留DNA的方法
技术领域
[0001] 本发明是关于一种去除重组汉逊酵母乙肝表面抗原中宿主细胞残留DNA的方法， 具体而言，是一种关于利用层析方法去除重组汉逊酵母表达乙型肝炎表面抗原样品中宿主 细胞残留DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 重组汉逊酵母乙肝疫苗是一种乙型肝炎表面抗原(HbsAg)亚单位疫苗，它是采用 基因重组的方法将乙肝病毒表面抗原的基因进行质粒构建、转入汉逊酵母中、通过培养这 种重组酵母菌来表达乙肝表面抗原亚单位而制备的。
[0003] 重组汉逊酵母乙肝疫苗的制备技术中，纯化过程是关键技术之一。根据国家药典 三部（2010版)规定，重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母)每剂（10yg或20yg HBsAg)DNA含量不超 过10ng。目前重组汉逊酵母表达乙型肝炎表面抗原多是经丁基-琼脂糖(Butyl-Sepharose 4B)疏水层析精制纯化，然而经丁基-琼脂糖疏水层析精制纯化后的料液样品中仍会残留有 或多或少游离的宿主细胞DNA，残留DNA浓度甚至可高达1000ng/ml，而HBsAg浓度一般为200 ~600μg/ml，这样的纯化料液用于制备疫苗，常常难以满足国家药典三部(2010版)规定的 重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)每剂DNA含量不超过10ng的要求。

【发明内容】

[0004] 本发明的一个目的在于提供一种有效去除重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品中宿 主细胞残留DNA的方法，以使所制得疫苗满足国家药典三部(2010版）中对其中残留DNA含量 的规定。
[0005] 为达上述目的，本发明提供了一种去除重组汉逊酵母乙肝表面抗原中宿主细胞残 留DNA的方法，该方法包括：
[0006] 步骤a、将待去除残留宿主DNA的重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品溶于含400~ 500mM NaCl的 10~30mM PB溶液中；
[0007] 步骤b、以上述溶有重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品的含NaCl的PB溶液作为上样 液，利用Monoliths QA(季胺基-聚甲基丙烯酸酯整体介质）阴离子交换柱进行层析纯化，得 到去除残留宿主DNA的重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品。
[0008] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述待去除宿主细胞残留DNA的重 组汉逊酵母乙肝表面抗原样品可为经过Buty 1-4B疏水层析精制纯化后的HBsAg料液样品。 如前所述，重组汉逊酵母乙肝表面抗原(HBsAg)经丁基-琼脂糖(Butyl-Sepharose 4B)疏水 层析精制纯化后，料液(样品）中尽管HBsAg纯度已较高(大于99%)，但仍残留有游离的宿主 细胞DNA(宿主细胞残留DNA浓度为180~1000ng/ml，而HBsAg浓度为200~600μg/ml)。这样 的纯化料液用于制备疫苗，特别是用于制备HBsAg较高剂量的疫苗时，往往不能满足国家药 典三部(2010版）中对每剂DNA含量的限定要求。
[0009] 根据本发明的优选具体实施方案，本发明的方法所适用的待去除宿主细胞残留 DNA的重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品中，HBsAg纯度大于99%。更优选地，这样的待去除宿 主细胞残留DNA的重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品中，HBsAg浓度为200~600μg/ml，残留宿 主DNA浓度为180~1000ng/ml，通常每10yg HBsAg中的残留宿主DNA含量在50ng以下，例如 为10~50ng。
[0010] 根据本发明的具体实施方案，本发明的去除重组汉逊酵母乙肝抗原样品中宿主细 胞残留DNA的方法，主要是先将样品溶于含特定浓度NaCl的1?溶液中（或将样品的原缓冲液 置换为含特定浓度NaCl的PB溶液），以此作为上样液进行MonolithsQA阴离子交换柱层析纯 化。通常情况下，HBsAg料液样品的原缓冲液为浓度约5.0~6.5mM的低浓度磷酸盐缓冲液， 这样的料液样品如果直接用于本发明的上样柱并不能达到良好的去除宿主细胞残留DNA的 效果。本发明中，是以含400~500mM NaCl的10~30mM高浓度PB溶液作为上样缓冲液。其中， NaCl的添加对于纯化结果（即宿主细胞残留DNA的去除效率)具有重要影响，在本发明所述 的NaC 1浓度范围内，宿主细胞残留DNA的去除效率可达90 %或更高。本发明的步骤a中的含 400~500mM NaCl的10~30mM PB溶液，在所述1?溶液浓度范围（10~30mM)内，PB溶液浓度 改变对宿主细胞残留DNA的去除效率基本无显著影响。另，含NaCl的PB溶液的pH值可保持与 HBsAg料液样品的原缓冲液一致，例如，所述1?溶液的pH为7.0~7.4(该范围内pH值的改变 对宿主细胞残留DNA的去除效率基本无显著影响）。此外，本发明的方法中，优选控制上样液 中，HBsAg浓度为200~600μg/ml，宿主细胞残留DNA浓度为180~1000ng/ml。
[0011] 将待去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵母乙肝抗原样品（通常为溶液形式)溶于 含特定浓度NaCl的1?溶液中的过程可以采用所属领域中任何可行的办法，例如，可采用超 滤等技术将HBsAg料液样品中的缓冲液置换为含400~500mM NaCl的10~30mM 1?溶液，制 备得到上样液。
[0012] 根据本发明的具体实施方案，本发明所用的Monoliths QA阴离子交换柱可为所属 领域中的已有设备，例如可采用奥地利公司BIA Separation的产品C丨MK Mono 1 iths层析柱 (Convective interaction media Monoliths)〇
[0013] 本发明的去除重组汉逊酵母乙肝抗原样品中宿主细胞残留DNA的方法中，是采用 穿透模式进行层析，即，使宿主细胞残留DNA结合在Monolith-QA层析介质上、而HBsAg流穿 出去，收集穿透峰得到去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品。
[0014] 根据本发明的具体实施方案，本发明的去除重组汉逊酵母乙肝抗原样品中宿主细 胞残留DNA的方法中，在利用Monoliths QA阴离子交换柱进行层析纯化前，可采用含400~ 500mM NaCl的10~30mM PB溶液（同样的，所述PB溶液的pH值可为7.0~7.4)对Mono 1 i ths QA阴离子交换柱进行平衡。
[0015] 根据本发明的具体实施方案，本发明的去除重组汉逊酵母乙肝抗原样品中宿主细 胞残留DNA的方法中，上样时，每毫升Monolith-QA柱，上样量为2~15ml，优选上样量为2~ 10ml。每毫升Monolith-QA柱，上料速度为：1~4ml/min。
[0016] 根据本发明的具体实施方案，本发明的去除重组汉逊酵母乙肝抗原样品中宿主细 胞残留DNA的方法，步骤b中，还可包括将收集穿透峰得到去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊 酵母乙肝表面抗原样品中的缓冲液置换为原缓冲液（即待去除宿主细胞残留DNA的重组汉 逊酵母乙肝抗原样品料液中的缓冲液，通常为浓度约5.0~6.5mM的低浓度磷酸盐缓冲液） 的过程。该过程也可以采用蛋白纯化领域中任何可行的办法，例如，可采用超滤等技术进 行。
[0017] 根据本发明的具体实施方案，本发明的去除重组汉逊酵母乙肝抗原样品中宿主细 胞残留DNA的方法，还可包括以步骤b所得到的去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵母乙肝 表面抗原样品制备疫苗的过程。所述以步骤b所得到的去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵 母乙肝表面抗原样品制备疫苗的过程可以参照所属领域的现有技术进行。本发明中，能有 效去除重组汉逊酵母乙肝抗原样品中宿主细胞残留DNA，可使所制得疫苗满足国家药典三 部(2010版）中对其中残留DNA含量的规定。
[0018] 根据本发明的具体实施方案，本发明的去除重组汉逊酵母乙肝抗原样品中宿主细 胞残留DNA的方法，还可包括在步骤b后对使用过的Monoliths QA阴离子交换柱进行洗脱和 介质再生的过程，其中：
[0019] 洗脱液优选为含1.9~2.1M NaCl的10~30mM PB溶液（同样的，优选所述PB溶液的 pH值为7.0~7.4)，洗脱流速为每ml Monolith-QA为1~4ml/min，洗脱8~12个柱床体积；
[0020] 再生过程优选为:先用1M NaOH溶液，以lml/min流速再生1~2h;再用30%异丙醇， 以lml/min流速再生1~2h;之后用注射用水，以每ml Monolith-QA 1~4ml/min的流速冲洗 lh;接着用20%乙醇，以每ml Monolith-QA 1~4ml/min的流速冲洗（乙醇的冲洗时间保证 QA柱冲洗完全即可，通常为20min~30min)。
[0021] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明用奥地利BIA Seperation公司生产的 CIM' Monoliths层析柱（其具有强阴离子交换介质一季胺基-聚甲基丙稀酸酯整体介质 (Monolith-QA))实施了本发明的去除重组汉逊酵母乙肝抗原样品中宿主细胞残留DNA的方 法。相关试验结果显示：当乙型肝炎疫苗关键有效成分乙型肝炎表面抗原(HBsAg)溶于含特 定浓度NaCl的PB溶液中，采用穿透模式上样(料)时，汉逊酵母宿主细胞残留的游离DNA能够 吸附在Monolith-QA柱上，而HBsAg不与QA柱结合而流穿出来；在80ml QA柱以800ml HBsAg 精制纯化样品（料液)上样(料）后，不仅1 〇yg HBsAg中DNA含量小于1 Ong，而且20yg HBsAg中 DNA含量也小于10ng，可分别满足制备10yg和20yg HBsAg剂量重组汉逊酵母乙肝疫苗的要 求。本发明的技术方案能够有效解决重组汉逊酵母乙肝疫苗宿主细胞残留DNA高于国家药 典规定上限的问题，对去除高HBsAg剂量(高于20yg)重组酵母乙肝疫苗中的宿主细胞残留 DNA也提供了解决方案及借鉴。
【附图说明】
[0022] 图l:HBsAg样品在不同NaCl浓度条件上样的层析图（lml Monolith-QA柱）。
[0023] 图2:8ml Monolith-QA柱 16ml HBsAg样品上样层析图。
[0024] 图3:8ml Monolith-QA柱24ml HBsAg样品上样层析图。
[0025] 图4:8ml Monol ith-QA柱 120ml HBsAg样品上样层析图。
【具体实施方式】
[0026] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。下列各实施例中未注 明具体条件的操作方法，按照常规条件或按照仪器制造厂商所建议的条件进行。
[0027] 各实施例中所用试剂材料设备和基本方法：
[0028] 1.1试剂和材料
[0029] (1 )Butyl_4B疏水层析精制纯化后的HBsAg料液样品
[0030]由北京天坛生物制品股份有限公司（天坛生物）疫苗研究二室提供，HBsAg纯度大 于99%，邢348浓度为200~60(^8/1111，0嫩浓度为180-10001^/1111，每1(^8邢848中的0嫩含量 约为10~50ng。
[0031] (2)CIM_Monoliths QA阴离子交换柱
[0032] 为奥地利公司BIA Separation产品，规格分别为lml、8ml、80ml。
[0033] 1.2主要仪器和设备
[0034] AlCTAPurifier 100型纯化系统，购自美国GE公司，用于小量介质（lml、8ml)试 验，操作按照说明书进行。
[0035] 1.3上柱料液的制备
[0036] 通过购自德国赛多利斯公司的超滤装置100KD Vivaflow 50,将含有HBsAg料液样 品中的缓冲液置换为含特定浓度NaCl的PB溶液，置换流速为50ml/min，从而制备得到上柱 料液(上样液）。
[0037] 1.4层析过程
[0038] 1.4.1Monolith-QA 介质平衡：
[0039]以与上样液中缓冲液相同的含特定浓度NaCl的1?溶液平衡CM-Monoliths QA介 质，依Monolith-QA柱规格设定流速（lml Monol ith-QA为4ml/min; 8ml Monol ith-QA为 lOml/min; 80ml Monolith-QA, 80ml/min)，缓冲液总量大于10个柱床体积，且基线为直线， 即可上料(样）。
[0040] 1.4.2上料(样）：
[0041 ] 将上柱料液(上样液），栗入(ΠΜ-Monoliths QA柱，依Monolith-QA柱规格设定流速 (lml Monolith-QA为4ml/min;8ml Monolith-QA为10ml/min;80ml Monolith-QA,80ml/ min);待起峰时开始收集穿透峰料液(样品）。
[0042] 1.4.3流洗：
[0043]上料(样)结束后，继续以与上样液中缓冲液相同的含特定浓度NaCl的PB溶液流洗 CIM-Mono 1 iths，依Monol ith-QA柱规格设定流速（lml Mono 1 ith-QA为4ml/min ; 8ml Monol ith-QA为lOml/min; 80ml Monol ith-QA，80ml/min)，直至穿透峰结束，结束收集，回归 基线后方可进行介质洗脱和再生;测量穿透峰料液(样品)体积。
[0044] 1.4.4洗脱和介质再生：
[0045] 用含 2M NaCl 的20mM ΡΒ(ρΗ7· 2)，依Monol ith-QA 柱规格设定流速（lml Monol ith- QA 为4ml/min;8ml Monol ith-QA 为 10ml/min; 80ml Monol ith-QA ， 80ml/min) ， 洗脱 10 个柱床 体积；用謂他0!1以11111/1^11流速再生1-211;用30%异丙醇以11111/1^11流速再生1-211 ;用注射 用水，依Monol ith-QA柱规格设定流速（lml Monol ith-QA为4ml/min; 8ml Monol ith-QA为 lOml/min; 80ml Monol ith-QA，80ml/min)冲洗lhr;最后用20% 乙醇，依Monol ith-QA 柱规格 设定流速（lml Monolith-QA为4ml/min;8ml Monolith-QA为10ml/min;80ml Monolith-QA, 80ml/min)冲洗约20分钟后并保存。
[0046] 1.5样品检测
[0047] 1 ·5· lHBsAg含量检测（Lowry法）
[0048]蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色 化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计 算供试品的蛋白质含量。
[0049] (1)加空白（去离子水）、标准品（14、29、30、43、58、72和86以8/1111)及已经稀释过后 的样品各lml于试管中；
[0050] (2)各试管中各加 C液5ml，混匀室温放置lOmin;
[0051 ] (3)各试管各加 D液0.5ml，充分混勾，室温放置30min显色；
[0052] (4)测定各管液体在560nm的吸光度值。
[0053] 1.5.2DNA 检测方法(Picogreen 荧光法）
[0054] (1 )DNA标准品配制：以TE缓冲液为溶剂精确配制10μg/ml的小牛胸腺嘧啶DNA溶液 作为标准品母液，先用TE缓冲液稀释至100ng/ml，然后连续稀释8个稀释度，具体如下:①10 倍稀释至1〇〇〇1^/1111;@12.5倍稀释至8〇1^/1111;@2倍稀释至4〇1^/1111 ;标准品@-@均为上 一个样品的2倍稀释;标准品②-⑨DNA浓度分别为：80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、 5ng/ml、2 · 5ng/ml、1 · 25ng/ml和0 · 625ng/ml，共8个稀释度的标准品样品；
[0055] (2)料液样品准备:准备待检测样品的原倍样品、10倍稀释样品及100倍稀释样品， 为供试品；
[0056] (3)荧光染料配制:TE缓冲液1:200稀释，取所需量的PicoGreen染料溶于20ml溶于 TE缓冲液中；
[0057] (4)空白、供试品和荧光染料等体积混合:精密量取标准品样品、供试品样品溶液 各500μ1于1.5ml EP管中，分别加入新配置的荧光染料500μ1，混匀后，避光室温反应5min;
[0058] (5)酶标板加样:取上述标准品和供试品样品反应液250μ1加入酶标板，各做3个复 孔；
[0059] (6)检测:激发波长480nm，发射波长520nm，ΤΕ缓冲液为空白对照，测得荧光强度为 本底；
[0060] (7)计算：以标准品溶液的浓度对其荧光强度做直线回归，求直线方程，将供试品 样品的荧光强度带入直线方程，求出样品中的DNA含量。
[0061 ] 1.5.3计算：
[0062]
[0063]
[0064]
[0065] 实施例1
[0066] 采用100KD Vivaflow 50超滤装置，将20121010批经Butyl-4B疏水层析精制纯化 后的冊848料液样品以液体置换方式溶于分别含300、400、500和60011^似(：1的2011^?8 (PH7.2)中，作为上样液；
[0067] lml规格的Monolith-QA柱，依次分别以含300、400、500和600mM NaCl的20mM PB做 为上样缓冲液，以含2M NaCl的20mM PB(pH7.2)作为洗脱缓冲液，上样量为5ml。分别收集穿 透峰和洗脱峰样品，检测穿透峰和洗脱峰中的DNA水平和HBsAg水平。
[0068] HBsAg样品在不同NaCl浓度条件上样的层析图（lml Monolith-QA柱)参见图1。 [0069] HBsAg样品在不同NaCl浓度条件上样的层析（1ml Monolith-QA柱)实验结果参见 表1。
[0070] 表1、HBsAg样品在不同NaCl浓度条件上样的层析实验结果
[0071]
[0072] Λ: 20101010: HBsAg浓度：423 · 42μg/ml ;DNA浓度：753 · 25ng/ml
[0073] /:无法计算，无效值
[0074] 从表1中的实验结果可以看出，当NaCl浓度为400~500mM时，穿透峰中的DNA去除 率在90 %以上，且每1 Oyg HBsAg中的DNA含量从〈1 Ong。
[0075] 实施例2
[0076] 取 20100908、20101009、20101010 和 20120605批经 Butyl-4B 疏水层析精制纯化后 的HBsAg料液样品，将样品采用100KD Vivaflow 50超滤装置以液体置换方式溶于含500mM NaCl的20mM PB(pH7.2)中作为上样液，用8ml规格Monolith-QA进行不同上样量试验，上样 量分别采取161111、241111和12〇1111，洗脱缓冲液为含21似(：1的2〇1111?8(?!17.2)，收集穿透峰溶 液并测量其体积，检测穿透峰HBsAg浓度和DNA浓度。评价穿透峰中DNA水平及HBsAg收率和 DNA去除率。
[0077] (i)i6ml 上样量
[0078] 16ml上样量的实验结果参见图2和表2。
[0079] 表2、8ml Monolith-QA柱 16ml HBsAg样品上样层析结果
[0080]
[0081J 从图2和表2结果可以看出，当使用8ml Monolith-QA柱，将HBsAg浴于含500mM NaCl的20mM PB(pH7.2)中在QA柱上16ml进行上样，穿透峰中HBsAg的收率约为89.3~ 95.2%之间，穿透峰中每10yg HBsAg中的DNA约为1.0~4. lng，每20yg HBsAg中的DNA约为 2·0~8·2ng0
[0082] (2)24ml 上样量
[0083] 24ml上样量的实验结果参见图3和表3。
[0084] 表3、8ml Monolith-QA柱24ml样品上样层析结果
[0086] 从图3和表3结果可以看出，当使用8ml Monolith-QA柱，将24ml溶于含500mM NaCl 的20mM PB(pH7.2)中HBsAg精制样品上样至QA柱，穿透峰中HBsAg的收率约为93.6-99.3% 之间，穿透峰中每lOyg HBsAg中的DNA约为2 · 7~3 · 2ng，每20yg HBsAg中的DNA约为5 · 4~ 6·4ng〇
[0087] (3) 120ml 上样量
[0088] 120ml上样量的实验结果参见图4和表4。
[0089] 表4、8ml Monolith-QA柱 120ml HBsAg样品上样层析结果
[0090]
[0091] 从图4和表4结果可以看出，用8ml Monolith-QA柱，将120ml溶于含500mM NaCl的 201^?8(口!17.2)中冊848上样至]\1〇11〇1丨让-04柱上，穿透峰中冊848的收率约为95.9~ 99 · 3 %之间，穿透峰中每10yg HBsAg中的DNA约为3 · 9~7 · 9ng，每20yg HBsAg中的DNA约为 7 · 8~15 · 8ng〇
[0092] 综合表2、表3和表4显示，上样量为16ml、24ml、120ml (8ml Monolith-QA柱）时，每 10yg HBsAg中的DNA均低于10ng;上样量为16ml、24ml时，每20yg HBsAg中的DNA也低于 10ng。当8ml Monolith-QA柱上样量为120ml时，虽然每10yg HBsAg中的DNA仍低于10ng，但 是已经有一批样品20100201 (表4，c)上样后，每20yg HBsAg中的DNA超过1 Ong，为15.8ng。
[0093] 实施例3
[0094] 取20121110、20121111和20121112三批经刖丨71-48疏水层析精制纯化后的冊8八 8料液样品，将采用超滤装置以液体置换方式溶于含500mM NaCl的20mM 1?溶液(pH7.2)中作 为上样液，用80ml Monolith-QA柱进行去除游离DNA放大试验，上料量为800ml。
[0095]洗脱缓冲液为含2M NaCl的20mM PB(pH7.2)，收集穿透峰料液并测量其体积，检测 穿透峰HBsAg浓度和DNA浓度。评价穿透峰中DNA水平及HBsAg收率和DNA去除率。
[0096] 实验结果参见表5。
[0097] 表5、80ml QA柱800ml HBsAg料液上柱层析结果
[0098]
[0099] 从表5结果可以看出，用80ml Monolith-QA柱，将800ml溶于含500mM NaCl的20mM PB(pH7.2)中精制纯化HBsAg料液上至Monolith-QA柱，穿透峰中HBsAg的收率约为88.8~ 90 · 8%之间，穿透峰中每10yg HBsAg中的DNA约为2 · 5~4· 5ng，每20yg HBsAg中的DNA约为 5.0~9.Ong。可以满足国家药典三部(2010版)对重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)宿主细胞残 留DNA低于每剂10ng的要求。
【主权项】
1. 一种去除重组汉逊酵母乙肝表面抗原中宿主细胞残留DNA的方法，该方法包括： 步骤a、将待去除残留宿主DNA的重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品溶于含400~500mM NaCl的10~30mM PB溶液中； 步骤b、以上述溶有重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品的含NaCl的PB溶液作为上样液，利 用Monoliths QA阴离子交换柱进行层析纯化，得到去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵母 乙肝表面抗原样品。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述待去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵母乙 肝表面抗原样品为经过Buty 1-4B疏水层析精制纯化后的HBsAg料液样品。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述待去除宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵母乙 肝表面抗原样品中，HBsAg纯度大于99% ;上样液中，HBsAg浓度为200~600μg/ml，宿主细胞 残留DNA浓度为180~1000ng/ml。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述待宿主细胞残留DNA的重组汉逊酵母乙肝表 面抗原样品中，每l〇yg HBsAg中的宿主细胞残留DNA含量为10~50ng。5. 根据权利要求2所述的方法，其中，步骤a中采用超滤技术将HBsAg料液样品中的缓冲 液置换为含400~500mM NaCl的10~30mM PB溶液，制备得到上样液;优选地，所述PB溶液的 pH值为7.0~7.4。6. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b中采用使宿主细胞残留DNA结合在 Monolith-QA层析介质上、而HBsAg流穿出去的穿透模式进行层析，收集穿透峰得到去除宿 主细胞残留DNA的重组汉逊酵母乙肝表面抗原样品。7. 根据权利要求1所述的方法，其中，每毫升Monolith-QA柱，上样量为2~15ml，优选上 样量为2~10ml。8. 根据权利要求1或7所述的方法，其中，每毫升Monolith-QA柱，上料速度为：1~4ml/ min〇9. 根据权利要求1所述的方法，该方法还包括： 在利用Monoliths QA阴离子交换柱进行层析纯化前，采用含400~500mM NaCl的10~ 30mM 1?溶液对Monoliths QA阴离子交换柱进行平衡的过程;优选地，所述PB溶液的pH值为 7.0~7.4〇10. 根据权利要求1所述的方法，该方法还包括在步骤b后对使用过的Mono 1 iths QA阴 离子交换柱进行洗脱和介质再生的过程，其中： 洗脱液为含1.9~2.11似(：1的？!17.0~7.4的10~3〇11^?8溶液，洗脱流速为每1111 Mono 1 i th-QA为1~4ml/min，洗脱8~12个柱床体积； 再生过程为：先用1M NaOH溶液，以lml/min流速再生1~2h;再用30 %异丙醇，以lml/ min流速再生1~2h;之后用注射用水，以每ml Monolith-QAl~4ml/min的流速冲洗lh;接着 用20%乙醇，以每ml Monolith-QAl~4ml/min的流速冲洗。
【文档编号】C07K1/18GK105837667SQ201610329460
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】杨旭琴, 李彩梅, 张德有, 李津, 杨云凯, 赵铠, 马锐, 许宁, 刘英微, 王曦
【申请人】北京天坛生物制品股份有限公司