重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法及应用，该方法包括以下步骤，先将工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种进行培养发酵，收集发酵后的培养物；对培养物先后进行细胞破碎、澄清和超滤、硅胶吸附、超滤浓缩换液、色谱纯化和脱盐，除菌过滤，制得纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒，该纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒大小与天然戊型肝炎病毒颗粒理论大小一致为27-34nm，基因序列与理论一致，其表达的外源蛋白分子量与预期的目的蛋白大小一致，且该类病毒颗粒具有良好的免疫原性。本发明还公开采用该类病毒颗粒制备疫苗的应用。将该类病毒颗粒与铝佐剂配置成疫苗，动物免疫原性检测结果表明利用该类病毒颗粒制备的疫苗具有很好的免疫原性。
【专利说明】重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物工程【技术领域】，具体涉及一种重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法及制备疫苗的应用。
【背景技术】
[0002]戊型肝炎OfepatitisE，HE)是一种急性地方性流行肠道疾病，主要由粪-口途径传播，戊型肝炎多为急性发病，一般不会发展为慢性肝炎。戊肝作为一种肠道传染病在一些发展中国家可占到急性病毒性肝炎的50%。戊型肝炎临床症状基本上与甲型肝炎相同，患者主要表现为黄疸、厌食、肝肿大、腹部疼痛、恶心，呕吐以及发烧等症状，死亡率约为1%，高于甲肝。
[0003]戊型肝炎的第一次病原学鉴定是1983年Balayan等等通过一名志愿者的研究得到的，是Balayan等学者利用免疫电镜技术在病人的急性期粪便和康复期血清中发现一个直径27nm(27-34nm的范围)的无包膜病毒颗粒。但是戊型肝炎病毒的细胞培养及组织培养均未成功，目前仍未找到实施的可获得大量病毒的手段。随着近年来人们对戊型肝炎病毒研究的不断深入与完善，对于戊型肝炎病毒基因组表达也越来越明了，戊型肝炎病毒的基因工程疫苗成为生物科学领域研究的重点。在基因工程疫苗中，类病毒颗粒(Virus LikeParticle, VLP)相比于可溶性抗原疫苗，因免疫原性与安全性更高，常作为疫苗的第一候选。
[0004]目前全世界范围内研制成功上市的重组戊型肝炎疫苗采用的表达系统为原核大肠杆菌表达系统，表达的戊型肝炎病毒抗原通过体外合适的组装条件才能形成戊型肝炎类病毒样颗粒，原核表达系统的缺点在于表达的重组蛋白无法进行加工修饰，影响其生物活性。
【发明内容】
[0005]本发明针对上述现有技术的不足，提供一种重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒(HEV VLPs)的纯化及疫苗的制备方法，该汉逊酵母表达系统能够直接表达、形成与天然戊型肝炎病毒颗粒大小一致的类病毒颗粒，通过一系列纯化工艺获得戊型肝炎类病毒颗粒，并制备成具有很好免疫原性的疫苗。
[0006]本发明的技术方案如下:
[0007]一种重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，包括以下步骤:
[0008](I)将工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种进行培养发酵，收集发酵后的培养物；
[0009](2)对步骤(1)中收集的发酵后的培养物先后进行细胞破碎、澄清和超滤、硅胶吸附、超滤浓缩换液、色谱纯化和脱盐，除菌过滤，制得纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒。
[0010]所述的工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种表达的目的蛋白为戊型肝炎病毒IV型结构区0RF2编码蛋白第112-607氨基酸片段。
[0011]所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的大小为27-34nm。
[0012]步骤(1)中所述的培养发酵的具体方法为:将工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种按1%接种于200ml的酵母氮源培养基中，进行一级培养，当用紫外-可见分光光度法检测一级培养物吸光度值A6tltol为10-20时，将培养物移种至2L的酵母氮源培养基中，当用紫外-可见分光光度法检测二级培养物吸光度值A6tltlnm为10-18时，将培养物移种至甘油培养基中进行培养发酵、甲醇诱导表达，收集发酵后的培养物；
[0013]优选的，所述的一级培养的温度为30_33°C，培养时间为20h ；
[0014]优选的，所述的二级培养的温度为30_33°C，培养时间为20h ；
[0015]优选的，在甘油培养基中的培养温度为30°C，培养时间为13_15h，培养体积为15-25L，然后以终浓度1%的速度流加甲醇进行诱导培养75-80h。
[0016]所述的细胞破碎的具体方法为:将收集的发酵后的培养物以4500转/min的转速进行离心20min，离心沉淀后的酵母细胞中加入PB缓冲液，使细胞浓度为50%，充分混匀后再以同样条件离心取沉淀，离心沉淀中加入细胞破碎液，使细胞浓度为30%，再加入细胞破碎液体积的1%的Tween-80,0.1M/L的NaCl，用玻璃珠研磨法破碎，在破碎液中加入其体积4%的浓度为1%的PMSF溶液，1M/L的NaOH调节PH值为8.0,以7000转/min的转速离心40-50min去除沉淀得上清液；离心温度优选2_8°C。[0017]所述的澄清和超滤的具体方法为:将上清液通过0.65 μ m中空纤维柱进行澄清处理细胞碎片，用PB缓冲液冲洗9-10倍上清液体积，收集膜下透过溶液，将透过液通过0.2 μ m中空纤维柱进行超滤浓缩，用PB缓冲液冲洗5-6倍透过液体积，收集膜上液保存；所述的PB缓冲液PH值优选8.0。
[0018]所述的硅胶吸附的具体方法为:于膜上液中加入硅胶溶液，搅拌吸附，再以4000转/min的转速离心20min去除上清液；在沉淀中加入原上清液体积44%的硅胶洗脱液,于57°C搅拌90min,然后以4000转/min的转速离心15min去除沉淀,上清液中加入氯化钠混匀，静置，以7000转/min转速离心lOmin，去除沉淀，收集上清液；
[0019]优选的，所述的硅胶溶液的浓度为7.5%，硅胶溶液的加入体积为上清液体积的40-50% ；
[0020]优选的，所述搅拌吸附温度为2_8°C，搅拌吸附时间为10_16h，所述的离心温度为2-8 0C ；
[0021]优选的，所述的氯化钠的体积为1/11硅胶洗脱液体积，氯化钠的浓度为4M/L ；
[0022]优选的，所述的静置温度为2_8°C，静置时间为30min。
[0023]所述的硅胶洗脱液由包括以下质量体积浓度的组分组成:
[0024]四硼酸钠3.814g/L,
[0025]EDTA0.742g/L,
[0026]脱氧胆酸钠2.5g/L。
[0027]所述的超滤浓缩换液的具体方法为:将经硅胶吸附操作后得到的上清液过750K中空纤维柱，PB缓冲液清洗5-6倍上清液体积，膜上保留溶液浓缩至蛋白浓度2mg/ml-3mg/ml,收集保留浓缩溶液。
[0028]所述的色谱纯化的具体方法为:对保留浓缩溶液采用色谱介质为Sepharose4FF进行纯化，上样，流速为20ml/min，洗脱液为PBS，监测波长280nm，收集A28tlnm第I个洗脱峰；采用色谱介质为DEAE Sepharose ;上样,流速为2-3ml/min,洗脱液为PB与氯化钠的混合液，监测波长280nm，收集吸光度值A28tlnm大于0.5的洗脱峰；
[0029]优选的，所述的上样的体积为2%_3%个柱床体积，所述的PBS的浓度为0.003mol/L，PBS 的 PH 值为 8.0 ；
[0030]优选的，所述的PB的浓度为50mmol/L，所述的氯化钠浓度为0.5mol/L ;进一步优选的，所述的PB与氯化钠的体积比为1: (0.8-2.5)。
[0031]所述的脱盐的具体方法为:采用柱色谱法脱盐，色谱介质为S印har0Se4FF，上样，流速为20ml/min，洗脱液为PBS，监测波长280nm，收集A28tlnm从0.5至0.3的洗脱峰；
[0032]优选的，所述的上样的体积为4%_8%个柱床体积，所述的PBS的浓度为0.003mol/L, PBS 的 PH 为 7.0。
[0033]一种上述重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒制备疫苗的应用，包括以下步骤:
[0034]在纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒中加入经除菌的氢氧化铝溶液，摇匀吸附，制得戊型肝炎病毒疫苗半成品；所述的氢氧化铝溶液的浓度优选1.0mg/ml，所述的戊型肝炎病毒疫苗半成品中铝离子的浓度0.5mg/ml。
[0035]与现有技术相比，本发明的有益效果有:
[0036](I)对本发明中纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎病毒(HEV)类病毒颗粒进行基因序列测序，测序结果与理论一致；对本发明中制得的疫苗进行氨基酸测序，测序结果与理论一致。
·[0037](2) SDS-PAGE检测结果表明，纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒表达的外源蛋白分子量为55kD，分子量与预期的目的蛋白大小一致，戊型肝炎病毒基因的拷贝数越闻，目的蛋白的表达量越闻，筛选获得的闻表达菌株的外源基因均为二拷贝以上。
[0038](3) Western blot检测结果显示,特异性反应带分子量大小与预期的目的蛋白大小一致，无非特异性反应条带。
[0039](4)通过磷钨酸负染色电镜观察发现，戊型肝炎病毒基因的拷贝数影响戊型肝炎病毒样形成大小，单、两拷贝戊型肝炎病毒基因的菌株表达所形成的类病毒颗粒和天然戊型肝炎病毒颗粒大小一致，4拷贝以上的病毒样颗粒大小明显大于天然戊型肝炎病毒样颗粒。
[0040](5)将纯化获得的戊型肝炎类病毒颗粒ELISA活性检测结果，细胞破碎液I万倍稀释，OD值1.0以上，说明纯化获得的戊型肝炎类病毒颗粒具有良好的免疫反应性。
[0041](6)戊型肝炎类病毒颗粒与铝佐剂配置成动物免疫原性检测结果，小鼠免疫ED50(半数有效剂量)为0.3 μ g，表明具有很好的免疫原性。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为实施例中重组戊型肝炎疫苗工程菌种所表达的戊型肝炎类病毒样颗粒电镜观察图片；
[0043]图2为实施例中重组戊型肝炎疫苗工程菌种表达产物SDS-PAGE分析结果图；
[0044]图3为为实施例中重组戊型肝炎疫苗工程菌种表达产物纯化后SDS-PAGE分析结果图；[0045]图4为重组戊型肝炎疫苗工程菌种表达产物纯化后Western blot分析结果图；
[0046]图5为实施例中重组戊型肝炎疫苗工程菌种表达产物纯化后HPLC分析图谱；
[0047]其中，图2中，I为HEV汉逊酵母工程菌种诱导前，2为HEV汉逊酵母工程菌种30L罐发酵菌体，3为HEV原核表达阳性对照，4为原核表达阴性对照，5-为HEV汉逊酵母工程菌种20ml小摇瓶诱导表达菌体，6为HEV汉逊酵母工程菌种30L罐发酵菌体破碎液，7为汉逊酵母阴性对照，8为蛋白Marker ；
[0048]图3中，I为Marker, 2、3为4FF目的蛋白峰1，4_7为DEAE洗脱目的峰；
[0049]图4中，I为Marker, 2为纯化后的HEVVLPs，3为阴性对照。
【具体实施方式】
[0050]下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例中的工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种可以按照在《生物工程学报》2007年I月第23卷第I期第73-78页论文“戊型肝炎病毒IV型0RF2蛋白在汉逊酵母中的表达”中公开的方法进行构建。
[0051]实施例1
[0052]一种重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，包括以下步骤:
[0053](I)培养发酵:将工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种按1%接种于200ml的酵母氮源培养基中，在30°C条件下进行一级培养20h，用紫外-可见分光光度法检测一级培养物吸光度值A6tltlnm为10时，将培养物移种至2L的酵母氮源培养基中在30°C条件下进行二级培养20h，用紫外-可见分光光度法检测二级培养物吸光度值A6tltol为10时，将培养物移种至甘油培养基，培养温度30°C，培养时间15h，培养体积为15L，然后以终浓度1%的速度流加甲醇进行诱导培养80h，收集发酵后的培养物；
`[0054](2)对步骤(1)中收集的发酵后的培养物先后进行细胞破碎、澄清和超滤、硅胶吸附、超滤浓缩换液、色谱纯化和脱盐，除菌过滤，制得纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒。
[0055]细胞破碎:将收集的发酵后的培养物以4500转/min的转速在2 °C进行离心20min,离心沉淀后的酵母细胞中加入PB缓冲液，使细胞浓度为50%，充分混匀后再以同样条件离心取沉淀，离心沉淀中加入细胞破碎液，使细胞浓度为30%，再加入细胞破碎液体积的1%的Tween-80,0.1M/L的NaCl，用玻璃珠研磨法破碎，在破碎液中加入其体积4%的浓度为1%的PMSF溶液，1M/L的NaOH调节PH值为8.0，以7000转/min的转速离心50min去除沉淀得上清液；
[0056]澄清和超滤:将上清液通过0.65 μ m中空纤维柱进行澄清处理细胞碎片，用PH为8.0的PB缓冲液冲洗9倍上清液体积，收集膜下透过溶液，将透过液通过0.2 μ m中空纤维柱进行超滤浓缩，用PH为8.0的PB缓冲液冲洗5倍透过液体积，收集膜上液保存；
[0057]硅胶吸附:于膜上液中加入上清液体积的40-50%的浓度为7.5%硅胶溶液，在2V下搅拌吸附IOh,再在2°C以4000转/min的转速离心20min去除上清液；在沉淀中加入原上清液体积44%的硅胶洗脱液，IL含有含四硼酸钠3.814g、EDTA0.742g、脱氧胆酸钠2.5g，于57°C搅拌90min,然后以4000转/min的转速离心15min去除沉淀,上清液中加入1/11硅胶洗脱液体积浓度为4M/L的NaCl混匀，在2°C下静置30min，以7000转/min转速离心IOmin,去除沉淀,收集上清液；[0058]超滤浓缩换液:将经硅胶吸附操作后得到的上清液过750K中空纤维柱，PB缓冲液清洗5倍上清液体积，膜上保留溶液浓缩至蛋白浓度2mg/ml，收集保留浓缩溶液；
[0059]色谱纯化:对保留浓缩溶液采用色谱介质为S印harose4FF进行纯化，以2%个柱床体积上样，流速为20ml/min，洗脱液浓度为0.003mol/LPH值为8.0的PBS，监测波长280nm，收集第I个洗脱峰；采用色谱介质为DEAE Sepharose ；以3%个柱床体积上样,流速为3ml/min，洗脱液为体积比为1:0.8的PB与氯化钠的混合液，PB的浓度为50mmol/L，氯化钠的浓度为0.5mol/L,监测波长280nm，收集吸光度值A28tol大于0.5的洗脱峰；
[0060]脱盐:采用柱色谱法脱盐，色谱介质为S印harose4FF，以4%个柱床体积上样，流速为20ml/min，洗脱液为浓度为0.003mol/LPH为7.0的PBS，监测波长280nm，收集A28tol从0.5至0.3的洗脱峰； [0061]纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的检测:
[0062]电镜观察:取少量重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒原液滴于铜网，2%磷钨酸负染3min,室温下干燥4min,样品置于透射电子显微镜(H-7000FA)下观察。
[0063]ELISA检测:以双抗体夹心ELISA法进行检测，具体步骤如下:4°C包被戊型肝炎病毒单克隆抗体过夜；0.5%牛血清白蛋白37°C封闭Ih ;加入梯度倍比稀释的细胞破碎上清液(设阳性、阴性、空白对照)37°C孵育Ih ;再加入抗戊型肝炎病毒0RF2羊多克隆抗体37°C孵育Ih ;然后加入HRP标记的兔抗羊IgG，37°C孵育Ih ;加入I % TMB显色液显色lOmin，2mol / L硫酸终止反应，在酶标分析仪上测定ELISA反应各孔OD45tol值，P/N ^ 2.1，判断为阳性，且A
450nm ^ ?.丄。
[0064]SDS-PAGE检测(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳):配制12 %分离胶，6 %浓缩胶，样品经NaOH、SDS Buffer处理，4uL上样，同时点样阳性对照和阴性对照，在恒流下，12mA20min,24mAl.5h，电泳完毕，取下胶，考马斯亮蓝染色，凝胶成像系统扫描分析目的蛋白的表达量。
[0065]Westernblot鉴定:SDS_PAGE胶电转移至PVDF膜，以160mA的恒定电流转移2h ；封闭:将转移后的PVDF膜置封闭液PBST中37°C封闭过夜；结合:加入羊抗HEV多克隆抗体(1:500)作为第一抗体，与PVDF膜37°C结合2h，然后加入HRP标记的兔抗羊IgG (1:1000)第二抗体，37°C作用Ih ；OPD显色直至出现清晰条带，去离子水终止反应。
[0066]一种上述重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒制备疫苗的应用，包括以下步骤:
[0067]在纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒中加入经除菌的氢氧化铝溶液，摇匀吸附，制得戊型肝炎病毒疫苗半成品；所述的氢氧化铝溶液的浓度优选l.0mg/ml，所述的戊型肝炎病毒疫苗半成品中铝离子的浓度0.5mg/ml。
[0068]实施例2
[0069]一种重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，包括以下步骤:
[0070](I)培养发酵:将工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种按1%接种于200ml的酵母氮源培养基中，在33°C条件下进行一级培养20h，用紫外-可见分光光度法检测一级培养物吸光度值A6tltlnm为20时，将培养物移种至2L的酵母氮源培养基中在33°C条件下进行二级培养20h，用紫外-可见分光光度法检测二级培养物吸光度值A6tltol为18时，将培养物移种至甘油培养基，培养温度30°C，培养时间15h，培养体积为25L，然后以终浓度1%的速度流加甲醇进行诱导培养75h，收集发酵后的培养物；
[0071](2)对步骤(1)中收集的发酵后的培养物先后进行细胞破碎、澄清和超滤、硅胶吸附、超滤浓缩换液、色谱纯化和脱盐，除菌过滤，制得纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒。
[0072]细胞破碎:将收集的发酵后的培养物以4500转/min的转速在8 °C进行离心20min,离心沉淀后的酵母细胞中加入PB缓冲液，使细胞浓度为50%，充分混匀后再以同样条件离心取沉淀，离心沉淀中加入细胞破碎液，使细胞浓度为30%，再加入细胞破碎液体积的1%的Tween-80,0.1M/L的NaCl，用玻璃珠研磨法破碎，在破碎液中加入其体积4%的浓度为1%的PMSF溶液，1M/L的NaOH调节PH值为8.0，以7000转/min的转速离心50min去除沉淀得上清液；
[0073]澄清和超滤:将上清液通过0.65 μ m中空纤维柱进行澄清处理细胞碎片，用PH为8.0的PB缓冲液冲洗10倍上清液体积，收集膜下透过溶液，将透过液通过0.2 μ m中空纤维柱进行超滤浓缩，用PH为8.0的PB缓冲液冲洗6倍透过液体积，收集膜上液保存；
[0074]硅胶吸附:于膜上液中加入上清液体积的40-50%的浓度为7.5%硅胶溶液，在8°C下搅拌吸附16h,再在8°C以4000转/min的转速离心20min去除上清液；在沉淀中加入原上清液体积44%的硅胶洗脱液，IL含有含四硼酸钠3.814g、EDTA0.742g、脱氧胆酸钠2.5g，于57°C搅拌90min,然后以4000转/min的转速离心15min去除沉淀,上清液中加入1/11硅胶洗脱液体积浓度为4M/L的NaCl混匀，在8°C下静置30min，以7000转/min转速离心IOmin,去除沉淀,收集上清液；
[0075]超滤浓缩换液:将经硅胶吸附操作后得到的上清液过750K中空纤维柱，PB缓冲液清洗6倍上清液体积，膜上保留溶液浓缩至蛋白浓度3mg/ml，收集保留浓缩溶液。
[0076]色谱纯化:对保留浓 缩溶液采用色谱介质为Sepharose4FF进行纯化，以3%个柱床体积上样，流速为20ml/min，洗脱液为浓度为0.003mol/LPH值为8.0的PBS，监测波长280nm,收集A28tlnm第I个洗脱峰；采用色谱介质为DEAE Sepharose ；以3%个柱床体积上样，流速为3ml/min，洗脱液为体积比为1:2.5，的PB与氯化钠的混合液，PB的浓度为50mmol/L，氯化钠的浓度为0.5mol/L,监测波长280nm，收集吸光度值A28tol大于0.5的洗脱峰；
[0077]脱盐:采用柱色谱法脱盐，色谱介质为S印harose4FF，以8%个柱床体积上样，流速为20ml/min，洗脱液为浓度为0.003mol/LPH为7.0的PBS，监测波长280nm，收集A28tol从
0.5至0.3的洗脱峰。
[0078]纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的检测:
[0079]电镜观察:取少量重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒原液滴于铜网，2%磷钨酸负染3min,室温下干燥4min,样品置于透射电子显微镜(H-7000FA)下观察。
[0080]ELISA检测:以双抗体夹心ELISA法进行检测，具体步骤如下:4°C包被戊型肝炎病毒单克隆抗体过夜；0.5%牛血清白蛋白37°C封闭Ih ;加入梯度倍比稀释的细胞破碎上清液(设阳性、阴性、空白对照)37°C孵育Ih ;再加入抗戊型肝炎病毒0RF2羊多克隆抗体37°C孵育Ih ;然后加入HRP标记的兔抗羊IgG，37°C孵育Ih ;加入I % TMB显色液显色lOmin，2mol / L硫酸终止反应，在酶标分析仪上测定ELISA反应各孔OD45tol值，P/N ^ 2.1，判断为阳性，且A
450nm ^ ?.丄。
[0081]SDS-PAGE检测(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳):配制12 %分离胶，6 %浓缩胶，样品经NaOH、SDS Buffer处理，4uL上样，同时点样阳性对照和阴性对照，在恒流下，12mA20min,24mAl.5h，电泳完毕，取下胶，考马斯亮蓝染色，凝胶成像系统扫描分析目的蛋白的表达量。[0082]Western blot鉴定:SDS_PAGE胶电转移至PVDF膜，以160mA的恒定电流转移2h ；封闭:将转移后的PVDF膜置封闭液PBST中37°C封闭过夜；结合:加入羊抗HEV多克隆抗体(1:500)作为第一抗体，与PVDF膜37°C结合2h，然后加入HRP标记的兔抗羊IgG (1:1000)第二抗体，37°C作用Ih ；0PD显色直至出现清晰条带，去离子水终止反应。
[0083]一种上述重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒制备疫苗的应用，包括以下步骤:
[0084]在纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒中加入经除菌的氢氧化铝溶液，摇匀吸附，制得戊型肝炎病毒疫苗半成品；所述的氢氧化铝溶液的浓度优选1.0mg/ml，所述的戊型肝炎病毒疫苗半成品中铝离子的浓度0.5mg/ml。
[0085]实施例3
[0086]一种重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，包括以下步骤:
[0087](I)培养发酵:将工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种种按1%接种于200ml的酵母氮源培养基中，在31.5°C条件下进行一级培养20h，用紫外-可见分光光度法检测一级培养物吸光度值A6tltlnmS 15时，将培养物移种至2L的酵母氮源培养基中在31.5°C条件下进行二级培养20h，用紫外-可见分光光度法检测二级培养物吸光度值A6tltol为15时，将培养物移种至甘油培养基，培养温度30°C，培养时间15h，培养体积为20L，然后以终浓度1%的速度流加甲醇进行诱导培养78h，收集发酵后的培养物；
[0088](2)对步骤(1)中收集的发酵后的培养物先后进行细胞破碎、澄清和超滤、硅胶吸附、超滤浓缩换液、色谱纯化和脱盐，除菌过滤，制得纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒。
[0089]细胞破碎:将收集的发酵后的培养物以4500转/min的转速在5 °C进行离心20min,离心沉淀后的酵母细胞中加入PB缓冲液，使细胞浓度为50%，充分混匀后再以同样条件离心取沉淀，离心沉淀中加入细胞破碎液，使细胞浓度为30%，再加入细胞破碎液体积的1%的Tween-80,0.1M/L的NaCl，用玻璃珠研磨法破碎，在破碎液中加入其体积4%的浓度为1%的PMSF溶液，1M/L的NaOH调节PH值为8.0，以7000转/min的转速离心50min去除沉淀得上清液；
[0090]澄清和超滤:将上清液通过0.65 μ m中空纤维柱进行澄清处理细胞碎片，用PH为
8.0的PB缓冲液冲洗9.5倍上清液体积，收集膜下透过溶液，将透过液通过0.2 μ m中空纤维柱进行超滤浓缩，用PH为8.0的PB缓冲液冲洗5.5倍透过液体积，收集膜上液保存；
[0091]硅胶吸附:于膜上液中加入上清液体积的40-50%的浓度为7.5%硅胶溶液，在5°C下搅拌吸附13h,再在5°C以4000转/min的转速离心20min去除上清液；在沉淀中加入原上清液体积44%的硅胶洗脱液，IL含有含四硼酸钠3.814g、EDTA0.742g、脱氧胆酸钠2.5g，于57°C搅拌90min,然后以4000转/min的转速离心15min去除沉淀，上清液中加入1/11硅胶洗脱液体积浓度为4M/L的NaCl混匀，在5°C下静置30min，以7000转/min转速离心lOmin，去除沉淀，收集上清液；超滤浓缩换液:将经硅胶吸附操作后得到的上清液过750K中空纤维柱，PB缓冲液清洗6倍上清液体积，膜上保留溶液浓缩至蛋白浓度2.5mg/ml，收集保留浓缩溶液；
[0092] 色谱纯化:对保留浓缩溶液采用色谱介质为Sepharose4FF进行纯化，以3%个柱床体积上样，流速为20ml/min，洗脱液为浓度为0.003mol/LPH值为8.0的PBS，监测波长280nm,收集A28tlnm第I个洗脱峰；采用色谱介质为DEAE Sepharose ；以3%个柱床体积上样，流速为3ml/min，洗脱液为体积比为1:1.5的PB与氯化钠的混合液，PB的浓度为50mmol/L，氯化钠的浓度为0.5mol/L,监测波长280nm，收集吸光度值A28tol大于0.5的洗脱峰；
[0093]脱盐:采用柱色谱法脱盐，色谱介质为S印harose4FF，以5%个柱床体积上样，流速为20ml/min，洗脱液为浓度为0.003mol/LPH为7.0的PBS，监测波长280nm，收集A28tol从
0.5至0.3的洗脱峰；
[0094]纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的检测:
[0095]电镜观察:取少量重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒原液滴于铜网，2%磷钨酸负染3min,室温下干燥4min,样品置于透射电子显微镜(H-7000FA)下观察。
[0096]ELISA检测:以双抗体夹心ELISA法进行检测，具体步骤如下:4°C包被戊型肝炎病毒单克隆抗体过夜；0.5%牛血清白蛋白37°C封闭Ih ;加入梯度倍比稀释的细胞破碎上清液(设阳性、阴性、空白对照)37°C孵育Ih ;再加入抗戊型肝炎病毒0RF2羊多克隆抗体37°C孵育Ih ;然后加入HRP标记的兔抗羊IgG，37°C孵育Ih ;加入1% TMB显色液显色lOmin，2mol / L硫酸终止反应，在酶标分析仪上测定ELISA反应各孔OD45tol值，P/N3 2.1，判断为阳性，且A450nm ≥0.1
[0097]SDS-PAGE检测(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳):配制12 %分离胶，6 %浓缩胶，样品经NaOH、SDS Buffer处理，4uL上样，同时点样阳性对照和阴性对照，在恒流下，12mA20min,24mAl.5h，电泳完毕，取下胶，考马斯亮蓝染色，凝胶成像系统扫描分析目的蛋白的表达量。
[0098]Westernblot鉴定:SDS_PAGE胶电转移至PVDF膜，以160mA的恒定电流转移2h ；封闭:将转移后的PVDF膜置封闭液PBST中37°C封闭过夜；结合:加入羊抗HEV多克隆抗体(1:500)作为第一抗体，与PVDF膜37°C结合2h，然后加入HRP标记的兔抗羊IgG (1:1000)第二抗体，37°C作用Ih ；OPD显色直至出现清晰条带，去离子水终止反应。
[0099]一种上述重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒制备疫苗的应用，包括以下步骤:
[0100]在纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒中加入经除菌的氢氧化铝溶液，摇匀吸附，制得戊型肝炎病毒疫苗半成品；所述的氢氧化铝溶液的浓度优选l.0mg/ml，所述的戊型肝炎病毒疫苗半成品中铝离子的浓度0.5mg/ml。
[0101]对实施例1中的纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒进行检测，检测结果如下:
[0102]电镜观察:取少量重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒原液滴于铜网，2%磷钨酸负染3min，室温下干燥4min，样品置于透射电子显微镜(H-7000FA)下观察，观察结果见附图1o
[0103]ELISA检测:以双抗体夹心ELISA法进行检测，具体步骤如下:4°C包被戊型肝炎病毒单克隆抗体过夜；0.5%牛血清白蛋白37°C封闭Ih ;加入梯度倍稀释的细胞破碎上清液(设阳性、阴性、空白对照)37°C孵育Ih;再加入抗戊型肝炎病毒0RF2羊多克隆抗体37°C孵育Ih ;然后加入HRP标记的兔抗羊IgG，37°C孵育Ih ;加入I % TMB显色液显色lOmin，2mol / L硫酸终止反应，在酶标分析仪上测定ELISA反应各孔OD45tol值，P/N > 2.1，判断为阳性，且A45tlnm ^ 0.1，抗原的最高稀释度为目的蛋白的效价，检测结果见表1。
[0104]SDS-PAGE检测(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳):配制12 %分离胶，6 %浓缩胶，样品经NaOH、SDS Buffer处理，4uL上样，同时点样阳性对照和阴性对照，在恒流下，12mA20min,24mAl.5h，电泳完毕，取下胶，考马斯亮蓝染色，凝胶成像系统扫描分析目的蛋白的表达量，重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的表达的蛋白分子量约为55kD，SDS-PAGE检测结果见附图2和附图3。
[0105]Western blot鉴定:SDS_PAGE胶电转移至PVDF膜，以160mA的恒定电流转移2h ；封闭:将转移后的PVDF膜置封闭液PBST中37°C封闭过夜；结合:加入羊抗HEV多克隆抗体(1:500)作为第一抗体，与PVDF膜37°C结合2h，然后加入HRP标记的兔抗羊IgG (1:1000)第二抗体，37°C作用Ih ;0PD显色直至出现清晰条带,去离子水终止反应，Western blot鉴定见附图4。
[0106]实施例中重组戊型肝炎疫苗工程菌种表达产物纯化后HPLC分析结果见附图5及表2，表2是对附图5中比例的说明。
[0107]表1
【权利要求】
1.一种重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)将工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种进行培养发酵，收集发酵后的培养物；(2)对步骤(1)中收集的发酵后的培养物先后进行细胞破碎、澄清和超滤、硅胶吸附、超滤浓缩换液、色谱纯化和脱盐，除菌过滤，制得纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒。
2.根据权利要求1所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的培养发酵的具体方法为:将工作种子批重组戊型肝炎疫苗工程菌种按1%接种于200ml的酵母氮源培养基中，进行一级培养，当用紫外-可见分光光度法检测一级培养物吸光度值A6tltlnm为10-20时，将培养物移种至2L的酵母氮源培养基中，当用紫外-可见分光光度法检测二级培养物吸光度值A6tltlnm为10-18时，将培养物移种至甘油培养基中进行培养发酵，甲醇诱导表达，收集发酵后的培养物； 优选的，所述的一级培养的温度为30-33°C，培养时间为20h ； 优选的，所述的二级培养的温度为30-33°C，培养时间为20h ； 优选的，在甘油培养基中的培养温度为30°C，培养时间为13-15h，培养体积为15-25L，然后以终浓度1%的速度流加甲醇进行诱导培养75-80h。
3.根据权利要求1所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，所述的细胞破碎的具体方法为:将收集的发酵后的培养物以4500转/min的转速进行离心20min，离心沉淀后的酵母细胞中加入PB缓冲液，使细胞浓度为50%，充分混匀后再以同样条件离心取沉淀，离心沉淀 中加入细胞破碎液，使细胞浓度为30%，再加入细胞破碎液体积的1%的Tween-80，0.1M/L的NaCl，用玻璃珠研磨法破碎，在破碎液中加入其体积4%的浓度为1%的PMSF溶液，1M/L的NaOH调节PH值为8.0，以7000转/min的转速离心40_50min去除沉淀得上清液；离心温度优选2-8°C。
4.根据权利要求1所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，所述的澄清和超滤的具体方法为:将上清液通过0.65 μ m中空纤维柱进行澄清处理细胞碎片，用PB缓冲液冲洗9-10倍上清液体积，收集膜下透过溶液，将透过液通过0.2 μ m中空纤维柱进行超滤浓缩，用PB缓冲液冲洗5-6倍透过液体积，收集膜上液保存；所述的PB缓冲液PH值优选8.0。
5.根据权利要求1所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，所述的硅胶吸附的具体方法为:于膜上液中加入硅胶溶液，搅拌吸附，再以4000转/min的转速离心20min去除上清液；在沉淀中加入原上清液体积44%的硅胶洗脱液，于57°C搅拌90min,然后以4000转/min的转速离心15min去除沉淀,上清液中加入氯化钠混匀，静置，以7000转/min转速离心lOmin，去除沉淀，收集上清液； 优选的，所述的硅胶溶液的浓度为7.5%，硅胶溶液的加入体积为上清液体积的40-50% ； 优选的，所述搅拌吸附温度为2-8°C，搅拌吸附时间为10-16h，所述的离心温度为2-8 0C ； 优选的，所述的氯化钠的体积为1/11硅胶洗脱液体积，氯化钠的浓度为4M/L ； 优选的，所述的静置温度为2-8°C，静置时间为30min。
6.根据权利要求5所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，所述的硅胶洗脱液由包括以下质量体积浓度的组分组成:四硼酸钠 3.814g/L， EDTA0.742g/L, 脱氧胆酸钠2.5g/L。
7.根据权利要求1所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，所述的超滤浓缩换液的具体方法为:将经硅胶吸附操作后得到的上清液过750K中空纤维柱，PB缓冲液清洗5-6倍上清液体积，膜上保留溶液浓缩至蛋白浓度2mg/ml-3mg/ml，收集保留浓缩溶液。
8.根据权利要求1所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，所述的色谱纯化的具体方法为:对保留浓缩溶液采用色谱介质为Sephar0Se4FF进行纯化，上样，流速为20ml/min，洗脱液为PBS，监测波长280nm，收集A28tlnm第I个洗脱峰；采用色谱介质为DEAE Sepharose ;上样,流速为2-3ml/min,洗脱液为PB与氯化钠的混合液,监测波长280nm，收集吸光度值A28tlnm大于0.5的洗脱峰； 优选的，所述的上样的体积为2%-3%个柱床体积，所述的PBS的浓度为0.003mol/L, PBS的PH值为8.0 ; 优选的，所述的PB的浓度为50mmol/L，所述的氯化钠浓度为0.5mol/L ;进一步优选的，所述的PB与氯化钠的体积比为1: (0.8-2.5)。
9.根据权利要求1所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法，所述的脱盐的具体方法为:采用柱色谱法脱盐，色谱介质为Sepharose4FF,上样,流速为20ml/min,洗脱液为PBS，监测波长280nm，收集A28tol从0.5至0.3的洗脱峰； 优选的，所述的上样的体积为4%-8%个柱床体积，所述的PBS的浓度为0.003mol/L, PBS的PH为7.0。
10.一种采用如权利要求1-9任一所述的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的制备疫苗的应用，其特征在于，包括以下步骤:在纯化的重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒中加入经除菌的氢氧化铝溶液，摇匀吸附，制得戊型肝炎病毒疫苗半成品；所述的氢氧化铝溶液的浓度优选1.0mg/ml，所述的戊型肝炎病毒疫苗半成品中铝离子的浓度0.5mg/ml。
【文档编号】A61P31/14GK103740656SQ201410029495
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】苏彩霞, 李逦, 金贞姬, 韩旭东, 王琳, 王文雯, 徐德启 申请人:大连汉信生物制药有限公司